Beschaffung hochwertiger Transkriptomdaten von Getreidesamen durch eine modifizierte Methode zur Genexpressionsprofilierung
May 21st, 2020
Es wird eine Methode zur Transkription von Getreideprofilen vorgestellt. Das mikroarraybasierte Genexpressionsprofiling beginnt mit der Isolierung hochwertiger Gesamt-RNA aus Getreidekörnern und setzt sich mit der Generierung von cDNA fort. Nach cRNA-Kennzeichnung und Mikroarray-Hybridisierung werden Empfehlungen zur Signalerkennung und Qualitätskontrolle gegeben.
Diese Mikroarray-Hybridisierungsmethode ist nützlich, um eine große Anzahl von Proben aus einem Organismus mit einem bekannten Genom zu vergleichen. Im Vergleich zu einem Ansatz mit hohem Durchsatz sequenziert, ist die mit dieser Methode generierte Datenmenge viel einfacher zu handhaben und kann weiter kostengünstiger analysiert werden. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Christiane Seiler, einer Postdoktorandin, die in der Forschungsgruppe Rosis am IPK in Gatersleben arbeitet.
Vor der Mikroarray-Hybridisierung mit dem Genexpressions-Hybridisierungskit, bereiten Sie 10X Blockierungsmittel nach Herstellerspezifikationen und aliquotieren die resultierenden Blockierungsmittel in 200 Mikroliter Volumen. Speichern Sie dann den Blockierungsmittel bei minus 20 Grad Celsius, bis es verwendet wird. Am Tag der Mikroarray-Hybridisierung einen 200-Mikroliter-Aliquot des 10-fach-Blockiermittels auf Eis auftauen und den Hybridisierungsofen auf 65 Grad Celsius und einen Wärmeblock auf 60 Grad Celsius vorwärmen.
Bereiten Sie die Fragmentierungsmischung für jede vom Hersteller beschriebene Probe vor und mischen Sie die Proben vorsichtig auf einem Wirbel. Nach dem Wirbeln die Proben in einer Mikrozentrifuge kurz verdrehen, bevor Sie genau 30 Minuten im 60 Grad Celsius-Wärmeblock inkubieren. Am Ende der Inkubation, kühlen Sie sofort jede Röhre auf Eis für eine Minute, bevor Sie die Fragmentierung mit 25 Mikroliter n2X Genexpression Hybridisierungpuffer, hohe Umdrehungen pro Minute pro Röhre stoppen.
Mischen Sie mit sanften Pipettieren, mit großer Sorgfalt, um keine Blasen einzuführen, und Zentrifugieren Sie die Rohre in der Umgebungsraumtemperatur. Am Ende der Drehung sofort alle Rohre auf Eis legen und jede Probe so schnell wie möglich in den Mikroarrayschlitten laden. Als nächstes geben Sie langsam 44 Mikroliter jeder Hybridisierungsmischung in die Mitte jeder Dichtung gut, wobei darauf zu achten ist, blasen zu vermeiden, und fügen Sie 44 Mikroliter Hybridisierungspuffer in alle ungenutzten Brunnen.
Legen Sie den Mikroarrayschlitten sofort in die richtige Ausrichtung auf die Dichtungsrutsche, achten Sie darauf, keine Flüssigkeit zu verschütten, und schließen Sie die Hybridisierungsbaugruppe fest. Drehen Sie die Baugruppe, um das Fehlen stationärer Luftblasen zu bestätigen, und legen Sie die Hybridisierungskammer-Baugruppe in den Hybridisierungsofenrotator. Stellen Sie die Drehzahl auf 10 Umdrehungen pro Minute ein, und starten Sie die Hybridisierung bei 65 Grad Celsius für genau 17 Stunden.
Während die Proben hybridisieren, bereiten Sie drei Waschschalensätze in den entsprechenden Waschpuffern vor, wie in den Tabellen beschrieben. Zerlegen Sie nach genau 17 Stunden Hybridisierung eine Hybridisierungskammer auf einer mit fusselfreiem Papier ausgekleideten Laborbank und übertragen Sie ein Mikroarray-Sandwich auf eine Schüssel mit Waschpuffer eins mit dem Mikroarray-Barcode, der in schräger Position nach oben gerichtet ist, ohne den gesamten Schlitten in den Puffer zu tauchen. Mit Zangen trennen Sie die beiden Glasgleiter und lassen Sie die Dichtung sanft in den Boden der Schale gleiten, während Sie den Mikroarray-Schlitten fest im Griff haben.
