Name: Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Lernen Sie die multiplexierte Einzelzell-mRNA-Sequenzierung zur Genexpressionsanalyse in Mausembryonalzellen. Diese kosteneffiziente Methode reduziert Batch-Effekte und ermöglicht gleichzeitige Probenanalyse.

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Wir danken David M. Patterson und Christopher S. McGinnis vom Labor Dr. Zev J. Gartner für ihre Art und Weise der Bereitstellung der lipidbasierten Barcoding-Reagenzien und Vorschläge zu den experimentellen Schritten und der Datenanalyse. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (HL13347202) gegründet.

<ol><li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877(2008).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377(2009).</li>
<li>Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiovascular+lineage+descendants+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution.</a> Development. 142 (5), 846-857 (2015).</li>
<li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+expression+analysis+reveals+anatomical+and+cell+cycle-dependent+transcriptional+shifts+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development.</a> Development. 146 (12), dev173476(2019).</li>
<li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reconstructs+fate+conversion+from+fibroblast+to+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte.</a> Nature. 551 (7678), 100(2017).</li>
<li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 1, (2018).</li>
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<li>Grün, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+single-cell+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of single-cell sequencing experiments.</a> Cell. 163 (4), 799-810 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17 (1), 77(2016).</li>
<li>Islam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+single-cell+transcriptional+landscape+by+highly+multiplex+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq.</a> Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018).</li>
<li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MULTI-seq%3A+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 1, (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224(2018).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Agilent 4200 TapeStation System. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019).</li>
<li>SPRIselect User Guide. , Beckman Coulter. https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012).</li>
<li>Qubit 4 Fluorometer User Guide. , Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018).</li>
<li>Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016).</li>
<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411(2018).</li>
<li>Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+fatty-acid+modified+oligonucleotides+to+live+cell+membranes+through+stepwise+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly.</a> Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).</li>
<li>Single Cell Protocols Cell Preparation Guide. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

In dieser Studie haben wir ein Protokoll zur Analyse von einzelzelligen Transkriptionsprofilen demonstriert. Wir haben auch zwei optionale Methoden für Multiplex-Proben im scRNA-Seq-Workflow bereitgestellt. Beide Methoden haben sich in verschiedenen Labors als machbar erwiesen und Lösungen für ein kostengünstiges und batcheffektfreies Einzelzellexperiment18,26geliefert.
Es gibt ein paar Schritte, die sorgfältig befolgt werden sollten, ...

