Beschaffung hochwertiger Transkriptomdaten von Getreidesamen durch eine modifizierte Methode zur Genexpressionsprofilierung
21. Mai 2020
Es wird eine Methode zur Transkription von Getreideprofilen vorgestellt. Das mikroarraybasierte Genexpressionsprofiling beginnt mit der Isolierung hochwertiger Gesamt-RNA aus Getreidekörnern und setzt sich mit der Generierung von cDNA fort. Nach cRNA-Kennzeichnung und Mikroarray-Hybridisierung werden Empfehlungen zur Signalerkennung und Qualitätskontrolle gegeben.
Diese Mikroarray-Hybridisierungsmethode ist nützlich, um eine große Anzahl von Proben aus einem Organismus mit einem bekannten Genom zu vergleichen. Im Vergleich zu einem Ansatz mit hohem Durchsatz sequenziert, ist die mit dieser Methode generierte Datenmenge viel einfacher zu handhaben und kann weiter kostengünstiger analysiert werden. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Christiane Seiler, einer Postdoktorandin, die in der Forschungsgruppe Rosis am IPK in Gatersleben arbeitet.
Vor der Mikroarray-Hybridisierung mit dem Genexpressions-Hybridisierungskit, bereiten Sie 10X Blockierungsmittel nach Herstellerspezifikationen und aliquotieren die resultierenden Blockierungsmittel in 200 Mikroliter Volumen. Speichern Sie dann den Blockierungsmittel bei minus 20 Grad Celsius, bis es verwendet wird. Am Tag der Mikroarray-Hybridisierung einen 200-Mikroliter-Aliquot des 10-fach-Blockiermittels auf Eis auftauen und den Hybridisierungsofen auf 65 Grad Celsius und einen Wärmeblock auf 60 Grad Celsius vorwärmen.
Bereiten Sie die Fragmentierungsmischung für jede vom Hersteller beschriebene Probe vor und mischen Sie die Proben vorsichtig auf einem Wirbel. Nach dem Wirbeln die Proben in einer Mikrozentrifuge kurz verdrehen, bevor Sie genau 30 Minuten im 60 Grad Celsius-Wärmeblock inkubieren. Am Ende der Inkubation, kühlen Sie sofort jede Röhre auf Eis für eine Minute, bevor Sie die Fragmentierung mit 25 Mikroliter n2X Genexpression Hybridisierungpuffer, hohe Umdrehungen pro Minute pro Röhre stoppen.
Mischen Sie mit sanften Pipettieren, mit großer Sorgfalt, um keine Blasen einzuführen, und Zentrifugieren Sie die Rohre in der Umgebungsraumtemperatur. Am Ende der Drehung sofort alle Rohre auf Eis legen und jede Probe so schnell wie möglich in den Mikroarrayschlitten laden. Als nächstes geben Sie langsam 44 Mikroliter jeder Hybridisierungsmischung in die Mitte jeder Dichtung gut, wobei darauf zu achten ist, blasen zu vermeiden, und fügen Sie 44 Mikroliter Hybridisierungspuffer in alle ungenutzten Brunnen.
Legen Sie den Mikroarrayschlitten sofort in die richtige Ausrichtung auf die Dichtungsrutsche, achten Sie darauf, keine Flüssigkeit zu verschütten, und schließen Sie die Hybridisierungsbaugruppe fest. Drehen Sie die Baugruppe, um das Fehlen stationärer Luftblasen zu bestätigen, und legen Sie die Hybridisierungskammer-Baugruppe in den Hybridisierungsofenrotator. Stellen Sie die Drehzahl auf 10 Umdrehungen pro Minute ein, und starten Sie die Hybridisierung bei 65 Grad Celsius für genau 17 Stunden.
Während die Proben hybridisieren, bereiten Sie drei Waschschalensätze in den entsprechenden Waschpuffern vor, wie in den Tabellen beschrieben. Zerlegen Sie nach genau 17 Stunden Hybridisierung eine Hybridisierungskammer auf einer mit fusselfreiem Papier ausgekleideten Laborbank und übertragen Sie ein Mikroarray-Sandwich auf eine Schüssel mit Waschpuffer eins mit dem Mikroarray-Barcode, der in schräger Position nach oben gerichtet ist, ohne den gesamten Schlitten in den Puffer zu tauchen. Mit Zangen trennen Sie die beiden Glasgleiter und lassen Sie die Dichtung sanft in den Boden der Schale gleiten, während Sie den Mikroarray-Schlitten fest im Griff haben.
Heben Sie die Mikroarray-Rutsche langsam seitlich an, um sie in Schale zwei mit einer minimalen Lufteinwirkung in das Mikroarray-Rack zu übertragen. Wenn alle acht Dias gleichmäßig am Rack platziert sind, befestigen Sie den Rackhalter und übertragen Sie die gesamte Schale zwei Setup auf den Magnetrührer. Rühren Sie das Setup genau eine Minute lang vorsichtig.