Heben Sie die Mikroarray-Rutsche langsam seitlich an, um sie in Schale zwei mit einer minimalen Lufteinwirkung in das Mikroarray-Rack zu übertragen. Wenn alle acht Dias gleichmäßig am Rack platziert sind, befestigen Sie den Rackhalter und übertragen Sie die gesamte Schale zwei Setup auf den Magnetrührer. Rühren Sie das Setup genau eine Minute lang vorsichtig.
Während die Proben gerührt werden, übertragen Sie Die schale drei aus dem 37 Grad Celsius Inkubator auf einen zweiten Magnetrührer. Dann sanft 37 Grad Celsius Waschpuffer zwei zu Schale drei hinzufügen, ohne Blasen zu bilden. Am Ende der Rührinkubation das Schiebegestell vorsichtig und langsam auf Schale drei übertragen und den Rackhalter entfernen.
Nach dem Rühren für genau eine Minute, langsam und vorsichtig entfernen Sie das Schiebegestell von der Schale und verwenden Fussel freies Papier, um sorgfältig beide Seiten jeder Rutsche zu trocknen, indem Sie jede Rutsche in eine Schiebebox legen, wie es getrocknet wird. Nachdem Die Dias 15 Minuten trocknen können, übertragen Sie jedes Mikroarray-Dia in einen Diahalter mit dem Barcode nach oben und laden Sie die montierten Diahalter in ein Scankarussell und sequenzieren Sie entsprechend der Barcode-Nummer. Scannen Sie dann sofort die Dias.
In dieser Abbildung wird ein repräsentatives Ergebnis aus einem Lauf zur Prüfung der Qualität der RNA-Extraktion gezeigt. In typischen Analysen von Proben mit niedrigem Stärkegehalt, wie Gerstenblättern, sind zusätzliche ribosomale RNA-Bänder aus Chloroplasten zu erkennen. Proben mit hohem Stärkegehalt, wie Gerstenkerne, weisen 18 und 28S ribosomale RNA auf.
Beachten Sie, dass kein automatisierter RNA-Integritätsnummernwert für grüne Pflanzengewebe wie Blattproben aufgrund der ribosomalen Chloroplasten-RNA berechnet werden kann. In dieser repräsentativen Analyse wurde eine RNA-Vorbereitung und Hybridisierung zu einem kundenspezifischen Gersten-Mikroarray-Chip durchgeführt, wie gezeigt. Das Raster zeigt ein Beispiel für abgeleitete Signale aus jeder Ecke des Chips, einschließlich Hintergrund und Spitze in Auslesepunkten, die für die Kalibrierung verwendet werden.
Das Histogramm zeigt die Abweichung von nachweisbaren Punkten mit den jeweiligen Signalintensitäten an. Wie beobachtet, ergibt eine erfolgreiche Hybridisierung eine breite Gaußsche-förmige Kurve mit nur kleinen Ausreißern. Hier ist der Qualitätskontrollbericht für erkannte Signale zu sehen.
Die Werte für die hybridisierte Folie werden in Spalte 2 angegeben, und der Bereich der akzeptablen Werte wird in Spalte 4 angezeigt. Diese Methode kann verwendet werden, um alle Versuchssysteme für jeden Organismus zu adressieren, für den wesentliche Informationen über das Genom verfügbar sind. Mit dieser Technik in unserem Labor ermöglichten es uns, transkriptomische Veränderungen in Reis und Gerste zu vergleichen und zu analysieren, die nach der Wachstumsstressinduktion auftreten.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine microarray-basierte Methode für die Transkriptom-Profilerstellung von Getreide vor, mit Fokus auf die Isolierung von hochwertiger RNA und anschließender cDNA-Erzeugung. Das Verfahren beinhaltet detaillierte Empfehlungen für Signaldetektion und Qualitätskontrolle während der Microarray-Hybridisierung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Pflanzenbiologie
- Genexpressionsanalyse
Hintergrund
- Microarray-Hybridisierung ermöglicht den Vergleich mehrerer Proben von Organismen mit bekannten Genomen.
