Name: Testen von gezielten Krebstherapien mit struktureller DNA-Alterationsanalyse und patientenabgeleiteten Xenografts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Erfahren Sie, wie gezielte Krebstherapien durch strukturelle DNA-Alterationsanalyse und patientenabgeleitete Xenografts getestet werden. Diese Methode validiert die Wirksamkeit von Medikamenten in immunsupprimierten Mäusen.

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Wir danken den Mitgliedern des Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang und Faye R. Harris, MS, für die Hilfe bei der Durchführung von Experimenten. Diese Arbeit wurde unterstützt von Herrn und Frau Neil E. Eckles' Gift an das Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).

Frisches Gewebe von einwilligenden Patienten mit Eierstockkrebs wurden zum Zeitpunkt der Entschärbungsoperation gemäß einem vom Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokoll gesammelt. Alle in diesem Protokoll verwendeten tierischen Verfahren und Behandlungen wurden vom Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und befolgten die Richtlinien für die Tierpflege.
1. Paarsequenzierung und Analysen
HINWEIS: Für die Sequenzierung des Paarpaares (MPseq) muss entweder frisches oder blitzgefrorenes Gewebe verwendet werden. Paraffin-Eingebettetes Material ist nicht geeignet, da es fragmentierte DNA enthält.
<ol><li>Isolieren Sie DNA aus gefrorenem Tumorgewebe. Verwenden Sie original menschliche Proben aus chirurgischem Material oder Biopsie36.</li>
	<li>Verwenden Sie 1000 ng DNA, um MPseq-Bibliotheken und Sequenz als 2 Samples pro Spur auf der nächsten Generation Sequenzer (siehe Tabelle der Materialien)36zu machen.</li>
	<li>Analysieren Sie Daten mit einer Reihe von Algorithmen, um große chromosomale Aberrationen (Deletionen, Einfügungen, Verstärkungen, Inversionen und Translokationen) zu erkennen, wie zuvor beschrieben36,37.</li>
</ol>2. Auswahl therapeutischer Ziele
<ol><li>Verwenden Sie das Open-Access-Panda-Tool (Pfad und Anmerkung) oder ein analoges Werkzeug, um zielfähige Änderungen (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda) zu identifizieren.<ol>
<li>Erstellen Sie eine Liste von Genen, die von MSeq als verändert identifiziert werden, als einfache Datei mit Tab-Trennung, die standardmäßig akzeptierte Gensymbole verwendet. HINWEIS: Das enthaltene Beispiel bietet die Analyse von Verstärkungen und Gewinnen.</li>
		<li>Fügen Sie der Kopfzeile der Liste ein "-"-Zeichen hinzu, um sicherzustellen, dass der Tabellenkopf in die Pfadebenenansicht der Software übertragen wird.</li>
		<li>Laden Sie die Datei hoch, indem Sie auf die Navigationsregisterkarte "Annotationset hochladen" klicken.</li>
		<li>Weisen Sie ein einzelnes Symbol aus dem Menü zu, um die zugrunde liegenden Daten darzustellen, indem Sie auf das Symbol ihrer Wahl und dann auf die Registerkarte "Abschließen" klicken.</li>
		<li>Nachdem die Anmerkungsdateien hochgeladen wurden, identifizieren Sie eine Spalte, in der die Anzahl der annotierten Gene pro Pfad angezeigt wird. Dies ist die letzte Spalte auf der rechten Seite.</li>
		<li>Verwenden Sie den Pfadfilter oben links im Hauptfenster, um Pfade anzuzeigen, die Gene von Interesse enthalten.</li>
		<li>Identifizieren Sie Pfade, die mehr benotete Gene haben, als zufällig erwartet wird. Verwenden Sie die Funktion unter der Registerkarte Anreicherung.</li>
		<li>Wählen Sie eine Datenbank aus, um potenziell drogenfähige Gene aus Preset Annotation anzuzeigen, indem Sie ein entsprechendes Symbol links im Hauptfenster überprüfen (z. B. DGIdb, PharmGKB).</li>
		<li>Wählen Sie den Pfad für die Visualisierung aus, indem Sie auf den Namen klicken, der auf der Seite Pathway Viewer angezeigt wird. HINWEIS: Symbole, die jeden Anmerkungssatz darstellen, werden neben dem zugeordneten Gen angezeigt. Klicken Sie auf das von Interesse sein Gen, um die entsprechende GeneCards-Webseite zu öffnen.</li>
		<li>Wählen Sie die Wege aus, die die annotierten Gene von Interesse zeigten (d. h. in einem bestimmten Tumor verändert wurden) und "Treffer" für potenzielle Medikamente für weitere Analysen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie eine Datenbank mit Arzneimitteln, die für die klinische Anwendung zugelassen sind (https://clinicaltrials.gov/), um die identifizierten Ziele zu referenzieren.</li>
	<li>Priorisieren Sie zielfähige Änderungen für weitere Tests in PDX-Modellen, indem Sie eine Literaturrecherche (z. B. PubMed) durchführen, um die Relevanz für die Biologie eines bestimmten Tumortyps zu bestätigen.</li>
</ol>3. Validierung genomischer Umlagerungen durch PCR- und Sanger-Sequenzierung
