Name: Kombination von Laser Capture Microdissection und Microfluidic qPCR zur Analyse von Transkriptionsprofilen einzelner Zellen: Ein systembiologischer Ansatz zur Opioidabhängigkeit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Lernen Sie Laser Capture Microdissection und Microfluidic qPCR zur Analyse von Transkriptionsprofilen einzelner Neuronen, Mikroglia und Astrozyten aus dem Amygdala-Kerngebiet.

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Die hier vorgestellten Arbeiten wurden durch die NIH HLB U01 HL133360 an JS und RV, NIDA R21 DA036372 an JS und EVB und T32 AA-007463 an Jan Hoek zur Unterstützung von SJO'S verliehen.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Animal Care and Use Committee (IACUC) der Thomas Jefferson University und des Drexel University College of Medicine durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Thomas Jefferson University und dem Drexel University College of Medicine IACUC genehmigt.
1. Tiermodell
<ol><li>Fügen Sie zwei 75 mg langsam freisetzende Morphinsulfat-Pellets oder zwei Placebo-Pellets subkutan bei erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten ein.<ol>
<li>Verwenden Sie ein Kleid und Handschuhe entsprechend für kleinere sterile Operationen. Rasieren Sie die Ratte dorsum mit Clippers, wenn nötig.</li>
		<li>Tragen Sie die Tierarztsalbe auf die Augen des Tieres auf. Anästhetisieren Sie die Ratte mit etwa 20 s Isofluran-Inhalation. Anästhesie wird durch Bewusstseinsverlust bestätigt.</li>
		<li>Machen Sie einen Mittellinienschnitt im Rattendorsum mit perlensterilisierter stumpfer Schere und trennen Sie die Dermis mit einer perlensterilisierten Sonde von der Körperwand. Legen Sie die Pellets unter die Dermis mit Perlensterilisierten Zangen. Den Schnitt mit einer sterilen Nadel schließen. HINWEIS: Das gesamte Verfahren dauert ca. 5 min pro Ratte. Für jede Ratte werden frische sterile Handschuhe verwendet.</li>
		<li>Legen Sie die Ratte in einen Isolationskäfig für die postoperative Genesung. Überprüfen Sie einen Herzschlag und einen regelmäßigen Atemrhythmus. Beobachten Sie die Ratte, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Bewerten Sie postchirurgische Schmerzen.</li>
		<li>Bewerten Sie die Ratten 8 h Postchirurgie und alle 12 h nach für die Genesung und Infektion. Legen Sie Ratten in einen Käfig mit dem Rest der Kohorte, wenn sie vollständig von der Operation erholt sind, etwa 24 h Postchirurgie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geben Sie eine intraperitoneale Naltrexon-Injektion (75 mg/kg) an die G- und die Entzugskohorten nach 6 Tagen Morphin-Exposition. ANMERKUNG: In diesem repräsentativen Experiment gab es vier Rattenkohorten (siehe Abbildung 1).</li>
</ol>2. Probenernte
<ol><li>Ernten Sie das Gehirn 6 Tage nach dem Einsetzen der Pellet oder 24 h nach der Naltrexon-Injektion.<ol>
<li>Legen Sie das Tier in einer Isofluran-Kammer für ca. 30 s oder bis Bewusstseinsverlust auftritt, angezeigt durch Bewegungsmangel und verminderte Atemfrequenz.</li>
		<li>Verwenden Sie eine scharfe Guillotine, um das Tier schnell zu enthaupten.</li>
		<li>Sezieren Sie das Gehirn aus dem Schädel des Tieres.</li>
		<li>Verwenden Sie einen scharfen Handrasierer, um die folgenden groben Einschnitte auf das entfernte Gehirn zu machen: Schneiden Sie zuerst das Kleinhirn ab und entsorgen Sie es. Zweitens, trennen Sie das Hirnstamm vom Vorderhirn mit einem Querschnitt. Drittens, hemisect das Vorderhirn und/oder Hirnstamm mit einem Mittellinien-Sagittal-Inzission.</li>
		<li>Legen Sie das Vorderhirn und das Hirnstamm in eine Kunststoff-Gewebeeinbettungsform mit 3-4 cm optimaler Schnitttemperaturverbindung (OCT) im Boden der Form. Bedecken Sie den Rest der Probe mit OCT.</li>
		<li>Legen Sie die Kunststoff-Gewebeeinbettungsform mit der mit OCT bedeckten Probe sofort in ein Bad mit Trockeneis und Methanol. Lassen Sie das Methanol nicht in die gewebeeinbettende Form austreten. Halten Sie die Einbettungsform mit der Hirnprobe im Methanol-Eisbad, bis die Gewebesammlung abgeschlossen ist (maximal 10-15 min).</li>
		<li>Legen Sie die Hirnprobe so schnell wie möglich in einen -80 °C-Gefrierschrank.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ernten Sie die Darmproben gleichzeitig.<ol>
<li>Nach einer schnellen Enthauptung, machen Sie einen Mittellinienschnitt in den Bauch des Tieres mit einem Skalpell.</li>
		<li>Finde das Cecum und trenne seine Verbindung zum aufsteigenden Dickdarm.</li>
		<li>Drücken Sie den Cecal-Inhalt in ein 15 ml konisches Rohr.</li>
		<li>Das konische Rohr sofort auf Trockeneis legen und so schnell wie möglich in einen -80 °C-Gefrierschrank geben. HINWEIS: Der Dünndarmgehalt kann auch mit den gleichen Methoden wie eine negative Kontrolle gesammelt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Schneiden
<ol><li>Schneiden Sie den halbveränderten Rattenvorhirn mit einem Kryostat.<ol>
<li>Entfernen Sie die Kunststoff-Einbettform mit dem Vorderhirn aus dem Gefrierschrank von -80 °C und legen Sie sie in einen -20 °C-Kryostat.</li>
		<li>Entfernen Sie die OCT-eingebettete, hemisekte Vorhirnprobe aus der Einbettform. Verwenden Sie ein Rasiermesser, um die Ecken der Kunststoffeinbettform bei Bedarf vertikal zu schneiden. Montieren Sie das Vorderhirn für rostrales bis kaudales koronales Schneiden auf einem Kryostatfutter mit OCT. HINWEIS: Anatomische Sehenswürdigkeiten zur Identifizierung des CeA umfassen den Optiktrakt und die Stria terminalis (Abbildung 2B). Der Optiktrakt verzweigt sich vom optischen Chiasm und verfolgt dorsal-lateral, da das Gehirn rostral bis kaudal geschnitten wird. Wenn der Optiktrakt eine Morphologie hat, die dem ähnelt, was in einem Rattenhirnatlas -2,12 mm10zu sehen ist, können Testscheiben unter dem Mikroskop betrachtet werden. Der Optiktrakt und die Stria terminalis Morphologie können in einem Rattenhirnatlas10 überprüft werden, um das Bregmäat zu identifizieren und festzustellen, ob das CeA die Stria-Terminals umgibt.</li>
		<li>Schneiden Sie 10 'm dicke koronale Abschnitte von der halbherzigen Vorhirnrostral bis kaudal, bis Abschnitte, die das CeA enthalten erreicht sind. HINWEIS: Die Breite und Höhe der Abschnitte beträgt ca. 200 mm.</li>
		<li>Sammeln Sie 10 m Abschnitte, die den CeA oder die bevorzugte Hirnregion enthalten, indem Sie 10 m Abschnitte auf glatten Glasgletten auftauen. Legen Sie die Glasgleitet sofort auf eine Metallpfanne, die auf Trockeneis ruht. Legen Sie die Dias mit Hirnprofilen so schnell wie möglich in einen -80 °C-Gefrierschrank. HINWEIS: Mehrere Slices können auf derselben Folie platziert werden. Wenn Sie einen anderen Zelltyp-Fleck für Scheiben auf demselben Dia verwenden, lassen Sie etwa 100 mm zwischen den Scheiben, sodass ein hydrophober Stift verwendet werden kann, um zelltypspezifische Antikörperlösungen auf dem Dia zu trennen. Lassen Sie etwa 20 mm vom Rand der Rutsche auf jeder Seite der Scheibe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunfluoreszenzfärbung
<ol><li>Färben Sie die Vorderhirnabschnitte für die Gehirnzelle Ihrer Wahl (z. B. Neuron, Mikroglia, Astrozyten usw.) mit Immunfluoreszenz.<ol>
<li>Entfernen Sie eine oder mehrere Dias mit 10 m Abschnitten des CeA aus dem Gefrierschrank -80 °C.</li>
		<li>Befestigen Sie die Dias mit 75% Ethanol für 30 s. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit.</li>
		<li>Blockieren Sie die Scheiben für 30 s mit 2% Rinderserumantigen (BSA) in 1x Phosphatpufferkochin (PBS). 1x mit PBS waschen.</li>
		<li>Fügen Sie dem Dia eine primäre Antikörperlösung für 2 min hinzu. 1x mit 2% BSA-Lösung waschen. HINWEIS: Die primäre Antikörperlösung besteht aus 2% primärem Antikörper, 1% RNase Out und 96% derselben BSA PBS-Lösung für den oben genannten Blockierungsschritt (Schritt 4.1.3). Das repräsentative Experiment verwendete einen Anti-NeuN-Antikörper, einen Anti-Cd11-Antikörper und einen Anti-GFAP-Antikörper in den folgenden Mengen: 3 l primär, 1,88 l RNA-Hemmer und 145,12 L BSA-Lösung.</li>
		<li>Fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung auf die Folie für 3 min. Waschen Sie 1x mit PBS. HINWEIS: Die sekundäre Antikörperlösung besteht aus 1 l Ziegenanti-Maus 488 nm Fluoreszenz-Tag (1:500), 2,5 l RNA-Hemmer, 1,3 l DAPI (1:10.000) und 196,5 l mit 2% BSA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Ethanol- und Xylol-Dehydrierungsserie
<ol><li>Tauchen Sie die Dias in 75% Ethanol für 30 s. Unmittelbar danach tauchen Sie die Dias in 95% Ethanol für 30 s. Unmittelbar danach tauchen Sie die Dias in 100% Ethanol für 30 s. Unmittelbar danach tauchen Sie die Dias in einen zweiten Behälter mit 100% Ethanol für 30 s.</li>
	<li>Nach der Ethanol-Dehydrierungsserie tauchen Sie die Dias für 1 min in frisch gegossenes Xylol. Tauchen Sie die Dias unmittelbar danach für 4 min in einen zweiten Behälter mit Xylol.</li>
