Predictive Immune Modeling von Solid Tumoren

Eine umfassende Charakterisierung der Tumormikroumgebung ist in der immunonkologischen Forschung unerlässlich. Dieser Test ist der erste, der RNA-basierte Gesundheitsexpressionsmodelle verwendet, um Immunzellen in festem Tumorgewebe zu messen. Dieser Test ermöglicht es Forschern, hochempfindliche und spezifische Messungen der Immunkontexture in FFB-Volumenkörpern zu gewinnen und diese Ergebnisse zu einem mehrdimensionalen Biomarker zu kombinieren.

Alle Krebsbehandlungen, nicht nur Immuntherapien, lösen eine Immunantwort an der Stelle des soliden Tumors aus. Die Messung dieser Immunantwort ist wichtig für das Verständnis der Krankheitsprogression und der Therapiereaktionen. Dieses Protokoll kombiniert traditionelle RNA-Bibliotheksvorbereitungstechniken mit gezielter Erfassung.

Während zeitaufwändig, die Einhaltung der Waschschritte und überwachung der Qualitätskontrollpunkte wie vorgeschlagen ist sehr wichtig für den Erfolg. Für stark degradierte RNA aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Proben, montieren Sie die erste Strangsynthesereaktion auf Eis nach der Tabelle. Mischen Sie die Reaktionen gründlich, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen, bevor Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge kurz herunterdrehen.

Am Ende der Zentrifugation die Proben sofort in einen vorgewärmten Thermocycler nach Programm Nummer drei vom Tisch legen. Für hochwertige intakte RNA, montieren Sie die erste Strangsynthesereaktion auf Eis in einem nukleasefreien PCR-Rohr, wie in den Tabellen beschrieben. Um dieses Verfahren zu beginnen, mischen Sie 200 Nanogramm der Barcode-Bibliothek von Interesse mit zwei Mikrogramm COT-1 DNA und zwei Mikroliter blockierenden Oligos in einem nukleasefreien PCR-Rohr.

Verwenden Sie dann einen Vakuumkonzentrator, der auf 30 bis 45 Grad Celsius eingestellt ist, um den Inhalt des Rohres zu trocknen. Nach der Hybridisierung entfernen Sie die Proben aus dem thermischen Cycler und stellen Sie den Thermischen Cycler auf 65 Grad Celsius ein, wobei der beheizte Deckel auf 70 Grad Celsius eingestellt ist. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 17 Mikroliter vollständig homogenisierte Perlen auf die Proben und Pipette gründlich nach oben und unten 10 Mal zu übertragen.

Um die DNA an die Perlen zu binden, legen Sie die Röhren nach Programm 10 nach Programm 10 kurz die abgestreiften Rohre alle 10 bis 12 Minuten für drei Sekunden sanften Wirbels zu entfernen, um die Perlen resuspended zu halten. Unmittelbar nach der Bindungsinkubation einen Rohrstreifen aus dem Thermocycler entfernen und 100 Mikroliter vorgewärmten Waschpuffer sanieren. Pipette gründlich 10 Mal nach oben und unten und legen Sie die Rohre auf einem magnetischen Rack, damit die Perlen vollständig von der Waschlösung trennen können, bevor Sie die ungebundene DNA, die Überstand enthält, ansischen.

Entfernen Sie die Rohre aus dem Rack und fügen Sie 150 Mikroliter vorgewärmten strengen Waschpuffer mit gründlicher Mischung, um die Perlen vollständig wieder zu suspendieren, wobei darauf geachtet wird, Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Rohre fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius wieder in den Thermocycler, bevor Sie die Rohre wieder auf das Magnetgestell legen, damit sich die Perlen vollständig von den Überräufern trennen können. Entsorgen Sie die ungebundene DNA, die Überwasserungsmittel enthält, waschen Sie die Perlen noch einmal mit einem vorgewärmten strengen Waschpuffer, wie gerade für insgesamt zwei strenge Waschungen nachgewiesen wurde.

Nach der letzten Wäsche den Überstand entfernen und 150 Mikroliter Raumtemperatur-Waschpuffer in die Rohre geben. Die Wäsche 10 bis 20 Mal waschen, um die Perlen vollständig wieder aufzuhängen und die Proben mit dem Deckel zwei Minuten lang abgedichtet, abwechselnd zwischen Wirbeln für 30 Sekunden und 30 Sekunden ruhend. Am Ende der Inkubation zentrieren Sie kurz und legen Sie die Rohre auf das magnetische Rack und entfernen Sie den Überstand, sobald die Perlen vollständig am Magneten haften.