<ol><li>Designprimer mit Sequenzierungslesevorgängen, die aus MPseq-Daten stammen.<ol>
<li>Wählen Sie einen Knotenpunkt von Interesse für die Validierung (d. h. potenzielles therapeutisches Ziel) basierend auf MPseq-Analysen.</li>
		<li>Designgrundierungen richtungsweisend, so dass das Amplicon die Kreuzung enthält. Entwerfen Sie 2 Primer auf jeder Seite der Kreuzung, für insgesamt 4, um die Chancen zu erhöhen, die Kreuzung zu verstärken. HINWEIS: Benennen Sie Primer je nach Gehäuse und Chromosomenposition.</li>
		<li>Verwenden Sie Standard-PCR-Parameter für das Primer-Design und eine Software der Wahl. Wählen Sie die Schmelztemperatur (60-62 °C) und den GC-Gehalt (40-60%). Stellen Sie sicher, dass die Primersequenz keine Primer-Dimere, Palindrome oder Haarnadelschleifen bildet.</li>
		<li>Bestätigen Sie, dass der Primersequenz die Homologie zu anderen Bereichen des menschlichen Genoms fehlt, indem Sie sie mit BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) überprüfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie eine PCR aus, um die Verbindung von Interesse zu verstärken.<ol>
<li>Unterdünnen Sie Primer mit Wasser auf 10 mM und kombinieren Sie 10 ml jeder Grundierung, so dass jede Vorwärtsgrundierung mit jeder Reverse Primer zu einem Primer-Mix gepaart wird. HINWEIS: Sequenzen für die Primer für das ausgewählte Beispiel sind in Tabelle 1dargestellt.</li>
		<li>Etikettieren Sie 0,2 ml Streifenröhrchen wie: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 und T4, wobei C=Kontrolle der menschlichen genomischen DNA (kommerziell), T=Tumor-DNA, isoliert von Patient oder PDX-Tumor, und die Zahl zeigt die Primermischung an.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml jeder Primermischung in die beschrifteten Rohre ein.</li>
		<li>Bereiten Sie den Taq Mastermix vor, indem Sie die in Tabelle 2aufgeführten Reagenzien kombinieren und das Enzym bis zum Bedarf im Gefrierschrank lassen und ganz am Ende in die Mischung einfügt.</li>
		<li>Machen Sie 2 Master-Mischungen, eine für jede Schablone DNA, steuern menschliche DNA und Tumor-DNA. Fügen Sie 24 ml jedes Taq-Master-Mix zu seinem jeweiligen Streifenrohr hinzu. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 25 ml. Wirbel sehr kurz und dann drehen Sie das Streifenrohr nach unten.</li>
		<li>Führen Sie eine PCR in einem Thermocycler aus. Verwenden Sie die in Tabelle 3 dargestellten Parameter. Stellen Sie die Glühtemperatur so ein, dass sie mindestens 1 °C kälter ist als die Schmelztemperatur der Primer.</li>
		<li>Lagern Sie das fertige PCR-Produkt bei -20 °C (langfristig) oder gekühlt bei 4 °C (kurzfristig) bis erforderlich.</li>
		<li>Führen Sie die Elektrophorese bei 1-5 V/cm durch, um das PCR-Produkt mit einem 1,5% Agarose-Gel zu visualisieren. Lassen Sie 2 ml Aliquot des Produkts für die Sanger-Sequenzierung verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die Sanger-Sequenzierung durch, um die Kreuzung zu bestätigen und den genauen Haltepunkt38 zuidentifizieren.<ol>
<li>Verwenden Sie das PCR-Produkt, wenn die PCR ein einzelnes Produkt (Band) generiert hat. Alternativ können Sie das Band aus Gel schneiden, reinigen und für die Sanger-Sequenzierung zusammen mit dem Grundierung für die Verstärkung einreichen. HINWEIS: Die Tumoren, für die dann genomische Analysen durchgeführt wurden, werden für die Implantation bei Mäusen verwendet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Tumorengraftment und -erhaltung
<ol><li>Richten Sie Präparate ein, um Tumore in PDX-Mausmodelle einzupflanzen. Wählen Sie für Transplantationstumoren aus, für die genomische Analysen durchgeführt werden oder durchgeführt wurden.<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass zum Zeitpunkt des Beginns der Entwicklung von PDX-Modellen eine unterstützende Infrastruktur vorhanden ist, einschließlich spezieller Labor- und Tiereinrichtungen, qualifiziertem technischen Personal und detaillierten Standardbetriebsverfahren.</li>
		<li>Stellen Sie den schnellen Transport und die Verarbeitung von Proben sicher, da die Geschwindigkeit für die Zelllebensfähigkeit und die erfolgreiche Engraftmentierung entscheidend ist.</li>
		<li>Verwenden Sie eine sterile Umgebung, um bakterielle und Pilzkontamination für die Verarbeitung und Verengung von Proben zu reduzieren.</li>
		<li>Behandeln Sie menschliche Proben mit Vorsicht, in Übereinstimmung mit der institutionellen Politik in Bezug auf potenziell biogefährliche Materialien, da sie durch Blut übertragene Krankheitserreger beherbergen können.</li>