	<li>Entfernen Sie die Dias aus dem Xylolbad und lassen Sie die Luft im Dunkeln für 5 min trocknen.</li>
	<li>Legen Sie die Dias in einem Trockenbau für 5 min weiter trocknen.</li>
</ol>6. Laser-Capture-Mikrodissektion
<ol><li>Wenn sie gefärbt sind, legen Sie das Dia in das Mikroskop und finden Sie die Region von Interesse (CeA) mit anatomischen Landmarken (d. h. dem optischen Chiasm und Stria terminalis).</li>
	<li>Verwenden Sie Fluoreszenz, um den gefärbten Zelltyp und seinen Kern im Interessenbereich zu identifizieren. Wählen Sie eine Zelle oder mehrere Zellen aus, wenn Sie einzelzellgepoolte Stichproben verwenden. Markieren Sie die von Interesse sindden Zellen mit Der LCM-Software.</li>
	<li>Platzieren Sie die LCM-Kappe auf der Scheibe auf der Interessenregion.</li>
	<li>Verwenden Sie Testaufnahmen eines Infrarotlasers (IR), um die IR-Laserstärke, -größe und -dauer so einzustellen, dass der LCM-Kappenkleber nur über den Bereich der ausgewählten Einzelzelle schmilzt. Dadurch wird sichergestellt, dass keine anderen Zellen als die ausgewählten Zellen gesammelt werden. HINWEIS: In diesem repräsentativen Experiment wurden 10 Zellpools desselben Zelltyps als Einzelprobe verwendet, um die Zell-zu-Zell-Variabilität in der Genexpression zwischen Proben mit derselben Behandlung zu begrenzen. Diese Methode kann jedoch für echte Einzelzellexperimente verwendet werden1,3.</li>
	<li>Wählen Sie die einzelnen Zellen aus, die für die Analyse mit den LCM-Softwaretools gesammelt werden sollen (Abbildung 2C). Die ausgewählten Zellen müssen sich im anatomischen Bereich des CeA (oder der Gehirnregion der Wahl) befinden, die auf dem Hirnatlas der Ratte und dem Bregma10basiert. Die Zellen sollten mindestens 3 m von den angrenzenden gebeizten Kernen entfernt sein.</li>
	<li>Feuern Sie den IR-Laser ab, um die identifizierten Einzelzellen zu sammeln.</li>
	<li>Platzieren Sie die Kappe in der Qualitätskontrollstation (QC), und zeigen Sie sie an, um sicherzustellen, dass nur die gewünschten Zellen ausgewählt wurden. Wenn andere Zellen irrtümlich ausgewählt wurden, kann ein ultravioletter Laser verwendet werden, um die unerwünschten Zellen zu zerstören, während die Kappe in der QC-Station verbleibt.</li>
	<li>Nehmen Sie ein Foto des Gewebeabschnitts auf, von dem aus die Zelle gesammelt wurde, um ihre anatomische Spezifität zu dokumentieren. Zeichnen Sie ggf. den Abstand der Scheibe vom Bregma mit einem Rattenhirnatlas als Referenz10auf.</li>
	<li>Entfernen Sie die LCM-Kappe von der QC-Station, befestigen Sie die Probenextraktionsvorrichtung und die Pipette 5,5 l Lysepuffer an der Probe. ANMERKUNG: Die Lyse-Pufferlösung besteht aus 0,5 l Lyse-Enhancer und 5 l Resuspensionspuffer.</li>
	<li>Das ExtracSure-Gerät auf ein 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr aufstellen und 15 min bei 75 °C auf eine Kochplatte legen.</li>
	<li>Drehen Sie die Probe und den Lysepuffer für 30 s bei niedriger Geschwindigkeit (0,01-0,02 x g) und legen Sie die gesammelte Probe in einen -80 °C-Gefrierschrank.</li>
</ol>7. Einzelliges mikrofluidisches RT-qPCR
<ol><li>Vorverstärkung der einzelzelligen mRNA für 96,96 Dynamic Array Chip<ol>
<li>Kombinieren Sie die vorwärts- und rückwärts mRNA qPCR-Genprimer für alle Gene, die in einem Primerpool zur Vorverstärkung untersucht werden (500 nM Konzentration pro Primer). Zum Beispiel 1 l von 100 -M Primern in 80 l plus 120 l DNA Suspension Buffer. HINWEIS: Die für das repräsentative Experiment verwendeten Primersequenzen finden Sie in O'Sullivan et al.4.</li>
		<li>In einer neuen 96 x 96 PCR-Platte, fügen Sie 1 l 5x VILO zu jedem Brunnen hinzu.</li>
		<li>LCM-Einzelzellproben aus den bei -80 °C gelagerten Proben entfernen, kurz auftauen lassen, bei niedriger Geschwindigkeit (0,01-0,02 x g)kurz zentrieren und 5,5 l der lysierten Einzelzellprobe zur PCR-Platte hinzufügen. Jedes Beispiel wird zu seinem eigenen Brunnen hinzugefügt.</li>
		<li>Die PCR-Platte mit den Proben und VILO in den Thermocycler geben und bei 65 °C 1,5 min erhitzen. Drehen Sie die Platte 1 min bei 1.300 x g bei 4 °C und legen Sie die Platte auf Eis.</li>
		<li>Fügen Sie 0,15 l 10x cDNA-Synthese-Master-Mix, 0,12 L T4 Gene 32-Protein und 0,73 l DNA-Suspensionspuffer zu jedem Brunnen hinzu.</li>
		<li>Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie folgendes Protokoll aus: 25 °C für 5 min, 50 °C für 30 min, 55 °C für 25 min, 60 °C für 5 min, 70 °C für 10 min, 4 °C bis Ende.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Brunnen 7,5 l Taq-Polymerase-Master-Mix hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Brunnen 1,5 L des Primerpools (siehe oben) hinzu.</li>
		<li>Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie das folgende Vorverstärkungsprotokoll aus: 95 °C für 10 min, gefolgt von 22 Zyklen von 96 °C für 5 Sek., 60 °C für 4 min.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Bohrwert 0,6 l Exonuklease-I-Reaktionspuffer 10x, 1,2 l Exonuklease I und 4,2 l DNA-Suspensionspuffer hinzu.</li>
		<li>Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie folgendes Protokoll aus: 37 °C für 30 min, 80 °C für 15 min.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Bohrwert 54 L TE-Puffer hinzu. Drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g bei 5 min. Bei 4 °C lagern, wenn Sie sofort weiter zum nächsten Schritt gehen. Bei -20 °C lagern, wenn Sie mehr als 12 h auf den nächsten Schritt warten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie die Probenplatte für den 96.96 Dynamic Array Chip vor.<ol>
<li>In einer neuen 96-Well-PCR-Platte fügen Sie jedem Bohrgut 0,45 l 20x DNA-Bindungsfarbstoff und 4,55 l low ROX Mastermix hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Bohrwert 3 l vorverstärkte Probe hinzu, drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g,und legen Sie die Platte dann auf Eis.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie die Assay-Platte für den 96.96 Dynamic Array Chip vor.<ol>
<li>In einer neuen 96-Well-PCR-Platte fügen Sie jedem Bohrgut 3,75 l 2x GE-Assay-Ladereagenz und 1,25 l DNA-Suspensionspuffer hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie jedem entsprechenden Brunnen 2,5 l von 10 m qPCR-Grundierung hinzu. Drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g für 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Laden und führen Sie den 96.96 Dynamic Array Chip aus.<ol>
<li>Prime den Chip mit Steuerleitung Flüssigkeit.</li>
		<li>Platzieren Sie den Chip in einem IFC Controller HX, und führen Sie das Prime (136X)-Skript aus.</li>
		<li>Fügen Sie 6 l der Probe von der PCR-Probenplatte in die entsprechenden Probenbohrungen im 96.96 Dynamic Array Chip ein.</li>
		<li>Fügen Sie 6 l der Probe von der PCR-Assayplatte in die entsprechenden Assay-Brunnen im 96.96 Dynamic Array Chip ein.</li>
		<li>Verwenden Sie Nadeln, um alle Luftblasen in den Brunnen des 96.96 Dynamic Array Chip zu knallen.</li>
		<li>Platzieren Sie den 96.96 Dynamic Array Chip im IFC Controller HX, und führen Sie das Load Mix (136x)-Skript aus.</li>
		<li>Entfernen Sie den Chip vom IFC Controller HX, ziehen Sie den Schutzaufkleber ab und legen Sie den 96.96 Dynamic Array Chip in eine mikrofluidische RT-qPCR-Plattform. Führen Sie das GE Fast 96 x 96 PCR-Protokoll (30 Zyklen) aus. HINWEIS: Die RNA-Qualität und Gültigkeit der Ergebnisse werden mit mehreren Methoden bewertet, einschließlich der Assay-Validierung über Gelelektrophorese, Schmelztemperaturkurven, Proben- und Assay-Replikationen und Standard-Verdünnungsseriendiagrammen. Zusätzlich können Transkriptionsergebnisse durch unabhängige Methoden zur Hirnhalbsektion validiert werden, einschließlich Western Blot und Immunfluoreszenz-Assays.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Messung der bakteriellen Fülle mit mikrofluidischem RT-qPCR
<ol><li>Extrahieren Sie die bakterielle DNA nach den Anweisungen des Stuhl-DNA-Extraktionskits.</li>
	<li>Schätzen Sie die bakterielle DNA-Konzentration mit qPCR.</li>
	<li>Fügen Sie die extrahierte bakterielle DNA zu einer neuen PCR-Platte hinzu. Fügen Sie 1 l extrahierte bakterielle DNA und 9 L DNA Suspension Puffer hinzu.</li>
	<li>Vorbereiten der Assay-Platte für den 48.48 Dynamic Array Chip (siehe Schritte 7.2.1-7.2.2)</li>
	<li>Vorbereitung der Probenplatte für den 48.48 Dynamic Array Chip (siehe Schritte 7.3.1-7.3.2)<ol>
<li>In einer neuen 96-Well-PCR-Platte fügen Sie 48 Bohrungen 0,45 l 20x DNA-Bindungsfarbstoff und 4,55 l low ROX Mastermix hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 3 l der Probe von der PCR-Platte, die die bakterielle DNA enthält, in die 48 Brunnen und drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g für 5 min. Bei 4 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laden und ausführen Sie den 48.48 Dynamic Array Chip (siehe Schritte 7.4.1-7.4.7).</li>
</ol>

