Name: Überwachung von PD-1-Blocking-Antikörpern, die an T-Zellen gebunden sind, die aus einem Tropfen peripheren Blutsfetts abgeleitet wurden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Lernen Sie eine Durchflusszytometrie-Methode zur Evaluierung von PD-1-blockierenden Antikörpern an T-Zellen aus peripherem Blut. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung spezifischer Immunzell-Subpopulationen für die Krebsimmuntherapie.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien an S.K. von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) und der Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 und 19cm0106310) unterstützt.

Die Probenahme wurde während routinemäßiger klinischer Verfahren durchgeführt. Alle menschlichen Proben wurden nach sachkundigen Zustimmung der Probanden gemäß der Erklärung von Helsinki und mit Zustimmung des Ethik-Review-Gremiums der Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 und 752) eingeholt.
1. Vollblutprobenvorbereitung und Färbung
<ol><li>Sammeln Sie Blutproben in Blutentnahmeröhrchen, die Ethylendiamintetra-Essigsäure (EDTA) enthalten. HINWEIS: Die Blutentnahme kann entweder mit einer normalen Nadel oder einer Blutlanze durchgeführt werden.</li>
	<li>Übertragen Sie 20 l Vollblutproben auf 5 ml rund-bodenige Polystyrol-Flow-Zytometrie-Röhren. HINWEIS: Um die unspezifische Bindung von Zellen an Röhrchen zu reduzieren, werden 1 ml 2% fetales Rinderserum (FBS) in Phosphatgepufferter Saline (PBS) in Dier hinzugefügt und 10 s vor der Anwendung in Proben gewirbelt.</li>
	<li>Fügen Sie 20 l von 2% FBS in PBS hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie 10 L des humanspezifischen FcR-Blockierreagenzhinzuers hinzu. Gut mischen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 500 L roter Blutkörperchen-Lysepuffer hinzu. Gut mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 4 ml 2% FBS in PBS hinzu und drehen Sie Zellen bei 400 x g (1.500 U/min) für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie Überstand durch Aspiration.</li>
	<li>Wiederholen Sie den in Schritt 1.6 beschriebenen Wasch- und Aspirationsprozess.</li>
	<li>Die Zellen in 100 l von 2% FBS in PBS wieder aufhängen und in zwei Röhren mit je 50 l teilen.</li>
	<li>Hinzufügen von Oberflächenmarker-Antikörpern (Tabelle 1). Gut mischen und 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten. HINWEIS: Bei der Profilierung des T-Zellen-Immunstatus kann die Anzahl der Marker basierend auf der Qualität der Durchflusszytometriemaschine erhöht werden.</li>
	<li>Proben 2x waschen, wie in Schritt 1.6 beschrieben.</li>
	<li>Resuspend Zellen in 200 l von 2% FBS in PBS.</li>
</ol>2. Zytometrische Durchflussanalyse
<ol><li>Rohre in das Durchflusszytometer einstecken und Zellen erfassen, im Grunde nach dem empfohlenen Protokoll9.</li>
	<li>Zeichnen Sie 10.000 Ereignisse als Lymphozytentor auf (Abbildung 1A) und exportieren Sie Flussdaten als .fcs-Dateien für die Analyse.</li>
	<li>Öffnen Sie Dateien in der Analysesoftware. Visualisieren Sie die Zellen auf einer Vorwärtsstreuung (FSC) (A) vs. Seitenstreuung (SSC) (A) Plot und Gate Lymphozyten (Abbildung 1A).</li>
	<li>Nach auswahl einzelner Zellen mit FSC (H) vs. FSC (W) und SSC (H) vs. SSC (W) (Abbildung 1B) und Anzeige auf einem CD3 vs. CD8 oder CD3 vs. CD4 Plot, Gate die CD8 T Zellen und CD4 T Zellen, bzw. (Abbildung 1C).</li>
	<li>Nachdem Sie die gated cells ausgewählt und auf einem PD-1 vs. humanem IgG4-Plot angezeigt haben, identifizieren Sie PD-1-blockierende Antikörper-gebundene CD8- und CD4-T-Zellen basierend auf der Isotypkontrolle (Abbildung 1D).</li>
</ol>

<ol><li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy%3A+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).</li>
<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li>
<li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy%3A+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li>
<li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities%3A+a+collaborative+position+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li>
<li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112(2019).</li>
<li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125(2018).</li>
<li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li>
<li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+CD8%28%2B%29+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li>
<li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In diesem Artikel berichten wir über eine Methode, die ein Durchflusszytometer verwendet, um PD-1-blockierende Antikörper zu erkennen, die an T-Zellen gebunden sind, die aus einem Tropfen peripheren Bluts fetten Blutes abgeleitet wurden, das wir ursprünglich für den Nivolumab-Nachweis10entwickelt haben. Obwohl diese Technik sehr einfach und einfach durchzuführen ist, sollten zwei wichtige Punkte beachtet werden, um genaue Ergebnisse zu erhalten. Zum Nachweis von PD-1-Molekülen sollte ein geeignete...