Das Transkriptionsprofil jeder einzelnen Zelle variiert zwischen den Zellpopulationen während der embryonalen Entwicklung. Obwohl die einzelne molekulare In-situ-Hybridisierung verwendet werden kann, um die Expression einer kleinen Anzahl von Genen1zu visualisieren, bietet die einzellige mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) einen unvoreingenommenen Ansatz zur Veranschaulichung genomweiter Expressionsmuster von Genen in Einzelzellen. Nach der erstveröffentlichung im Jahr 20092wurde scRNA-Seq in den letzten Jahren zur Untersuchung mehrerer Gewebe in mehreren Entwicklungsstadienangewendet 3,4,5. Da der Atlas der menschlichen Zellen in jüngster Zeit seine entwicklungsorientierten Projekte gestartet hat, werden in naher Zukunft weitere Einzelzelldaten aus menschlichen embryonalen Geweben erwartet.
Das Herz als erstes Organ, das sich entwickelt, spielt eine entscheidende Rolle bei der embryonalen Entwicklung. Das Herz besteht aus mehreren Zelltypen und die Entwicklung jedes Zelltyps ist zeitlich und räumlich streng reguliert. In den letzten Jahren wurden der Ursprung und die Zellabstammung von Herzzellen in frühen Entwicklungsstadien charakterisiert6, die ein enormes nützliches Navigationswerkzeug für das Verständnis der angeborenen Krankheitspathogenese bieten, sowie für die Entwicklung technologisch fortschrittlicherer Methoden zur Stimulierung der Kardiomyozytenregeneration7.
Der scRNA-Seq hat sich in den letzten Jahren rasant erweitert8,9,10. Mit den neu entwickelten Methoden ist design und analysis of single cell experiments um11,12,13,14erreichbarer geworden. Die hier vorgestellte Methode ist ein kommerzielles Verfahren, das auf den Tröpfchenlösungen basiert (siehe Materialtabelle)15,16. Diese Methode verfügt über die Erfassung von Zellen und Sets von eindeutig barcoded Perlen in einem Öl-Wasser-Emulsionströpfchen unter der Kontrolle eines mikrofluidischen Steuerungssystems. Die Rate der Zellbelastung in die Tröpfchen ist extrem niedrig, so dass die Mehrheit der Tröpfchenemulsionen nur eine Zelle17enthält. Das ausgeklügelte Design des Verfahrens ergibt sich aus der Einzelzelltrennung in Tröpfchenemulsionen, die gleichzeitig mit Barcoding auftreten, was die parallele Analyse einzelner Zellen mit RNA-Seq an einer heterogenen Population ermöglicht.
Die Integration von Multiplexing-Strategien ist eine der wichtigen Ergänzungen des traditionellen Einzelzell-Workflows13,14. Diese Ergänzung ist sehr nützlich, um Zelldoublets zu verwerfen, die experimentellen Kosten zu senken und Batcheffekte zu eliminieren18,19. Eine lipidbasierte Barcoding-Strategie und eine Antikörper-basierte Barcoding-Strategie (siehe Tabelle der Materialien) sind die beiden meist verwendeten Multiplexing-Methoden. Bestimmte Barcodes werden verwendet, um jedes Beispiel in beiden Methoden zu beschriften, und die beschrifteten Proben werden dann für die Einzelzellenerfassung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung gemischt. Anschließend können die gepoolten Sequenzierungsdaten durch Analyse der Barcodesequenzen getrennt werden (Abbildung 1)19. Zwischen den beiden Methoden bestehen jedoch erhebliche Unterschiede. Die lipidbasierte Barcoding-Strategie basiert auf lipidmodifizierten Oligonukleotiden, die keine Zelltyppräferenzen haben. Während die Antikörper-basierte Barcoding-Strategie kann nur die Zellen, die die Antigen-Proteine19,20. Darüber hinaus dauert es etwa 10 min, um die Lipide zu färben, aber 40 min, um die Antikörper zu färben (Abbildung 1). Darüber hinaus sind die lipidmodifizierten Oligonukleotide billiger als antikörperkonjugierte Oligonukleotide, aber zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels nicht kommerziell erhältlich. Schließlich kann die Lipid-basierte Strategie 96-Proben in einem Experiment multiplexen, aber die Antikörper-basierte Strategie kann derzeit nur Multiplex 12 Proben.
Die empfohlene Zellzahl zum Multiplex in einem einzigen Experiment sollte niedriger als 2,5 x 104sein, da sie andernfalls zu einem hohen Anteil an Zelldoublets und einer potenziellen mRNA-Kontamination in der Umgebung führt. Durch die Multiplexing-Strategien werden die Kosten für die Einzelzellerfassung, cDNA-Generierung und Bibliotheksvorbereitung für mehrere Samples auf die Kosten für eine Probe reduziert, aber die Sequenzierungskosten bleiben gleich.