Zentrifugieren Sie die Rohre kurz mit geschlossenen Kappen und geben Sie die Proben an das Magnetgestell zurück. Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette, um einen Restwaschpuffer zu entfernen und 150 Mikroliter Raumtemperatur-Waschpuffer zwei hinzuzufügen. Die Wäsche 10 bis 20 Mal waschen, um die Perlen vollständig wieder aufzuhängen und die Proben mit den für zwei Minuten versiegelten Deckeln zwischen wirbelnden 30 Sekunden und 30 Sekunden ruhenden Proben zu bebrüten.

Nach einer kurzen Zentrifugation das gesamte Volumen der Perlen aus jedem Rohr in saubere nukleasefreie PCR-Rohre übertragen und die Rohre auf das Magnetgestell legen. Nachdem Sie die ungebundene DNA, die Überdringungsmittel enthält, entsorgt haben, zentrieren Sie die Proben kurz wieder und verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette, um Restwaschpuffer aus den Perlen zu entfernen, während sie sich im magnetischen Rack befinden. Fügen Sie 150 Mikroliter Waschpuffer drei in die Rohre und Pipette nach oben und unten 10 bis 20 Mal, um die Perlen vollständig wieder aufzuhängen.

Inkubieren Sie das Rohr für zwei Minuten abwechselnd zwischen 30 Sekunden sanfter Wirbelung und 30 Sekunden Ruhe vor kurzzentrifugieren. Legen Sie die Rohre auf das Magnetgestell, um die Überräube zu aspirieren und die Perlenproben kurz wieder zentrifugieren. Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette, um Restwaschpuffer aus den Perlen zu entfernen, während sie sich im magnetischen Rack befinden, bevor Sie die Rohre aus dem Rack entfernen und die Perlen in 20 Mikroliter nukleasefreiem Wasser pro Rohr wieder aufhängen.

Dann Pipette die Perlen 10 mal, um sicherzustellen, dass alle Perlen an der Seite der Rohre geklebt wurden resuspended. Das Vorhandensein von Adapter-Dimeren sollte ausgewertet werden, um festzustellen, ob eine zusätzliche Bereinigung erforderlich ist. Zum Beispiel zeigt dieses Elektropherogramm einen akzeptablen Füllstand von Adapterdimer, der als scharfe Spitze um 128 Basenpaare erscheint, während dieses Elektropherogramm einen inakzeptablen Füllstand an Adapterdimer zeigt.

Die Immunprofile vor und nach der Behandlung können verwendet werden, um die Auswirkungen einer spezifischen Therapie auf die Tumormikroumgebung zu verstehen, wie in dieser repräsentativen Analyse, für die die prozentualen Veränderungen für jede Immunzelle von Interesse und der gesamte Immungehalt vor und nach der Chemotherapie für einen einzelnen Patienten angezeigt werden. In dieser Analyse wurden die Proben zwischen den Patientengruppen nach ihrer Zeit bis zum Krankheitsverlauf nach der Behandlung verglichen. Eine Teilmenge der Patienten zeigte ein Wiederauftreten der Erkrankung nach 18 Monaten, während eine andere Teilmenge in 18 oder weniger Monaten schneller voranschritt.

Der mediane Deltawert könnte dann für jede Probe verglichen werden, um vermeintliche Biomarker des Krankheitsverlaufs zu identifizieren. So wurden hier beispielsweise zwei Immun-Escape-Gene als statistisch signifikante Unterscheidungsmerkmale der Probengruppierungen identifiziert. Da die einzelnen Genbiomarker robust und statistisch klar signifikant waren, hat der mehrdimensionale Biomarker keinen signifikanten Vorhersagewert beigemessen.

Achten Sie darauf, die erhitzten Wärvorgänge einen Streifen nach dem anderen durchzuführen, um eine Probenkühlung zu verhindern, und denken Sie daran, die Perlen in frische Rohre zu übertragen, um eine Verunreinigung außerhalb des Ziels zu vermeiden. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von Genexpressionsmodellen zur Quantifizierung von Immunzellen und Tumorgewebe. Neue Modelle werden entwickelt, um Zellzustände wie Erschöpfung oder Aktivierung zu messen.