		<li>Bereiten Sie das Gewebe (0,5-0,7 cm3 in der Größe) für die Engraftmentierung vor, indem Sie die chirurgische Probe in ein vorgekühltes 50 ml-Rohr mit 20 ml Gewebekulturmedien geben. HINWEIS: Das Tumorgewebe kann frisch sein oder aus zuvor kryokonserviertem Material5zurückgewonnen werden.</li>
		<li>Bestätigen Sie den Tumorgehalt in der Probe, indem Sie einen Pathologen konsultieren.</li>
		<li>Legen Sie das Tumorgewebe in eine Schale, die 10-15 ml kalte sE enthält, oder Gewebekulturmedien wie RPMI 1640 oder DMEM, die Antibiotika enthalten (1% Penicillin und Streptomycin).</li>
		<li>Identifizieren und isolieren Sie lebensfähiges Tumormaterial aus angrenzendem normalen und nekrotischen Gewebe mit Hilfe eines Pathologen. Verwenden Sie sterile Zangen und Skalpell, um nekrotisches Material zu entfernen, auf das ein Pathologe hingewiesen hat. HINWEIS: Der Tumor kann entweder intraperitoneal oder subkutan in die Mäuse implantiert werden. Führen Sie Schritt 4.2 aus, um eine intraperitoneale Implantation durchzuführen, oder fahren Sie mit Schritt 4.3 fort, um eine subkutane Engraftmentierung durchzuführen. In dieser Studie wurden gezielte Therapien, die auf der Grundlage genomischer Analysen ausgewählt wurden, in einer Reihe von PDX-Modellen auf hochwertigen serösen Eierstockkrebs mit intraperitonealer Implantation getestet.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie das Gewebe für intraperitoneale (IP) Implantation das Gewebe mit sterilen Zangen und einem Skalpell auf Eis zu stücken ca. 1-1,5 mm3 in der Größe und Mischen mit kalten Kultur Medium. Injizieren Sie 0,3–0,5 ml Tumorschlämme mit einer 16-17-Messnadel. HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe werden mit aseptischen Techniken durchgeführt. Sterile Handschuhe, sterile Instrumente, Vorräte und implantierte Materialien wurden verwendet, um die Wahrscheinlichkeit einer Infektion zu reduzieren.<ol>
<li>Mischen Sie die Stücke 1:1 mit eiskaltem Kulturmedium und injizieren Sie 100 ml intraperitoneal in mindestens drei weibliche SCID-Mäuse.</li>
	</ol></li>
	<li>Schneiden Sie das Tumorgewebe für die subkutane Engraftmentierung mit sterilen Zangen, Skalpell oder chirurgischen Scheren in kleine Fragmente, etwa 2 x 2 x 2 mm groß, und übertragen Sie das fragmentierte Gewebe auf eine vorgekühlte Petrischale auf Eis.<ol>
<li>Fügen Sie die kalte Kellermembranmatrix mit dem fragmentierten Gewebe (ca. 200 ml pro 10 Stück Gewebe) in die Schale ein, mischen Sie sie gut und lassen Sie die Gewebefragmente 10 min in der kalten Kellermembranmatrix einweichen.</li>
		<li>Anästhetisieren Sie 5 weibliche NOD/SCID-Mäuse, um sie für die Engraftmentierung vorzubereiten.</li>
		<li>Injizieren Sie jede Maus intraperitoneal mit Ketamin (150 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) Kombination.</li>
		<li>Bestätigen Sie, dass die Maus richtig beästhebt ist, indem Sie die Schwanzspitze mit atraumatischen Zangen kneifen.</li>
		<li>Entfernen Sie sanft vollständig anästhesisierte Maus aus der Kammer und setzen Sie auf die Maus einen Nasenkegel, der Eingang von Verdampfer und Ausgang von Abgas-Aufräumsystem hat.</li>
		<li>Setzen Sie Tierarzt Salbe auf Mausaugen, um Trockenheit zu verhindern, während unter Anästhesie. Bereiten Sie den Bereich vor, in dem die Operation durchgeführt wird. Verwenden Sie aseptische Technik, um die Operation durchzuführen.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche, auf der die Operation stattfinden wird, nicht porös, versiegelt und vor der Operation desinfiziert wird.</li>
		<li>Beginnen Sie die Operation mit sterilen (durch Autoklaven, Gas oder chemische Sterilisation) Instrumente.</li>
		<li>Verwenden Sie Handschuhe, um Instrumente zu handhaben und die Sterilität der Instrumentenspitzen während des gesamten Verfahrens zu erhalten, indem Sie sie zwischen den Operationsschritten in Ethanol untertauchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterilisieren Sie die chirurgische Stelle, indem Sie 3 abwechselnde Peelings von Jod und Alkohol anwenden. Verwenden Sie sterile chirurgische Schere und Zangen, um einen 5-10 mm vertikalen Hautschnitt an beiden Flanken einer Maus zu machen.<ol>
<li>Setzen Sie gerade Zangen sanft in den subkutanen Raum ein, um eine Tasche zu schaffen, die groß genug ist, um ein Tumorfragment unter das Fettpolster zu legen.</li>
		<li>Verwenden Sie die sterilen geraden Zangen, um Tumorfragmente in zuvor vorbereitete Tasche in jeder der 5 Mäuse einzufügen. HINWEIS: Legen Sie 3-4 Stück Tumorgewebe in eine Tasche.</li>
		<li>Schließen Sie die Hautschnitte mit Gewebekleber.</li>