Während die Proben gerührt werden, übertragen Sie Die schale drei aus dem 37 Grad Celsius Inkubator auf einen zweiten Magnetrührer. Dann sanft 37 Grad Celsius Waschpuffer zwei zu Schale drei hinzufügen, ohne Blasen zu bilden. Am Ende der Rührinkubation das Schiebegestell vorsichtig und langsam auf Schale drei übertragen und den Rackhalter entfernen.
Nach dem Rühren für genau eine Minute, langsam und vorsichtig entfernen Sie das Schiebegestell von der Schale und verwenden Fussel freies Papier, um sorgfältig beide Seiten jeder Rutsche zu trocknen, indem Sie jede Rutsche in eine Schiebebox legen, wie es getrocknet wird. Nachdem Die Dias 15 Minuten trocknen können, übertragen Sie jedes Mikroarray-Dia in einen Diahalter mit dem Barcode nach oben und laden Sie die montierten Diahalter in ein Scankarussell und sequenzieren Sie entsprechend der Barcode-Nummer. Scannen Sie dann sofort die Dias.
In dieser Abbildung wird ein repräsentatives Ergebnis aus einem Lauf zur Prüfung der Qualität der RNA-Extraktion gezeigt. In typischen Analysen von Proben mit niedrigem Stärkegehalt, wie Gerstenblättern, sind zusätzliche ribosomale RNA-Bänder aus Chloroplasten zu erkennen. Proben mit hohem Stärkegehalt, wie Gerstenkerne, weisen 18 und 28S ribosomale RNA auf.
Beachten Sie, dass kein automatisierter RNA-Integritätsnummernwert für grüne Pflanzengewebe wie Blattproben aufgrund der ribosomalen Chloroplasten-RNA berechnet werden kann. In dieser repräsentativen Analyse wurde eine RNA-Vorbereitung und Hybridisierung zu einem kundenspezifischen Gersten-Mikroarray-Chip durchgeführt, wie gezeigt. Das Raster zeigt ein Beispiel für abgeleitete Signale aus jeder Ecke des Chips, einschließlich Hintergrund und Spitze in Auslesepunkten, die für die Kalibrierung verwendet werden.
Das Histogramm zeigt die Abweichung von nachweisbaren Punkten mit den jeweiligen Signalintensitäten an. Wie beobachtet, ergibt eine erfolgreiche Hybridisierung eine breite Gaußsche-förmige Kurve mit nur kleinen Ausreißern. Hier ist der Qualitätskontrollbericht für erkannte Signale zu sehen.
Die Werte für die hybridisierte Folie werden in Spalte 2 angegeben, und der Bereich der akzeptablen Werte wird in Spalte 4 angezeigt. Diese Methode kann verwendet werden, um alle Versuchssysteme für jeden Organismus zu adressieren, für den wesentliche Informationen über das Genom verfügbar sind. Mit dieser Technik in unserem Labor ermöglichten es uns, transkriptomische Veränderungen in Reis und Gerste zu vergleichen und zu analysieren, die nach der Wachstumsstressinduktion auftreten.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Microarray-basierte Methode zur Transkriptom-Profilierung von Getreidearten vor, wobei der Schwerpunkt auf der Isolierung von hochwertiger RNA und der anschließenden cDNA-Generierung liegt. Das Verfahren beinhaltet detaillierte Empfehlungen zur Signal-Detektion und Qualitätskontrolle während der Microarray-Hybridisierung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Pflanzenbiologie
- Genexpressionsanalyse
Hintergrund
- Die Microarray-Hybridisierung ermöglicht den Vergleich mehrerer Proben von Organismen mit bekannten Genomen.
- Diese Methode ist im Vergleich zur Hochdurchsatzsequenzierung handhabbarer und kosteneffizienter.
- Sie eignet sich besonders zur Analyse transkriptomischer Veränderungen in Getreidearten wie Reis und Gerste.
- Maßnahmen zur Qualitätskontrolle sind entscheidend, um zuverlässige Ergebnisse sicherzustellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer robusten Methode zur Transkriptom-Profilierung in Getreidekörnern.
- Vorlage eines detaillierten Protokolls zur RNA-Isolierung und Mikroarray-Hybridisierung.
- Erleichterung der Analyse von Genexpressionsänderungen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Gesamt-RNA aus Getreidekörnern.
- cDNA-Erzeugung und cRNA-Markierung.
- Microarray-Hybridisierung mit spezifischen Protokollen zur Probenvorbereitung.
- Qualitätskontrollanalysen während und nach der Hybridisierung.
Hauptergebnisse
- Eine erfolgreiche Hybridisierung ergibt eine breite, gaußförmige Kurve in der Signalintensität.
- Qualitätskontrollberichte zeigen akzeptable Signalbereiche für hybridisierte Objektträger an.
- Vertretende Ergebnisse demonstrieren die Qualität der RNA-Extraktion und die Wirksamkeit der Hybridisierung.
- Die Methode ermöglicht eine vergleichende Analyse transkriptomischer Veränderungen als Reaktion auf Stress.
Schlussfolgerungen
- Diese Microarray-Methode eignet sich zur Transkriptom-Profilierung bei Getreidearten.