- Diese Methode ist handhabbarer und kostengünstiger im Vergleich zur Hochdurchsatz-Sequenzierung.
- Sie ist besonders nützlich für die Analyse transkriptomischer Veränderungen in Getreiden wie Reis und Gerste.
- Qualitätskontrollmaßnahmen sind entscheidend für zuverlässige Ergebnisse.
Zweck der Studie
- Eine robuste Methode für die Transkriptom-Profilerstellung in Getreidekörnern zu entwickeln.
- Ein detailliertes Protokoll für RNA-Isolierung und Microarray-Hybridisierung bereitzustellen.
- Die Analyse von Genexpressionsänderungen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Isolierung von totaler RNA aus Getreidekörnern.
- cDNA-Erzeugung und cRNA-Markierung.
- Microarray-Hybridisierung mit spezifischen Protokollen für die Probenvorbereitung.
- Qualitätskontrollbewertungen während und nach der Hybridisierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Hybridisierung ergibt eine breite Gaussian-förmige Kurve in der Signalintensität.
- Qualitätskontrollberichte zeigen akzeptable Signalbereiche für hybridisierte Scheiben an.
- Repräsentative Ergebnisse demonstrieren die Qualität der RNA-Extraktion und Hybridisierungseffizienz.
- Methode ermöglicht vergleichende Analyse von transkriptomischen Veränderungen als Reaktion auf Stress.
Schlussfolgerungen
- Diese Microarray-Methode ist effektiv für die Transkriptom-Profilerstellung in Getreide.
- Sie bietet einen zuverlässigen Ansatz für die Analyse der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen.
- Zukünftige Anwendungen können sich auf andere Organismen mit verfügbarer genomischer Information erstrecken.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds is critical for target validation in agricultural biotechnology, where starch and sugar content often compromise RNA integrity. This method enables reliable gene expression profiling under varying developmental and stress conditions, supporting mechanistic de-risking of trait-associated targets. By delivering quantitative, reproducible transcriptomic measurements, it strengthens predictive confidence in early discovery workflows for crop improvement programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses in cereal models with known genomes, clarifying pathway involvement in stress response.
- Operational Value: Provides standardized RNA extraction and hybridization workflows that reduce variability in target engagement studies.
- Predictive Value: Supports identification of differentially expressed genes (DEGs) and gene regulatory networks, improving confidence in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates transcriptome-wide data suitable for biomarker discovery and phenotypic screening in grain development models.
- Operational Value: Delivers consistent signal intensity profiles with quality control metrics, enabling assay reproducibility across laboratories.
- Scalability: Compatible with microarray platforms allowing parallel processing of multiple seed genotypes or treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects molecular phenotypes in developing seeds to field-relevant traits through transcriptome-wide association study (TWAS) readiness.
- Mechanistic De-risking: Clarifies gene expression dynamics during germination and abiotic stress, reducing uncertainty in target mechanism.
- Predictive Confidence: Enables cross-condition comparison of transcriptomic changes, supporting go/no-go decisions in trait validation pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly in crop trait validation where genomic resources exist.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via DEG analysis and gene network characterization in cereal models under stress or developmental cues.
- Screening: Enables assay-ready transcriptome profiling with quality-controlled cRNA labeling and hybridization outputs suitable for comparative screening.
- Analytics: Produces signal intensity data with Gaussian distribution and spike-in controls, allowing statistical comparison of expression levels across samples.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and TWAS applications by providing high-quality transcriptome data from germinating, developing, and mature seeds.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for transcriptome profiling across cereal species with available genome sequences, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from low-quality RNA in high-starch tissues.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized blocking agent use, fragmentation timing, and wash buffer protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling cost-effective transcriptome analysis compared to sequencing, especially for large sample sets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing reliable expression data for prioritizing targets in abiotic stress tolerance or yield improvement programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and microarray techniques to prevent degradation and ensure proper fragmentation.
- Dependent on access to hybridization ovens, magnetic stirrers, slide scanners, and microarray-compatible consumables.
- Necessitates cross-team standardization of RNA quality metrics and hybridization timing for multi-site reproducibility.
- Adaptation to non-cereal models may require validation of RNA extraction efficacy due to varying starch, sugar, or secondary metabolite content.
- Practical limitation: Manual slide handling increases risk of bubble introduction or cross-contamination during hybridization assembly.