		<li>Intraperitoneally injizieren jede Maus mit 100 ml Rituximab nach der Implantation, um die Lymphozytenproliferation zu hemmen.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie die Maus in einen Käfig unter einer Wärmelampe für ca. 20 min, bis sie von der Anästhesie erholt ist. Überwachen Sie die Maus Vitalzeichen und stellen Sie seine ausreichende Hydratation.</li>
	<li>Bringen Sie die Maus an die Gesellschaft anderer Mäuse zurück, nachdem sie sich von der Anästhesie erholt und begann, Nahrung und Wasser zu haben. Bereitstellung postoperativer Betreuung und Überwachung gemäß institutionellen Richtlinien. Überprüfen Sie täglich 3 aufeinanderfolgende Tage nach der Operation auf Anzeichen von Schmerzen und Schmerzen. HINWEIS: Kriterien für Schmerzen oder Not sind Nekrose oder Geschwüre, Gewichtsverlust / Körperzustand Scoring, Verhaltenszeichen wie Aktivitätsniveau, motorische Funktion und Körperhaltung.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Mäuse routinemäßig zweiwöchentlich auf Tumorbildung, bis die Tumore die Größe von 0,5 cm Durchmesser erreichen, gemessen mit einem Bremssattel.</li>
	<li>Bewerten Sie den Integritätswert jeder Maus, die von Aussehen, Verhalten und Körperzustand39abgeleitet ist. Verwenden Sie Die Werte von 6 € als Kriterien für moribunde Mäuse, die durch Kohlendioxid-Inhalation geopfert werden.</li>
</ol>5. Testen von Reaktionen auf genomisch identifizierte Ziele in PDX-Modellen
<ol><li>Beginnen Sie die ausgewählten zielgerichteten Behandlungen, wenn die Tumore spürbar sind und erreichen Sie 0,5 cm3, gemessen durch einen Ultraschall-Scan.<ol>
<li>Vor der Durchführung einer Ultraschalluntersuchung des Bauches entfernen Sie die Maus Bauchfell und tragen sterilgelee Schmiermittel.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Ultraschallmaschine mit einem Messumformer, um Bilder mit dem Tumor im Querschnitt zu erhalten. Machen Sie 3 Messungen pro Sitzung für jedes Tier und durchschnittlich den Wert für eine genauere Bewertung der Tumorgröße.</li>
		<li>Analysieren Sie die Bilder mit der verfügbaren Software40.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chemotherapie, bestehend aus einer Mischung aus Carboplatin bei 51 mg/kg und Paclitaxel bei 15 mg/kg intraperitoneal (IP) einmal pro Woche für eine Gesamtbehandlungsdauer von 4-6 Wochen. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen für die Injektion 0,2 ml nicht überschreitet.</li>
	<li>Machen Sie eine MK-220641 Stofflösung in 30% Cyclodextrin (z.B. Captisol) und liefern Sie über orale Gavage bei 120 mg/kg täglich für 4 aufeinander folgende Wochen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Maus für die orale Gavage vor, indem Sie sie halten, indem Sie die Haut des Rückens kneifen und sie zurückstecken, so dass der Kopf und die Gliedmaßen der Maus immobilisiert sind.<ol>
<li>Setzen Sie die Gavage-Sonde an der Rückseite der Mauskehle ein, bis die Sonde die Speiseröhre erreicht. Stellen Sie sicher, dass die Sonde nicht zu weit eingesetzt wird, da die Lunge der Maus perforiert und den Tod verursacht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie eine MK-866942 Stofflösung in Ethanol bei 25 mg/ml her. Verdünnen Sie es in einem Fahrzeug mit 5,2% Tween 80, 5,2% PEG400 in sterilem Wasser für IP-Injektionen bei 10 mg/kg für 5 Tage jede zweite Woche, mit einer Gesamtdauer der Behandlung von 4 Wochen. HINWEIS: Das Volumen, das Mäusen injiziert wird, sollte 50-120 ml betragen, abhängig vom Gewicht des Tieres.</li>
	<li>Verwenden Sie 7-8 Mäuse pro Behandlungsgruppe, um genügend statistische Leistung zu haben, um Unterschiede zu erkennen43,44.</li>
	<li>Beurteilen Sie das Körpergewicht und den allgemeinen Zustand der Mäuse in der Therapie täglich. Halten Sie Medikamente zurück, wenn das Gewicht eines Tieres um 20 % oder mehr ab dem ursprünglichen Gewicht sinkt.</li>
	<li>Bewerten Sie die Tumorgröße wöchentlich mit Ultraschall-Scans. Stellen Sie sicher, dass die Person, die die Überwachung des Tumorwachstums durchführt, für die Behandlung geblendet ist, um die unvoreingenommene Bewertung der Reaktionen zu gewährleisten. HINWEIS: Kleinere Laboratorien können 2 verschiedene Personen beschäftigen, um Behandlung und Ultraschallüberwachung zu verwalten.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Wir beschreiben den Ansatz und die Protokolle, die wir verwendet haben, um eine "klinische Studie" in PDX-Modellen durchzuführen, die die molekularen Eigenschaften des Tumors nutzt, wie sie durch genomisches Profiling gewonnen werden, um die beste Auswahl an Medikamenten für Tests zu bestimmen. Mehrere Sequenzierungsplattformen werden derzeit für die genomische Charakterisierung von Primärtumoren verwendet, einschließlich der gesamten Genomsequenzierung, RNAseq und kundenspezifischer Genpanels. Für hochgradige seröse Ser...