<ol><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+drive+cell+phenotype+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Inputs drive cell phenotype variability.</a> Genome Research. 24, 930-941 (2014).</li>
<li>Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+functional+gene+regulatory+network+phenotypes+underlying+single+cell+transcriptional+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptional+Analysis+Reveals+Novel+Neuronal+Phenotypes+and+Interaction+Networks+Involved+in+the+Central+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Glia+and+Neuron+Gene+Expression+in+the+Central+Amygdala+in+Opioid+Withdrawal+Suggests+Inflammation+With+Correlated+Gut+Dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).</li>
<li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single+cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).</li>
<li>SEQC/MAQC-III Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+accuracy%2C+reproducibility+and+information+content+by+the+Sequencing+Quality+Control+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium.</a> Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).</li>
<li>Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+inflammation+and+dysbiosis+in+human+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease.</a> Physiological Reports. 5, (2017).</li>
<li>Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysbiosis+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Dysbiosis in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 53, 1-4 (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%3A+Hard+Cover+Edition%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition</a>. , (2006).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Einzelzellbiologie hat die Heterogenität zellulärer Phänotypen und die Robustheit der Gewebefunktion nachgewiesen. Diese Ergebnisse haben Einblicke in die Organisation biologischer Systeme sowohl auf Makro- als auch auf Mikroserskala gegeben. Hier beschreiben wir die Kombination von zwei Methoden, LCM und mikrofluidische qPCR, um einzellige Transkriptom-Maßnahmen zu erhalten, die anatomische Spezifität und Transkriptionsgenauigkeit zu relativ niedrigen Kosten bieten (Abbildung 1). Unsere...