- Sie bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Analyse der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf andere Organismen mit verfügbarer genomischer Information ausdehnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Gewinnung von Transkriptomdaten hoher Qualität aus Getreidesamen ist entscheidend für die Validierung von Zielstrukturen in der agrarischen Biotechnologie, da Stärke- und Zuckergehalt häufig die RNA-Integrität beeinträchtigen. Diese Methode ermöglicht eine zuverlässige Profilierung der Genexpression unter unterschiedlichen Entwicklungs- und Stressbedingungen und unterstützt so die mechanistische Risikominimierung für merkmalsassoziierte Zielstrukturen. Durch die Bereitstellung quantitativer, reproduzierbarer transkriptomischer Messungen stärkt sie das Vorhersagevertrauen in frühen Entdeckungsworkflows für Pflanzenzüchtungsprogramme.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung transkriptioneller Hypothesen in Getreidemodellen mit bekannten Genomen und klärt die Beteiligung von Signalwegen an der Stressantwort auf.
- Operativer Wert: Bietet standardisierte Protokolle zur RNA-Extraktion und Hybridisierung, die die Variabilität in Studien zur Target-Bindung verringern.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Identifizierung differenziell exprimierter Gene (DEGs) und genregulatorischer Netzwerke und erhöht so die Zuverlässigkeit bei der Priorisierung von Targets.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt transkriptomweite Daten, die für die Entdeckung von Biomarkern und die phänotypische Untersuchung in Modellen der Kornentwicklung geeignet sind.
- Operativer Wert: Liefert konsistente Signalintensitätsprofile mit Qualitätskontrollmetriken und ermöglicht die Reproduzierbarkeit von Assays über verschiedene Labore hinweg.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Microarray-Plattformen, die die parallele Verarbeitung mehrerer Samen-Genotypen oder Behandlungsbedingungen erlauben.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet molekulare Phänotypen in sich entwickelnden Samen mit feldrelevanten Merkmalen durch Bereitschaft für transkriptomweite Assoziationsstudien (TWAS).
- Mechanistische Ent风险minimierung: Klärt die Dynamik der Genexpression während der Keimung und unter abiotischem Stress und verringert damit die Unsicherheit bezüglich des Wirkmechanismus.
- Predictive Confidence: Ermöglicht den Vergleich transkriptomischer Veränderungen über verschiedene Bedingungen hinweg und unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen in Validierungspipelines für Merkmale.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung zum Zielgen bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen ein, insbesondere bei der Validierung von Pflanzenmerkmalen, wo genomische Ressourcen vorhanden sind.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung mittels Analyse differentiell exprimierter Gene (DEG) und Charakterisierung genetischer Netzwerke in Getreidemodellen unter Stress- oder Entwicklungsbedingungen.
- Screening: Ermöglicht vorkonfektionierte Transkriptom-Analysen mit qualitätsgeprüften cRNA-Markierungs- und Hybridisierungsergebnissen, die für vergleichende Screenings geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt Signalintensitätsdaten mit gaußscher Verteilung und Spike-in-Kontrollen, wodurch ein statistischer Vergleich der Expressionsniveaus zwischen Proben ermöglicht wird.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Identifizierung von Biomarkern und Anwendungen der transkriptomweiten Assoziationsstudie (TWAS), indem hochwertige Transkriptomdaten aus keimenden, sich entwickelnden und reifen Samen bereitgestellt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Transkriptom-Profilierung über verschiedene Getreidearten mit verfügbaren Genomsequenzen hinweg und reduziert so redundante Methodenentwicklung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem Rauschen durch RNA geringer Qualität in stärkereichen Geweben reduziert wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Verwendung von Blockiermitteln, Fragmentierungszeiten und Waschpufferprotokolle.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitalwirtschaftlichkeit, indem kostengünstige Transkriptom-Analysen im Vergleich zur Sequenzierung ermöglicht werden, insbesondere bei großen Probenmengen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem zuverlässige Expressionsdaten zur Priorisierung von Targets in Programmen zur Verbesserung der Abiotischen-Stress-Toleranz oder des Ertrags bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit RNA und Mikroarray-Techniken, um eine Degradation zu verhindern und eine ordnungsgemäße Fragmentierung sicherzustellen.
- Setzt den Zugang zu Hybridisierungsöfen, Magnetrührern, Objektträgerscannern und mit Mikroarrays kompatiblen Verbrauchsmaterialien voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Qualitätsmetriken für RNA und der Hybridisierungszeiten, um die Reproduzierbarkeit an mehreren Standorten zu gewährleisten.
- Die Anpassung an Nicht-Getreidemodelle kann eine Validierung der Effizienz der RNA-Extraktion erfordern, bedingt durch unterschiedliche Gehalte an Stärke, Zucker oder sekundären Metaboliten.
- Praktische Einschränkung: Die manuelle Handhabung der Objektträger erhöht das Risiko der Bildung von Blasen oder von Kreuzkontaminationen während der Zusammenstellung der Hybridisierung.