Patienten-abgeleitete Xenografts (PDXs), die aus der Implantation von Tumorstücken von Patienten in immundefizienten Mäusen erzeugt werden, haben sich als ein leistungsfähiges präklinisches Modell zur Unterstützung einer personalisierten Krebsbehandlung herauskristallisiert. PDX-Modelle wurden erfolgreich für eine Vielzahl von menschlichen Malignitäten entwickelt. Dazu gehören Brust- und Eierstockkrebs, malignes Melanom, Dickdarmkrebs, Bauchspeicheldrüsenadenokarzinom und nicht-kleinzelliger Lungenkrebs1,2,3,4,5. Tumorgewebe kann orthotopisch oder heterotopisch implantiert werden. Erstere, die als genauer, aber technisch schwierig gelten, beinhaltet eine Transplantation direkt in das Tumororgan. Diese Arten von Modellen werden geglaubt, um genau imitieren Histologie des ursprünglichen Tumors aufgrund der "natürlichen" Mikroumgebung für den Tumor6,7. Zum Beispiel führte die orthotopische Transplantation in die Bursa des Maus-Ovarials zur Tumorverbreitung in die Peritonealhöhle und zur Herstellung von Aszites, typisch für Eierstockkrebs8. In ähnlicher Weise beeinflusste die Injektion von Brusttumoren in die Brust anstelle der Bauchbrustdrüse die PDX-Erfolgsrate und das Verhalten9. Orthotopmodelle erfordern jedoch ausgeklügelte Bildgebungssysteme, um das Tumorwachstum zu überwachen. Die heterotopische Implantation eines soliden Tumors erfolgt in der Regel durch Implantation von Gewebe in die subkutane Flanke einer Maus, was eine einfachere Überwachung des Tumorwachstums ermöglicht und weniger teuer und zeitaufwändigist 7. Allerdings wuchsen Tumore subkutan selten metastasierend, anders als bei der orthotopischen Implantationbeobachtet 10.
Die Erfolgsrate der Transplantation hat sich als variierend erwiesen und hängt stark vom Tumortyp ab. Aggressivere Tumoren und Gewebeproben, die einen höheren Prozentsatz der Tumorzellen enthalten, hatten den Berichten zufolge bessere Erfolgsraten12,13. In Übereinstimmung damit, Tumoren von metastasierenden Stellen abgeleitet wurden gezeigt, um mit Frequenzen von 50-80%, während diejenigen von primären Standorten engraft bei Frequenzen so niedrig wie 14%12. Im Gegensatz dazu, Gewebe mit nekrotischen Zellen und weniger lebensfähige Tumorzellen engraft schlecht. Das Tumorwachstum kann auch durch die Zugabe von Kellermembran-Matrixproteinen in den Gewebemix zum Zeitpunkt der Injektion in Mäuse14 gefördert werden, ohne die Eigenschaften des ursprünglichen Tumors zu beeinträchtigen. Die Größe und Anzahl der gewebeteile, die für die Implantation bestimmt sind, beeinflussen auch die Erfolgsrate der Engraftment. Größere Tumoraufnahmeraten wurden für die Implantation in der subrenalen Kapsel im Vergleich zur subkutanen Implantation aufgrund der Fähigkeit der subrenalen Kapsel berichtet, den ursprünglichen Tumor stroma zu erhalten und die Wirtsstromzellen sowie15zur Verfügung zu stellen.
Die meisten Studien verwenden NOD/SCID immundefizienten Mäusen, denen natürliche Killerzellen16 fehlen und die nachweislich die Tumorengraftment, das Wachstum und die Metastasierung im Vergleich zu anderen Stämmen erhöhen14. Eine zusätzliche Überwachung ist jedoch erforderlich, da sie thymische Lymphome bereits im Alter von3-4Monaten entwickeln können. Bei Eierstocktumortransplantationen, die in SCID-Mäusen angebaut wurden, wurde das Auswachsen von B-Zellen erfolgreich durch Rituximab gehemmt, was die Entwicklung von Lymphomen verhinderte, ohne jedoch die Engraftmentierung von Eierstocktumoren zu beeinträchtigen17.
In jüngerer Zeit, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) Mäuse, die eine Nullmutation im Gen tragen, die die Interleukin-2-Rezeptor-Gammakette18kodiert, wurden zu einem häufig verwendeten Stamm für die Erzeugung von PDX-Modellen. Tumore aus etablierten PDX-Modellen, die an zukünftige Generationen von Mäusen weitergegeben werden, behalten berichtend histologische und molekulare Eigenschaften für 3 bis 6 Generationen19,20. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Behandlungsergebnisse in PDX-Modellen die ihrer entsprechenden Patienten imitieren2,3,4,21,22,23. Die Ansprechrate auf Chemotherapie in PDX-Modellen bei nicht-kleinen Lungenkrebs und dickdarmen Karzinomen war ähnlich wie in klinischen Studien für die gleichen Medikamente24,25. Studien, die in PDX-Modellen durchgeführt wurden und für Patienten entwickelt wurden, die an klinischen Studien teilnahmen, zeigten Reaktionen auf getestete Medikamente, die denen ähnlich waren, die bei entsprechendenPatienten2,3,4klinisch beobachtet wurden.