Die Messung der Genexpressionsprofile einzelner Zellen hat eine umfassende phänotypische Heterogenität innerhalb eines Gewebes gezeigt. Diese Komplexität hat unser Verständnis der biologischen Netzwerke, die die Gewebefunktion steuern, erschwert. Unsere Gruppe und andere haben dieses Phänomen in vielen Geweben und Bedingungen1,2,3,4,5,6untersucht. Diese Experimente deuten nicht nur darauf hin, dass die Regulierung von Genexpressionsnetzwerken einer solchen Heterogenität zugrunde liegt, sondern auch, dass die einzellige Auflösung eine Komplexität in der Gewebefunktion offenbart, die die Gewebeauflösung nicht zu schätzen weiß. Tatsächlich kann nur eine kleine Minderheit von Zellen auf eine bestimmte Erkrankung oder Herausforderung reagieren, aber die Auswirkungen dieser Zellen auf die allgemeine Physiologie können erheblich sein. Darüber hinaus kann ein systembiologischer Ansatz, der multivariate Methoden auf hochdimensionale Datasets aus mehreren Zelltypen und Geweben anwendet, systemweite Behandlungseffekte aufklären.
Wir kombinieren LCM und mikrofluidische RT-qPCR, um solche Datensätze zu erhalten. Wir verfolgen diesen Ansatz hier im Gegensatz zur Erfassung einzelner Zellen über fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und der Verwendung von RNA-Sequenzierung (RNA-Seq), um ihr Transkriptom zu messen. Der Vorteil von LCM gegenüber FACS ist, dass die exakte anatomische Spezifität einzelner Zellen mit LCM relativ und absolut dokumentiert werden kann. Während RNA-seq mehr Funktionen messen kann, als RT-qPCR, ist der mikrofluidische RT-qPCR kostengünstiger und hat eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität7.
In diesem repräsentativen Experiment untersuchten wir die Auswirkungen von Opioidabhängigkeit und Naltrexon-gefälltem Opioidentzug auf die neuronale, mikroglia und astrozyte Genexpression der Ratte im zentralen Kern der Amygdala (CeA) und Darmmikroflora Fülle4. Vier Behandlungsgruppen wurden analysiert: 1) Placebo, 2) Morphin, 3) Naltrexon und 4) Entzug (Abbildung 1). Wir fanden heraus, dass die Opioidabhängigkeit die Genexpression nicht wesentlich verändert, sondern dass der Opioid-Entzug die Expression entzündlicher Gene, insbesondere Tnf, induzierte. Astrozyten waren der am stärksten betroffene Zelltyp. Das Darmmikrobiom wurde durch Opioid-Entzug stark beeinflusst, wie durch eineAbnahme des Firmicutes-Zu-Bacteroides-Verhältnisses angezeigt wird, das ein etablierter Marker für Darmdysbiose8,9 ist.