PD-1-blockierende Antikörper sind zur Standardwahl für die Behandlung verschiedener Krebsarten geworden, einschließlich nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC)1,2,3,4. Sie zeigen eine bemerkenswerte therapeutische Wirkung bei einer Untergruppe von Krebspatienten, die nicht auf herkömmliche zytotoxische Chemotherapien angetreten haben. Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs), die PD-1-blockierende Antikörper enthalten, können jedoch ein einzigartiges und ausgeprägtes Spektrum unerwünschter Ereignisse verursachen, die als immunbedingte unerwünschte Ereignisse (irAEs) bezeichnet werden5. Obwohl irAEs fast alle Gewebe beeinflussen können, Werden sie am häufigsten im Magen-Darm-Trakt beobachtet. Im Allgemeinen treten die meisten IrAEs innerhalb von 1 bis 2 Monaten nach der Initiierung von ICI auf. In einigen Fällen können sie jedoch später als 1 Jahr nach Beginn der Behandlung oder sogar nach Beendigung der Behandlung auftreten6,7. Sie verursachen auch verschiedene Symptome, die schwierig sein können, von anderen Pathologien zu unterscheiden. Daher kann es schwierig sein, irAEs umgehend zu diagnostizieren und angemessen zu behandeln. irAEs können alle Gewebe beeinflussen, und ihr Beginn wird stark durch zirkulierende Immunzellen beeinflusst, insbesondere T-Zellen, die an PD-1-blockierende Antikörper gebunden sind. Daher ist eine einfache und minimalinvasive Methode zur Überwachung von Antikörper-gezielten T-Zellen im klinischen Umfeld wichtig.
Hier haben wir eine einfache Methode entwickelt, um die Bindung von PD-1-blockierenden Antikörpern an T-Zellen mit einem Tropfen peripheren Vollbluts von Krebspatienten zu bewerten, die Nivolumab oder Pembrolizumab erhielten. Mit diesem Ansatz konnten wir jedes der folgenden Elemente überwachen: 1) die Dauer der Antikörperbindung an T-Zellen, 2) die Belegung von T-Zell-PD-1-Molekülen durch therapeutische Antikörper und 3) den Aktivierungsstatus und die immunologischen Merkmale von T-Zellen. Bei dieser Methode handelt es sich um eine Modifikation einer zuvor gemeldeten Technik8. Die benötigte Blutmenge ist fast die gleiche wie für einen Glukosetest, und der Ansatz erfordert keine mononukleäre Zellanreicherung oder Ko-Kultivierung mit PD-1-blockierenden Antikörpern. Wir haben bestätigt, dass diese Methode auch mit gefrorenen Proben durchgeführt werden kann, einschließlich peripherer mononukleischer Blutzellen (PBMCs) und Zellen aus Pleuraerguss, Perikardkernerguss, Bronchoalveolader Spülflüssigkeit und Zerebrospinalflüssigkeit, was darauf hindeutet, dass diese Strategie im Rahmen einer multizentrischen Studie nützlich sein könnte. Diese Methode kann die frühdiagnose von irAEs erleichtern und auch dazu beitragen, die geeigneten immunsuppressiven Behandlungen zu bestimmen, um ihre Symptome zu kontrollieren und die optimalen Zeiten zu identifizieren, um nachfolgende Therapien nach PD-1-Hemmern zu initiieren.

<table><tbody><tr><td>10X RBC-Lysepuffer (mehrere Spezies)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4300-54</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>APC/Cyanin7 Anti-Human-CD4-Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>300518</td><td>Klon RPA-T4</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II Durchflusszytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 Anti-Human-CD8a-Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>301048</td><td>Klon RPA-T8</td></tr><tr><td>Dulbecco-Phosphat Gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Falcon Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>352058</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>FcR Blockierungsreagenz, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>2</td></tr><tr><td>mL FLOWJO</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Fetal Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12676029</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Maus IgG1 monoklonal - Isotypkontrolle</td><td>abcam</td><td>ab81200</td><td></td></tr><tr><td>Maus monoklonal Anti-Human IgG4 Fc</td><td>abcam</td><td>ab99825</td><td>Klon HP6025</td></tr><tr><td>Pacific Blue Maus Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>558117</td><td>Klon UCHT1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Maus anti-human CD279 (PD-1)</td><td>BD</td><td>561272</td><td>Klon EH12.1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Maus IgG1 & kappa; Isotyp-Regelung</td><td>BD</td><td>557646</td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung von pd-1-blocking-antikörpern, die an t-zellen gebunden sind, die aus einem tropfen peripheren blutsfetts abgeleitet wurden