Genomanalysen eines Patiententumors mit hohem Durchsatz in Verbindung mit PDX-Modellen bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um Korrelationen zwischen spezifischen genomischen Veränderungen und einer therapeutischen Reaktion zu untersuchen. Diese wurden in einigen Veröffentlichungen26,27beschrieben. Zum Beispiel therapeutische Reaktionen auf den EGFR-Hemmer Cetuximab in einer Reihe von kolorektalen PDX-Modellen, die EGFR-Amplifikation, parallele klinische Reaktionen auf Cetuximab bei Patienten28.
Es gibt einige Herausforderungen, die mit der Entwicklung und Anwendung von PDX-Modellen verbunden sind. Unter diesen ist Tumorheterogenität29,30, die die Genauigkeit der Behandlungsantwort Interpretation als ein einzelner Zellklon mit höherer proliferativer Kapazität innerhalb eines PDX beeinträchtigen kann die anderen31wachsen , was zu einem Verlust der Heterogenität. Darüber hinaus, wenn einzelne Tumorbiopsien verwendet werden, um PDX zu entwickeln, können einige der Zellpopulationen verpasst werden und werden nicht in der endgültigen Transplantation dargestellt werden. Mehrere Proben desselben Tumors werden für die Implantation empfohlen, um dieses Problem zu beheben. Obwohl PDX-Tumoren in der Regel alle Zelltypen des ursprünglichen Spendertumors enthalten, werden diese Zellen nach und nach durch solche murinen Ursprungsersetzt 3. Das Zusammenspiel zwischen muriner Stroma und menschlichen Tumorzellen in PDX-Modellen ist nicht gut verstanden. Dennoch wurde gezeigt, dass Stromalzellen die Tumormikroumgebung33rekapitulieren.
Trotz dieser Einschränkungen gehören PDX-Modelle nach wie vor zu den wertvollsten Werkzeugen für die translationale Forschung sowie zur personalisierten Medizin zur Auswahl von Patiententherapien. Zu den wichtigsten Anwendungen von PDXgehören gehören die Biomarker-Erkennung und Arzneimitteltests. PDX-Modelle werden auch erfolgreich verwendet, um Arzneimittelresistenzmechanismen zu studieren und Strategien zur Überwindung der Arzneimittelresistenz34,35zu identifizieren. Der in diesem Manuskript beschriebene Ansatz ermöglicht es dem Forscher, potenzielle therapeutische Ziele in menschlichen Tumoren zu identifizieren und die Wirksamkeit entsprechender Medikamente in vivo bei Mäusen zubewerten, die transplantierte Tumoren beherbergen, die zunächst genomisch charakterisiert waren. Das Protokoll verwendet Eierstocktumoren, die intraperitoneal transplantiert werden, ist aber auf jede Art von Tumor anwendbar, der ausreichend aggressiv ist, um bei Mäusen zu wachsen2,3,12.

<table><tbody><tr><td>3M Vetbond</td><td>3M, Co. KG</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Anti-AKT-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>9272</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH-Antikörper (G-9)</td><td>Santa Cruz Biotech. Inc.</td><td>sc-365062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAPK-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>9926</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-AKT-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mTOR-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2972</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-mTOR-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2971</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-S6-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>4858</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rictor-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S6-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2217</td><td></td></tr><tr><td>Captisol</td><td>ChemScene, Inc.</td><td>cs-0731</td><td></td></tr><tr><td>Carboplatin</td><td>NOVAPLUS, Inc.</td><td>61703-360-18</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Easy-A Hi-Fi-PCR-Klonierungsenzym</td><td>Agilent, Inc.</td><td>600404-51</td><td></td></tr><tr><td>Schmiermittel</td><td>Cardinal Healthcare</td><td>82-280</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>356234</tr><tr><td>McCoy's media</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>MK-2206</td><td>ApexBio, Inc.</td><td>A3010</td><td></td></tr><tr><td>MK-8669</td><td>ARIAD Pharmaceuticals, Inc.</td><td></td><td></td>AP23573</tr><tr><td>Nair Sensitive Skin</td><td>Church & Dwight Co.</td><td>Nair Haarentferner Dusche Power Sensitive</td><td></td></tr><tr><td>NOD/SCID Mäuse</td><td>Charles River, Inc.</td><td>nicken. CB17-Prkdcscid/NCrCrl</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>NOVAPLUS, Inc.</td><td>55390-304-05</td><td></td></tr><tr><td>PEG400</td><td>Millipore Sigma, Inc.</td><td>88440-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Perjeta</td><td>Genetech, Co.</td><td>Pertuzumab</td><td></td></tr><tr><td>Rituximab</td><td>Genetech, Co.</td><td>Rituxan</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>SCID-Mäuse Harlan</td><td>Laboratories, Inc.</td><td>C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg</td><td></td></tr><tr><td>SLAx 13-6MHz Linearwandler</td><td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td><td>HFL38xp</td><td></td></tr><tr><td>SonoSite S-Serie Ultraschallgerät</td><td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td><td>SonoSite SII</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Millipore Sigma, Inc.</td><td>Nr. P4780-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

testen von gezielten krebstherapien mit struktureller dna-alterationsanalyse und patientenabgeleiteten xenografts

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Wir präsentieren hier einen integrativen Ansatz zur Erprobung der Wirksamkeit gezielter Therapien, der die Next Generation der Sequenzierungstechnologien, therapeutische Zielanalysen und die Überwachung der Wirkstoffabhängigkeit mit patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) kombiniert. Diese Strategie wurde am Beispiel von Eierstocktumoren validiert. Das Mate-Pair-Protokoll der nächsten Generation (MPseq) wurde verwendet, um strukturelle Änderungen zu identifizieren, und anschließend wurde eine Analyse potenziell zielbarer Änderungen durchgeführt. Menschliche Tumoren, die in immungeschwächten Mäusen angebaut wurden, wurden mit Medikamenten behandelt, die auf der Grundlage der genomischen Analysen ausgewählt wurden. Die Ergebnisse zeigten eine gute Korrelation zwischen den vorhergesagten und den beobachteten Antworten im PDX-Modell. Der vorgestellte Ansatz kann verwendet werden, um die Wirksamkeit von Kombinationsbehandlungen zu testen und personalisierte Behandlungen für Patienten mit wiederkehrendem Krebs zu unterstützen, insbesondere in Fällen, in denen die Standardtherapie fehlschlägt und es notwendig ist, Medikamente außerhalb des Etiketts zu verwenden.