<table><tbody><tr><td>20X DNA-Bindungsfarbstoff</td><td>Fluidigm</td><td>100-7609</td><td>NA</td></tr><tr><td>2x GE Assay Loading Reagenz</td><td>Fluidigm</td><td>85000802-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>48.48 Dynamic Array IFC für Genexpression</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-48.48</td><td>NA</td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC für Genexpression</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anti-CD11&beta; Antikörper</td><td>Genway Biotech</td><td>CCEC48</td><td>Mikroglia-Färbung</td></tr><tr><td>Anti-NeuN Antikörper, Klon A60</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB377</td><td>Neuronale Färbung</td></tr><tr><td>ArcturusXT Laser Capture Mikrodissektionssystem</td><td>Arcturus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA Biomark HD</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td>RT-qPCR-Plattform</td></tr><tr><td>Rinderserum-Antigen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0211</td><td>NA</td></tr><tr><td>CellDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11753500</td><td>Komponenten der Lysepufferlösung</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>Nucleus Stain</td></tr><tr><td>DNA Suspension Buffer</td><td>TEKnova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>Neu Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0293S</td><td>NA</td></tr><tr><td>ExtracSure Probenextraktionsgerät</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0208</td><td>NA</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>Objektträger aus Normalglas</td></tr><tr><td>GeneAmp Dünnwandiges Reaktionsröhrchen</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific N8010611</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Monoklonaler Antikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21294</td><td>Astrozyten-Fleck</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG (H+L), superklonal&trade; Rekombinanter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A28175</td><td>Seconadry Antikörper</td></tr><tr><td>IFC Controller</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA RNaseOut</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix mit Low Rox</td><td>Bio-Rad</td><td>PN 172-5211</td><td>Rox Master</td></tr><tr><td>Mix SuperScript VILO cDNA Synthese Kit</td><td>ThermoFisher Wissenschaftliches</td><td>11754250</td><td>enthält VILO und SuperScript</td></tr><tr><td>T4-Gen-32-Protein</td><td>New Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0300S</td><td>NA</td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master</td><td>Mix ThermoFisher Scientific</td><td>4391128</td><td>NA</td></tr><tr><td>TE Puffer</td><td>TEKnova</td><td>T0225</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

kombination von laser capture microdissection und microfluidic qpcr zur analyse von transkriptionsprofilen einzelner zellen: ein systembiologischer ansatz zur opioidabhängigkeit

Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence

Die tiefgreifende transkriptionelle Heterogenität in anatomisch angrenzenden Einzelzellen legt nahe, dass eine robuste Gewebefunktionalität durch zelluläre Phänotypvielfalt erreicht werden kann. Einzelzellige Experimente, die die Netzwerkdynamik biologischer Systeme untersuchen, zeigen zelluläre und Gewebereaktionen auf verschiedene Bedingungen bei biologisch sinnvoller Auflösung. Hierin erklären wir unsere Methoden zur Sammlung einzelner Zellen an anatomisch spezifischen Stellen und zur genauen Messung einer Teilmenge ihrer Genexpressionsprofile. Wir kombinieren Lasercapture Microdissection (LCM) mit mikrofluidischen Reverse Transkriptionsquantitativepolymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCR). Wir verwenden diese mikrofluidische RT-qPCR-Plattform, um die mikrobielle Fülle von Darminhalten zu messen.