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Immun-Checkpoint-Inhibitoren, einschließlich PD-1-blockierender Antikörper, haben die Behandlungsergebnisse bei verschiedenen Krebsarten deutlich verbessert. Die pharmakologische Wirksamkeit dieser Immuntherapien ist langanhaltend und erstreckt sich aufgrund anhaltender Blutkonzentrationen sogar über das Absetzen ihrer Injektionen hinaus. Hier haben wir einen einfachen Durchflusszytometrie-Assay entwickelt, um den T-Zellbindungsstatus der PD-1-blockierenden Antikörper Nivolumab und Pembrolizumab zu bewerten. Wie ein Glukosetest erfordert dieser Test nur einen einzigen Tropfen peripheren Blutes. Die Visualisierung der Antikörperbindung an T-Zellen ist zuverlässiger als die Messung von Antikörper-Blutkonzentrationen. Darüber hinaus können wir bei Bedarf möglicherweise viele ausgeprägte immunbezogene Marker auf T-Zellen analysieren, die an PD-1-blockierende Antikörper gebunden sind. Daher ist dies eine einfache und minimalinvasive Strategie, um die pharmakologische Wirkung von PD-1-blockierenden Antikörpern bei Krebspatienten zu analysieren.

Die Gating-Strategie- und Durchflusszytometrie-Analyse (Abbildung 1) kann PD-1-blockierende Antikörperbindung an T-Zellen erkennen, die aus einem Tropfen peripheren Blut von NSCLC-Patienten gewonnen werden. Bevor PD-1-blockierender Antikörper verabreicht wird, sind keine humanen IgG4-positiven CD8- oder CD4-T-Zellen vorhanden, und die PD-1-Expression kann durch einen PD-1-detektierenden Antikörper (EH12.1) bestätigt werden (Abbildung 2A). Nach V...

Wir entwickelten einen einfachen Flow-Zytometrie-Assay zur Bewertung der Bindung von PD-1-blockierenden Antikörpern an T-Zellen, der nur einen Tropfen peripheren Bluts von Krebspatienten erfordert.

Überwachung von PD-1-Blocking-Antikörpern, die an T-Zellen gebunden sind, die aus einem Tropfen peripheren Blutsfetts abgeleitet wurden