Gewebe aus resezierten Eierstocktumoren zum Zeitpunkt der Entschärlung samten wurden gemäß IRB-Leitfaden gesammelt und für 1) genomische Charakterisierung und 2) Engraftment bei immungeschwächten Mäusen verwendet (Abbildung 1). Mate-pair-Sequenzierungsprotokoll36,37 wurde verwendet, um strukturelle Veränderungen in der DNA einschließlich Verluste, Gewinne und Verstärkungen zu identifizieren. Abbildung 2z...

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Wirksamkeit gezielter Therapien zu testen, die auf der Grundlage der genomischen Zusammensetzung eines Tumors ausgewählt wurden. Das Protokoll beschreibt die Identifizierung und Validierung struktureller DNA-Umlagerungen, die Einplage von Patiententumoren in Mäuse und die Erprobung von Reaktionen auf entsprechende Medikamente.

Testen von gezielten Krebstherapien mit struktureller DNA-Alterationsanalyse und patientenabgeleiteten Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Das hier beschriebene Protokoll soll einen Algorithmus zur Prüfung der Wirksamkeit der Behandlung mit In-vivo-Krebsmodellen demonstrieren. Das Protokoll besteht aus einer Kombination mehrerer Techniken. Die gesamte Genom-Biosequenzierung menschlicher Tumorproben wird verwendet, um genomische Veränderungen zu identifizieren.Dazu gehören sowohl Gen-Rearrangements als auch Änderungen der Anzahl der Genkopien. So wird die Analyse der identifizierten Veränderungen durchgeführt, um potenziell medikamentöse Veränderungen auszuwählen. Die auf der Grundlage der Genomanalyse ausgewählten Medikamente werden dann zur In-vivo-Behandlung entsprechender Tumoren verwendet, die in immungeschwächten Mäusen angebaut werden.Der entwickelte Algorithmus stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Unterstützung von Behandlungsentscheidungen für die Versorgung von Krebspatienten dar. Verwenden Sie das Panda-Tool oder eine analoge Software, um zielfähige Änderungen zu identifizieren. Wir können die Gene auflisten, die durch Mikrosequenzierung identifiziert wurden, die als einfache Tab-delineated Datei mit Standard akzeptierten Gensymbolen resultierte.Fügen Sie das Pfundzeichen zur Kopfzeile der Liste hinzu, um sicherzustellen, dass der Tabellenkopf auf die Pfadebene U der Software übertragen wird. Laden Sie die Datei hoch, indem Sie auf die entsprechende Navigationsregisterkarte klicken. Weisen Sie ein einzelnes Symbol zur Darstellung der zugrunde liegenden Daten zu, indem Sie auf das Symbol ihrer Wahl und dann auf die Registerkarte "Abschließen" klicken.Sobald dann eine Patientendatei hochgeladen wird, zeigen Sie eine Vorschau der Seite an, um eine Spalte zu identifizieren, die die Anzahl der annotierten Gene pro Pfad anzeigt. Dies ist die letzte Spalte auf der rechten Seite. Verwenden Sie einen Pfadfilter in der oberen linken Seite des Hauptfensters, um die Anzahl der angezeigten Pfade auf die Wege zu beschränken, die die geneswichtig enthalten.Um Pfade zu identifizieren, die mehr Gene kommentieren, als zufällig erwartet würden, verwenden Sie eine Funktion unter der Anreicherungsregisterkarte. Anschließend wird der Haupttabelle eine Spalte hinzugefügt, die den entsprechenden p-Wert aus dem genauen Test eines Fishers anzeigt. Wählen Sie die Datenbank aus, um potenzielle drogenfähige Gene aus voreingestellter Anmerkung anzuzeigen, indem Sie ein entsprechendes Symbol auf der linken Seite des Hauptfensters überprüfen.Um einen Pfad für die Visualisierung auszuwählen, klicken Sie auf den Namen, der auf der Seite "Pfad-Viewer" angezeigt wird. Symbole, die jeden Anmerkungssatz darstellen, werden neben dem zugeordneten Gen angezeigt. Wenn Sie auf ein beliebiges Gen im Pfad klicken, wird die entsprechende Seite der Genkarten geöffnet.Wählen Sie die Wege aus, die annotierte Gene von Interesse und Treffer für potenzielle Medikamente für weitere Analysen zeigten. Führen Sie die Gewebearbeit in einer laminaren Strömungshaube durch, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Legen Sie das Tumorgewebe in eine Schale, die kalte PBS oder Gewebekulturmedien wie RPMI, DMEM enthält und Antibiotika enthält.Identifizieren und isolieren Sie lebensfähiges Tumormaterial aus angrenzendem normalen und nekrotischen Gewebe mit Hilfe eines Pathologen. Verwenden Sie sterile Zangen und Skalpell, um nekrotisches Material zu entfernen, auf das ein Pathologe hingewiesen hat. Um subkutane Engraftment durchzuführen, schneiden Sie das Tumorgewebe mit sterilen Zangen, Skalpell oder chirurgischen Scheren in kleine Fragmente, etwa 2 x 2 x 2 Millimeter groß.