Die Auswahl der einzelnen Zellen wurde sowohl visuell als auch molekular validiert. Optisch wurde die zelluläre Morphologie vor der Zellsammlung betrachtet. Die gesammelten Zellen wurden dann an der QC-Station betrachtet und der Zellkernfleck (DAPI) überlappte sich mit der einzelligen Selektionsmarkerfluoreszenz. Abbildung 2A zeigt repräsentative Bilder einer Folie mit einem halbherektierten Rattenvorhirn, das das CeA enthält. Nachfolgende Bi...

Dieses Protokoll erklärt, wie einzelne Neuronen, Mikroglia und Astrozyten aus dem zentralen Kern der Amygdala mit hoher Genauigkeit und anatomischer Spezifität mit Laser-Capture-Mikrodissektion zu sammeln. Darüber hinaus erklären wir unsere Verwendung von mikrofluidischem RT-qPCR, um eine Teilmenge des Transkriptoms dieser Zellen zu messen.

Kombination von Laser Capture Microdissection und Microfluidic qPCR zur Analyse von Transkriptionsprofilen einzelner Zellen: Ein systembiologischer Ansatz zur Opioidabhängigkeit

Profound transcriptional heterogeneity in anatomically adjacent single cells suggests that robust tissue functionality may be achieved by cellular ...