<table><tbody><tr><td>10% Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Chiphalter</td><td>10x Genomics</td><td>120252 330019</td><td></td></tr><tr><td>10x Chromium Controller</td><td>10x Genomics</td><td>120223</td><td></td></tr><tr><td>10x Magnetseparator</td><td>10x Genomics</td><td>120250 230003</td><td></td></tr><tr><td>10x Vortex Adapter</td><td>10x Genomics</td><td>330002, 120251</td><td></td></tr><tr><td>10x Vortex Clip</td><td>10x Genomics</td><td>120253 230002</td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation-System</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td></tr><tr><td>Barcode Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Einzelsträngige DNA</td><td>25 nmol</td></tr><tr><td>Puffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>CD1 Mäuse</td><td>Chales River</td><td>Stamm Code 022</td><td>bestellt trächtige Mäuse</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5424R</td><td>Appendorf</td><td>2231000214</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>1000073</td><td>Bei Umgebungstemperatur lagern</td></tr><tr><td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>120262</td><td>lagern bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>1000094</td><td>Lagern bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' Library Kit v3</td><td>10x Genomics</td><td>1000095</td><td>Lagern bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Chrom Single Cell 3' v3 Gel Beads</td><td>10x Genomics</td><td>2000059</td><td>Lagern bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Kollagenase A</td><td>Sigma/Millipore</td><td>10103578001</td><td>Pulver bei 4 & Grad lagern; C, lagern bei -20 & Grad; C nach dem Auflösen</td></tr> von <tr><td>Kollagenase B</td><td>Sigma/Millipore</td><td>11088807001</td><td>Pulver bei 4 & Grad lagern; C, lagern bei -20 & Grad; C nach dem Auflösen</td></tr><tr><td>von D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431021</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube Mikrozentrifugenröhrchen, 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431048</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne SILANE</td><td>10x Genomics</td><td>2000048</td><td>Bei 4 Grad lagern; C, verwendet in Beads Cleanup Mix (Tabelle 1)</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Theromo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, rein (200 Proof, wasserfrei)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL High Clarity PP Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning Cellgro</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL High Clarity PP Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning Cellgro</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, United States</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>Store bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Finnpipette F1 Mehrkanalpipetten, 10-100&mu; l</td><td>Theromo Scientific</td><td>4661020N</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F1 Mehrkanalpipetten, 1-10&mu; l</td><td>Theromo Scientific</td><td>4661000N</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi Zellsieb</td><td>Sigma</td><td>BAH136800040</td><td>Porosität 40 &mu; m, für 1000 μl Pipettenspitzen, Packung mit je 50</td></tr><tr><td>Glycerin (Glycerin), 50% (v/v)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain FcX (Fc-Rezeptor-Blockierungslösung)</td><td>BioLegend</td><td>422301</td><td>Hinzufügen 5 & Mikro; l humanes TruStain FcX pro Million Zellen in 100 & Mikro; l Färbevolumen</td></tr><tr><td>Isopropanol (IPA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0295239</td><td>Bei -20 & Grad lagern; C, wird in einer Mischung aus Lipid-getaggten Barcode-Bibliotheken verwendet (Tabelle 1)</td></tr><tr><td>Lipid-Barcode-Primer (Multi-Seq-Primer)</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>Einzelsträngige DNA</td><td>100 nmol</td></tr><tr><td>Puffer mit niedrigem TE-Gehalt (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>MasterCycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950W</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser (Ambion)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen 0,2 ml 8-Röhrchen-Streifen</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1X ohne Calcium & Magnesium</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 10% Rinderalbumin (Alternative zum Thermo Fisher Produkt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0036</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 4er-Pack (0,1&ndash; 2,5 Mio. Jahre L, 0,5-10 μm; L, 10&ndash; 100 Mio. Jahre L, 100&ndash; 1.000 μm L Pipetten mit variablem Volumen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>Selection Reagenz (SPRIselect Reagenzienkit)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23318 (60ml)</td><td></td></tr><tr><td>Template Switch Oligo</td><td>10x Genomics</td><td>3000228</td><td>Lagern bei -20 &deg; C, wird im Master Mix verwendet (Tabelle 1)</td></tr><tr><td>Die Antikörper-basierte Barcoding-Strategie wird auch als Cell Hashing</td><td></td><td></td><td></td>bezeichnet</tr><tr><td>Der Zellbrowser ist Loup Cell Browser</td><td>10x Genomics</td><td></td><td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser" target="_blank">https://support.10xgenomics. com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser</a></td></tr><tr><td>Die kommerziell verfügbare Analyse-Pipline in Schritt 8.1 ist Cell Ranger</td><td>10x Genomics</td><td></td><td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/ latest/what-is-cell-ranger</a></td></tr><tr><td>Die lipidbasierte Barcoding-Strategie ist auch als MULTI-seq</td><td></td><td></td><td></td>bekannt</tr><tr><td>. Die gut gepflegte R-Plattform ist Seurat V3</td><td>satijalab</td><td></td><td><a href="https://satijalab.org/seurat/" target="_blank">https://satijalab.org/seurat/</a></td></tr><tr><td>TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL Ultra Low Retention Filter Pipettenspitze</td><td>USA Scientific</td><td>1180-3710</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1000 ul XL Ultra Low Retention Filter Pipettenspitze</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1730</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 ul Ultra Low Retention Filter Pipettenspitze</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8710</td><td></td></tr><tr><td>TotalSeq-A0301 Anti-Maus Hashtag 1 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>155801</td><td>0,1 - 1,0 &micro; g Antikörper in 100 & Mikro; l Färbepuffer pro 1 Million Zellen</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0302 Anti-Maus Hashtag 2 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>155803</td><td>0,1 - 1,0 &micro; g Antikörper in 100 & Mikro; l Färbepuffer pro 1 Million Zellen</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0302 Anti-Maus Hashtag 3 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>155805</td><td>0,1 - 1,0 &micro; g Antikörper in 100 & Mikro; l Färbepuffer pro 1 Million Zellen</td></tr><tr><td>TrueSeq RPI-Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Einzelsträngige DNA</td><td>100 nmol, verwendet in einem Lipid-tagged Barcode Library Mix (Tabelle 1)</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenolrot</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Universal I5</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Einzelsträngige DNA</td><td>100 nmol</td></tr></tbody></table>