Übertragen Sie das fragmentierte Gewebe auf Eis in eine vorgekühlte Petrischale. Lassen Sie kalte Matrigel in die Schale mit dem fragmentierten Gewebe, etwa 200 Mikroliter pro 10 Stück Gewebe. Gut mischen und die Gewebefragmente 10 Minuten im Matrigel einweichen lassen.Verwenden Sie sterile chirurgische Schere und Zangen, um einen 5-10 Millimeter vertikalen Hautschnitt an beiden Flanken einer Maus zu machen. Setzen Sie gerade Zangen sanft in den subkutanen Raum ein, um eine Tasche zu schaffen, die groß genug ist, um ein Tumorfragment unter das Fettpolster zu legen. Verwenden Sie sterile gerade Zangen, um Tumorfragmente in die zuvor vorbereitete Tasche in jeder von fünf Mäusen einzufügen.Schließen Sie den Hautschnitt mit Gewebekleber. Nach der Implantation, um die Lymphozytenproliferation zu hemmen, injizieren Sie jede Maus mit 100 Mikroliter Rituximab. Bereiten Sie die Maus für die orale Gavage vor, indem Sie die Haut des Rückens kneifen und sie nach hinten biegen, so dass der Kopf und die Lippen der Maus bewegungsunfähig sind.Setzen Sie die Gavage-Sonde an der Rückseite der Mauskehle ein, bis die Sonde die Speiseröhre erreicht. Stellen Sie sicher, dass die Sonde nicht zu weit eingesetzt wird, da die Lunge der Maus den Tod verursachen kann. Der repräsentative Genomschwimmer veranschaulicht die Landschaft genomischer Veränderungen in einem Tumor.Typisch für hochgradige Serosubtyp-Tumoren, mehrere Gewinne blaue Linien und Verluste rote Linien, wurden identifiziert, die ein hohes Maß an genomischer Instabilität. Die Top-Trend-Veränderung für therapeutische Interventionen im OC101-Tumor war eine Amplifikation am Chromosom 17, bei der ERBB2, ein Gen, das für HER2-Rezeptorkodiert ist, beteiligt war. Um die Ergebnisse auf DNA-Ebene zu validieren, wurden mehrere Sätze spezifischer Primer für die Ränder des verstärkten Bereichs entwickelt.Und PCR wurde durchgeführt. Bei der Verwendung der Kontrolle der menschlichen DNA wurde kein Amplifikationsprodukt absorbiert. Für OC101-Tumor-DNA wurden spezifische Bänder identifiziert.In einem anderen Variantentumor, T14, wurden zahlreiche DNA-Gewinne beobachtet. Dazu gehörten AKT2 in RICTOR-Genen. Die Validierung auf Proteinebene mit Immunoblotting zeigte einen hohen AKT-Gehalt in RICTOR.Eine signifikante Verringerung der Tumorbelastung wurde in der chemotherapiebehandelten Gruppe bis zum Ende der sechsten Woche beobachtet. Es gab einen zusätzlichen Nutzen gegenüber der Chemotherapie allein in den Gruppen, die eine Kombinationsbehandlung erhielten. Tumorgewebe wurde für die molekulare Analyse des Behandlungsreaktionens am Ende der Behandlungsstudie gesammelt.Die Gesamt- und Phosphorylatwerte von S6, AKT und mTOR wurden mittels Immunoblotting ermittelt. Der Vergleich der Konzentrationen dieser Proteine in unbehandelten, chemotherapiebehandelten und mit AKT- oder mTOR-Hemmerbehandelten behandelten Proteinen zeigte bei den beiden letztgenannten eine deutliche Abnahme. Der vorgestellte Ansatz ist sehr nützlich, um die klinische Studie in PDX-Modellen durchzuführen.Es nutzt die molekularen Eigenschaften des Tumors, wie durch genomische Profilierung erhalten, um die beste Wahl von Medikamenten für Tests zu bestimmen.

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Forschung

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Krebsforschung

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