Dies ist eine hochpräzise und kostengünstige Methode zum Verständnis der Genexpression auf Einzelzellebene. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir 96 Proben in einer Charge montieren können. Diese hohe Anzahl von Proben ermöglicht es uns, zelluläre Subphenotypen mit einer anatomischen Spezifität zu identifizieren.Die Pipeline dieser Methode kann auf jedes biologische Problem, jedes System, jedes Gewebe angewendet werden, um nach der individuellen zellulären Reaktion einzelner Neuronen oder anderer Zelltypen auf Krankheiten oder andere Störungen, jede Funktion zu erkundigen. Und dann gehen Sie weiter und erkundigen Sie sich, ob diese Zellreaktionen eine anatomische Architektur haben. Entfernen Sie das Gehirn aus der Gewebesammelbox und legen Sie es auf das Kryostatfutter.Sammeln Sie 10 Mikrometer Abschnitte, die den zentralen Kern der Amygdala oder einer anderen bevorzugten Hirnregion enthalten, indem Sie 10 Mikrometerabschnitte auf glatten Glasrutschen auftauen. Legen Sie die Glasgleitet sofort auf eine Metallpfanne, die auf Trockeneis ruht. Setzen Sie die Dias mit Hirnschnitten so schnell wie möglich in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius.Um eine Ethanol- und Xylol-Dehydrierungsserie durchzuführen, tauchen Sie die Dias zunächst für 30 Sekunden in 75% Ethanol. Unmittelbar danach die Dias für 30 Sekunden in 95% Ethanol tauchen. Dann tauchen Sie die Dias in 100%Ethanol für 30 Sekunden.Schließlich tauchen Sie die Rutschen direkt in einen zweiten Behälter mit 100% Ethanol für 30 Sekunden. Nach der Ethanol-Dehydrierungsserie die Dias für eine Minute in frisch gegossenes Xylol tauchen. Tauchen Sie die Dias unmittelbar danach vier Minuten lang in einen zweiten Behälter mit Xylol, bevor Sie trocknen, wie im Textprotokoll beschrieben.Verwenden Sie Fluoreszenz, um den gefärbten Zelltyp und seinen Kern im Interessenbereich zu identifizieren. Wählen Sie eine Zelle oder mehrere Zellen aus, wenn Sie einzelzellgepoolte Stichproben verwenden. Markieren Sie die von Interesse sindden Zellen mit Lasercapture-Mikrodissektion oder LCM-Software.Legen Sie die LCM-Kappe auf die Scheibe auf dem Interessenbereich und schmelzen Sie den LCM-Kappenkleber über den Bereich der ausgewählten Einzelzelle, wie im Textprotokoll beschrieben. Wählen Sie die einzelnen Zellen aus, die für die Analyse mit den LCM-Softwaretools gesammelt werden sollen. Die ausgewählten Zellen müssen sich im anatomischen Bereich des zentralen Kerns der Amygdala auf der Grundlage des Rattenhirnatlas und des Bregma befinden.Die Zellen sollten mindestens drei Mikrometer aus den angrenzenden gebeizten Kernen sein. Feuern Sie dann den Infrarotlaser ab, um die identifizierten Einzelzellen zu sammeln. Platzieren Sie die Kappe in der QC-Station, und zeigen Sie sie an, um sicherzustellen, dass nur die gewünschten Zellen ausgewählt wurden.Wenn andere Zellen irrtümlich ausgewählt wurden, kann ein ultravioletter Laser verwendet werden, um die unerwünschten Zellen zu zerstören, während die Kappe in der QC-Station verbleibt. Nehmen Sie ein Foto des Gewebeabschnitts auf, von dem aus die Zelle gesammelt wurde, um ihre anatomische Spezifität zu dokumentieren. Zeichnen Sie ggf. die Entfernung der Scheibe vom Bregma unter Verwendung eines Rattenhirnatlas als Referenz auf.Entfernen Sie die LCM-Kappe von der QC-Station, und schließen Sie das Probenextraktionsgerät an. Dann Pipette 5,5 Mikroliter Lyse Puffer auf die Probe. Die Extraktionsvorrichtung auf ein 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr montieren und 15 Minuten lang bei 75 Grad Celsius auf eine Kochplatte legen.Drehen Sie die Probe und den Lysepuffer 30 Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit herunter und legen Sie die gesammelte Probe in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Um die Vorverstärkung von einzelligem mRNA für einen dynamischen Array-Chip durchzuführen, fügen Sie zunächst fünf Mikroliter 5X VILO zu jedem Bohrkörper einer neuen 96 x 96 PCR-Platte hinzu. Entfernen Sie LCM Einzelzellproben von minus 80 Grad Celsius und lassen Sie sie kurz auftauen.Nach der Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit 5,5 Mikroliter der lysierten Einzelzellproben auf die PCR-Platte geben und jede Probe zu ihrem eigenen Brunnen hinzufügen. Die PCR-Platte mit den Proben und VILO in den Thermocycler geben und anderthalb Minuten bei 65 Grad Celsius erhitzen. Dann drehen Sie die Platte für eine Minute bei 1, 300 mal g und vier Grad Celsius und legen Sie die Platte auf Eis.Fügen Sie 10X cDNA Synthese Master Mix, T4 Gene 32 Protein und DNA Suspension Puffer zu jedem Brunnen. Legen Sie die PCR-Platte, die Probeplatte eins ist, in den Thermocycler und laufen Sie wie im Textprotokoll beschrieben. Nach dem Zyklus fügen Sie neun Mikroliter Taq-Polymerase-Lösung zu jedem Brunnen in die 96-Well-PCR-Platte.Neun Mikroliter bestehen aus 7,5 MikroliterT Taq Polymerase Master Mix und 1,5 Mikroliter des Primerpools. Legen Sie nun die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie das im Textprotokoll beschriebene Vorverstärkungsprogramm aus. Fügen Sie nach dem Präamplifikationsprotokoll sechs Mikroliter Exonukleaselösung zu jedem Brunnen in die 96-Well-PCR-Platte hinzu.Die Exonukleaselösung besteht aus 0,6 Mikrolitern 10X Exonuklease-eins-Reaktionspuffer, 1,2 Mikroliter Exonuklease-eins und 4,2 Mikroliter DNA-Suspensionspuffer. Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie das im Textprotokoll aufgeführte Programm aus. Fügen Sie schließlich 54 Mikroliter TE-Puffer zu jedem Bohrstein der Probenplatte eins hinzu.Drehen Sie die PCR-Platte fünf Minuten lang bei 1, 300 mal g. Bei vier Grad Celsius aufbewahren, wenn Sie sofort zum nächsten Schritt weitermachen. In einer neuen 96-Well-PCR-Platte, die Probeplatte zwei ist, fügen Sie fünf Mikroliter DNA-Bindungfarbstoff und Master-Mix-Lösung.Fügen Sie drei Mikroliter vorverstärkter Proben aus der Probenplatte eins in die entsprechenden Bohrungen in Probenplatte zwei ein. Drehen Sie die PCR-Platte bei 1, 300 mal g und legen Sie die Platte dann auf Eis. In einer neuen 96-Well-PCR-Platte, die Assayplatte zwei ist, fügen Sie fünf Mikroliter Assay-Ladelösung zu jedem Brunnen hinzu.Die Assay-Ladelösung besteht aus 3,75 Mikrolitern 2X GE-Assay-Ladereagenz und 1,25 Mikroliter DNA-Suspensionspuffer pro Brunnen. Dann fügen Sie 2,5 Mikroliter von 10 Mikromolar qPCR Primer von Assay Platte eins zu seinem entsprechenden Brunnen in Assay Platte zwei. Drehen Sie die PCR-Platte fünf Minuten lang bei 1, 300 mal g.Um den dynamischen Array-Chip zu laden und auszuführen, primen Sie zuerst den Chip mit Steuerleitungsflüssigkeit. Platzieren Sie dann den Chip in einem IFC-Controller HX und führen Sie das Primzahl-Skript 136X aus. Fügen Sie sechs Mikroliter aus der Probenplatte zwei in die entsprechenden Probenbrunnen im dynamischen Array-Chip 96 by 96 ein.Fügen Sie nun sechs Mikroliter aus der Assayplatte zwei in die entsprechenden Assay-Brunnen im dynamischen Array-Chip 96 by 96 ein. Verwenden Sie Nadeln, um alle Luftblasen in den Brunnen des 96 by 96 dynamischen Array-Chips zu knallen. Legen Sie dann den Chip in den IFC-Controller HX und führen Sie das Load Mix 136X Skript aus.Entfernen Sie als Nächstes den Chip vom IFC-Controller HX. Platzieren Sie den dynamischen Array-Chip 96 by 96 in eine mikrofluidische RT-qPCR-Plattform und führen Sie das GE-Schnell-96-by-96-PCR-Protokoll aus. Die Auswahl der einzelnen Zellen wurde sowohl visuell als auch molekular validiert. Optisch wurde die zelluläre Morphologie vor der Zellsammlung betrachtet.Hier sind repräsentative Bilder einer Folie mit halbherzigem Rattenvorhirn zu sehen, die den zentralen Kern der Amygdala enthält. Nachfolgende Bilder zeigen die Auswahl einzelner Zellen und deren Entfernung aus dem Gewebe für die transkriptomische Analyse. Molekular zeigten zelltypspezifische Marker eine erhöhte Expression in ihrem jeweiligen Zelltyp.Insbesondere wurde eine erhöhte Expression von NeuN in Neuronen, Maf in Mikroglia und Gfap in Astrozyten beobachtet. Die Heatmap zeigt die Expression aller Proben in 40 untersuchten Genen. Zeilen sind gespannte gepoolte Samples, die Zahlen bezeichnen die Stichprobencluster und die Spalten sind die Gene.Multivariate Analysemethoden zeigen, dass Astrozyten in der Entzugsgruppe der am stärksten betroffene Zelltyp waren. Basierend auf diesen Daten im Rahmen anderer Studien spielen Astrozyten wahrscheinlich eine Schlüsselrolle bei Entzündungen im zentralen Kern der Amygdala während des Opioidentzugs. Das Wichtigste, was man sich an diese Technik erinnern sollte, ist, die richtige Pipettenzulage zu verwenden, um die Anzahl der Luftblasen zu begrenzen.Die Transkriptionsergebnisse aus diesen Experimenten können mit Proteinmessmethoden wie Immunfluoreszenz oder Western Blot auf demselben Gewebe validiert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Laser Mikrodissektion wurde angewandt, um Gene Expression Profiling in bestimmten Kompartimenten des Drosophila Flügel Scheibe analysieren unterzogen, um lokalisierte...