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Da diese Methode PD-1-blockierende Antikörper-gebundene Zellen mit peripherem Blut von Patienten bestimmt, kann die spezifische Teilmenge identifiziert werden, die für Antitumoreffekte und immunbedingte Nebenwirkungen verantwortlich ist. Diese Methode benötigt nur eine winzige Menge blutprobe und der Analyseprozess ist ziemlich einfach und schnell. Es braucht nur eine Durchflusszytometrie-Maschine.Zu Beginn, sammeln Vollblutproben in Blutentnahmeröhrchen mit EDTA. Behandeln Sie jeden fünf Milliliter runden unteren Polystyrol-Flow-Zytometrie-Rohr mit einem Milliliter 2%fetales Rinderserum in PBS. Wirbel für 10 Sekunden.Dann 20 Mikroliter Vollblutproben in die behandelten fünf Milliliter runden Bodenröhrchen übertragen. Fügen Sie 20 Mikroliter 2%FBS in PBS und 10 Mikroliter des humanspezifischen FC-Rezeptor-Blockierungsreagenz hinzu. Gut mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren.Als nächstes fügen Sie 500 Mikroliter roter Blutkörperchen Lyse Puffer. Gut mischen und bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren. Fügen Sie vier Milliliter 2%FBS in PBS hinzu und drehen Sie Zellen bei 400 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. Wiederholen Sie den Wasch- und Aspirationsprozess. Setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter n.F. 2%FBS in PBS wieder auf und teilen Sie sie in zwei Röhren mit jeweils 50 Mikrolitern auf.Fügen Sie Oberflächenmarker-Antikörper hinzu. Gut mischen und 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten. Waschen Sie Proben zweimal in 2%FBS in PBS wie zuvor.Setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter n.F. 2%FBS in PBS wieder aus. Setzen Sie die Rohre in das Durchflusszytometer ein und erfassen Sie Zellen nach dem empfohlenen Protokoll. Zeichnen Sie 10.000 Ereignisse als Lymphozytentor auf und exportieren Sie Flussdaten als FCS-Dateien für die Analyse.Öffnen Sie Dateien in der Analysesoftware und klicken Sie auf die Datei der Isotypsteuerung, um die Zellen auf einer Vorwärtsstreuung im Vergleich zu seitlichen Streudiagrammen und Gate-Lymphozyten zu visualisieren. Wählen Sie einzelne Zellen mit FSCH und SSCH versus SSCW aus und zeigen Sie sie auf cd3 im Vergleich zu CD8 oder CD3 im Vergleich zu CD4-Plot an. Gate die CD8 T-Zellen und CD4 T-Zellen jeweils.Wählen Sie die gated cells aus und zeigen Sie sie auf einem PD-1-Diagramm im Vergleich zum menschlichen IgG4-Diagramm an. Wählen Sie dann auf der Grundlage der Isotypkontrolle Q3 aus, um PD-1-blockierende Antikörper-gebundene CD8- und CD4-T-Zellen zu identifizieren. In dieser Studie wurde in der Gating-Strategie- und Durchflusszytometrie-Analyse eine PD-1-blockierende Antikörperbindung an T-Zellen nachgewiesen, die aus einem Tropfen peripheren Blutdesatous des Patienten gewonnen wurden.Das Diagramm PD-1 versus Human IgG4 zeigt den Bindungsstatus von PD-1-blockierenden Antikörpern auf T-Zellen. Orange Punkte und schwarze Punkte weisen auf Anti-IgG4-Antikörper bzw. Isotyp-Kontrollfärbung hin. Vor der Verabreichung von PD-1-blockierendem Antikörper waren keine humanen IgG4-positiven CD8- oder CD4-T-Zellen vorhanden und die PD-1-Expression wurde durch einen PD-1-detektierenden Antikörper bestätigt.Nach Verabreichung von Nivolumab oder Pembrolizumab kann IgG4 auf T-Zellen durch Anti-IgG4-Antikörper nachgewiesen werden, während der PD-1-Detektionsantikörper EH12.1 keine PD-1 an T-Zellen erkennt. Die roten, blauen und grünen Tore weisen auf die vollständige Bindung, Teilbindung bzw. Bindungsverlust hin. Nachdem die Patienten Nivolumab und Pembrolizumab abgesetzt haben, verringerte sich der Status der PD-1-blockierenden Antikörperbindung an CD8-T-Zellen.Es bestand eine teilweise Bindung und schließlich ein vollständiger Verlust der Bindung. Bitte stellen Sie sicher, dass die Blutprobe mit RBC-Lyse sowie mischen. Auch das Mischen der RBC-Lyse vor der Oberflächenmarkerfärbung ist der schlüsselfertige Schritt bei dieser Methode.Wenn der Forscher Zugang zu einer fortschrittlichen Durchflusszytometriemaschine hat, können PD-1-blockierende Antikörper-gebundene T-Zellen mit immer mehr Markern im Zusammenhang mit dieser Strategie für die Profilierung von T-Zell-Phänotypen angewendet werden, die für unerwünschte Ereignisse verantwortlich sind, die durch PD-1-blockierende Antikörper verursacht werden. Die Probenahme von Patienten mit entwickelten unerwünschten Ereignissen ist wichtig, um den Nutzen dieser Strategie zu bewerten.

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Medicine

Medizin

Dieses Papier beschreibt eine einfache Technik, um Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen zu induzieren. Die Technik kann klinisch angewendet werden, um nicht alloreaktive Spenderzellen zu generieren. Infusion dieser Zellen verbessern könnte Immunrekonstitution und reduzieren Toxizität nach allogener Stammzelltransplantation.

Induktion von Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen durch Alloantigen Stimulation mit Co-stimulatorische Signal Blockade

Dieses Video demonstriert eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik, bei der zwei Fluorochrome verwendet werden, um CD4+ und CD8+ T-Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK) und Monozyten in menschlichen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) zu identifizieren. Nach der Inkubation der Zellen mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen die Oberflächenmarker werden die Zelluntergruppen mit einer optimalen durchflusszytometrischen Gating-Strategie...

Ein Durchflusszytometrie-Assay zur Identifizierung von Immunzelluntergruppen in mononukleären Zellen des peripheren Blutes

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Lernen Sie eine Durchflusszytometrie-Methode zur Evaluierung von PD-1-blockierenden Antikörpern an T-Zellen aus peripherem Blut. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung spezifischer Immunzell-Subpopulationen für die Krebsimmuntherapie.

Überwachung von PD-1-Blocking-Antikörpern, die an T-Zellen gebunden sind, die aus einem Tropfen peripheren Blutsfetts abgeleitet wurden (Video) | JoVE Journal

Überwachung von PD-1-Blocking-Antikörpern, die an T-Zellen gebunden sind, die aus einem Tropfen peripheren Blutsfetts abgeleitet wurden

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