Laser Mikrodissektion Angewandt auf Gene Expression Profiling von Untergruppe von Zellen aus dem Drosophila Wing Disc

In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Methode für die Gewinnung von Einzelzellen aus der Ratte primären neuronalen Kulturen und anschließende Transkriptom-Analyse mit aRNA Verstärkung. Dieser Ansatz ist verallgemeinerbar zu jedem Zelltyp.

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Die Profilierung der RNA-Expression in diskreten Regionen des Mausgehirns erfordert eine präzise und reproduzierbare Strategie zur Gewinnung von Gewebeproben. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das sowohl die koronare Schnittführung des Gehirns als auch die mikrodissektionsbasierte Gewebeentnahme mithilfe eines Gewebecorers nutzt. Die Ausbeute und Qualität der gesamten RNA aus den resultierenden Proben bestätigt die Eignung der dargestellten Methode.

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Einzel-Zell-Expression Profiling ermöglicht die detaillierte Genexpressionsanalyse einzelner Zellen. Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Kardiomyozyten, und die Vorbereitung der daraus resultierenden Lysate entweder für ganze Transkriptom-Mikroarray oder qPCR der spezifischen Ziele.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Wir beschreiben, wie der Laser-Mikrodissektion (LCM) verwenden, um angereichert Populationen von Neuronen im Hippocampus oder einzelne Neuronen aus Gefrierschnitten der Verletzten Rattenhirn für nachfolgende Genexpressionsanalyse mittels quantitativer real-time PCR und / oder des gesamten Genoms Microarrays erhalten.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Die Isolierung der einzelnen Dopamin-Neuronen oder der ventralen Haubengebiet mit direkter oder indirekter Immunhistochemie nutzt Laser Mikrodissektion demonstriert. Parameter für die Isolierung von Gewebe aus einem Glasobjektträger unter Verwendung eines Infrarotlasers und aus Membran Folien unter Verwendung der Kombination eines Infrarot und Ultraviolett-Lasers diskutiert.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die lasergestützte Mikrodissektion spezifischer Pflanzenzelltypen für die transkriptionelle Profilerstellung. Während das Protokoll für verschiedene Spezies und Zelltypen geeignet ist, liegt der Schwerpunkt bei der Kreuzblütlergattung Boechera auf schwer zugänglichen Zellen der weiblichen Keimbahn, die für die sexuelle und apomiktische Fortpflanzung wichtig sind.

Lasergestützte Mikrodissektion (LAM) als Werkzeug für die Transkriptionsprofilierung einzelner Zelltypen

Bulk-gen Ausdruck Messungen Wolke Einzelzelle Unterschiede in heterogenen Zellpopulationen. Hier beschreiben wir ein Protokoll wie einzellige gen Expressionsanalyse und Index Sortierung durch die Blüte aktiviert Zelle sortieren (FACS) kann kombiniert werden, um die Heterogenität zu umreißen und immunophenotypisch charakterisieren molekular unterschiedliche Zellpopulationen.

Eine kombinatorische einzellige Ansatz zur molekularen Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität der menschlichen Stammzellen und Vorläuferzellen Populationen

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Die Kombination von Laser-Capture-Mikrodissektion und mikrofluidischer RT-qPCR bietet anatomische und biotechnische Spezifität bei der Messung des Transkriptoms in einzelnen Neuronen und Glia. Die Anwendung kreativer Methoden mit dem systembiologischen Ansatz auf psychiatrische Erkrankungen kann zu Durchbrüchen im Verständnis und in der Behandlung führen, wie z.B. die Neuroinflammation-Anti-Belohnungs-Hypothese bei Sucht.

Untersuchung von Treibern von Anti-Belohnung im Suchtverhalten mit anatomisch spezifischen Einzelzell-Genexpressionsmethoden

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.

Laser-Capture-Mikrodissektion von paraformaldehydfixiertem Mauslebergewebe zur RNA-Analyse

Lernen Sie Laser Capture Microdissection und Microfluidic qPCR zur Analyse von Transkriptionsprofilen einzelner Neuronen, Mikroglia und Astrozyten aus dem Amygdala-Kerngebiet.

Kombination von Laser Capture Microdissection und Microfluidic qPCR zur Analyse von Transkriptionsprofilen einzelner Zellen: Ein systembiologischer Ansatz zur Opioidabhängigkeit (Video) | JoVE Journal

Kombination von Laser Capture Microdissection und Microfluidic qPCR zur Analyse von Transkriptionsprofilen einzelner Zellen: Ein systembiologischer Ansatz zur Opioidabhängigkeit

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