multiplexed single cell mrna sequenzierungsanalyse von mausembryonalzellen

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Die einzellige mRNA-Sequenzierung hat in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte gemacht und ist zu einem wichtigen Instrument auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie geworden. Es wurde erfolgreich verwendet, um seltene Zellpopulationen zu identifizieren, neue Markergene zu entdecken und räumliche und zeitliche Entwicklungsinformationen zu entschlüsseln. Die Einzelzellmethode hat sich in den letzten zwei bis drei Jahren auch von der mikrofluidischen Fluidigm C1-Technologie zu den Tropfen-basierten Lösungen entwickelt. Hier haben wir das Herz als Beispiel verwendet, um zu zeigen, wie man die embryonalen Gewebezellen der Maus mit der tröpfchenbasierten scRNA-Seq-Methode profiliert. Darüber hinaus haben wir zwei Strategien in den Workflow integriert, um mehrere Samples in einem einzigen Experiment zu profilieren. Mit einer der integrierten Methoden haben wir gleichzeitig mehr als 9.000 Zellen aus acht Herzproben profiliert. Diese Methoden werden für den Bereich der Entwicklungsbiologie wertvoll sein, indem sie eine kostengünstige Möglichkeit bieten, einzelne Zellen aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen, Entwicklungsstadien oder anatomischen Orten gleichzeitig zu profilieren.

In dieser Studie verwendeten wir mausembryonales Herz als Beispiel, um zu zeigen, wie multiplexierte einzelzellige mRNA-Sequenzierung durchgeführt wurde, um die verschiedenen Proben aus separaten Teilen eines Organs gleichzeitig zu verarbeiten. E18.5 CD1 Mausherzen wurden isoliert und in linkes Atrium (LA), rechtes Atrium (RA), linke Herzkammer (LV) und rechte Herzkammer (RV) seziert. Die vorgerichtlichen und ventrikulären Zellen wurden dann unabhängig mit einem lipidbasierten Barcoding-V...

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Die mRNA-Sequenzierung mit einzelligen Zellen wird häufig verwendet, um die biologischen Prozesse auf einer einzelnen Zellebene zu verstehen. Das Aufkommen von Multiplexing-Strategien hat seine Amplifikationen weiter erweitert, indem es die Profilerstellung mehrerer Proben in einem einzigen Experiment ermöglicht, die Kosten drastisch reduziert und die Batch-Effekte vermieden hat. Demonstriert wird das Verfahren von Wei Feng, einem Postdoc, und Andrew Przysinda, einem Techniker aus meinem Labor.Nach dem Zählen die zellenisoliert vom embryonalen Tag 18,5 Herzkammern in fünf mal 10 bis die fünften Aliquoten und waschen Sie die Zellen zweimal mit frischen PBS pro Wäsche. Setzen Sie die Pellets in 180 Mikroliter PBS pro Probe wieder auf und fügen Sie 20 Mikroliter Anker-Barcode-Lagerlösung zu jedem Rohr mit sanftem Mischen hinzu. Nach einer fünfminütigen Inkubation auf Eis 20 Mikroliter Co-Anchor Barcode Stock Lösung zu jedem Rohr mit sanfter Mischung für eine zusätzliche fünfminütige Inkubation auf Eis hinzufügen, bevor Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter kalten PBS mit 1% Rinderserumalbumin pro Wäsche waschen, dann filtern Sie die Proben in neue Röhren durch ein 40-Mikrometer-

multiplexed-single-cell-mrna-sequencing-analysis-mouse-embryonic

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Einzel-Zell-Expression Profiling ermöglicht die detaillierte Genexpressionsanalyse einzelner Zellen. Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Kardiomyozyten, und die Vorbereitung der daraus resultierenden Lysate entweder für ganze Transkriptom-Mikroarray oder qPCR der spezifischen Ziele.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Wir beschreiben eine Technik zur Profilierung von microRNAs in frühen Mausembryonen. Dieses Protokoll überwindet die Herausforderung des niedrigen Zelleingangs und der kleinen RNA-Anreicherung. Dieser Assay kann verwendet werden, um Veränderungen in der miRNA-Expression im Laufe der Zeit in verschiedenen Zelllinien des frühen Mausembryons zu analysieren.

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

Hier zeigen die Autoren den Nutzen von MULTI-seq für die Phänotypisierung und nachfolgende gepaarte scRNA-seq und scATAC-seq bei der Charakterisierung der transkriptomischen und chromatinischen Zugänglichkeitsprofile in der Netzhaut.

Multiplexe Analyse der retinalen Genexpression und der Chromatinzugänglichkeit mittels scRNA-seq und scATAC-seq

In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Dieses Protokoll kombiniert Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, um Mikrogliazellzustände im Kleinhirn von frühen postnatalen Mäusegehirnen zu isolieren und zu charakterisieren. Es verwendet enzymatische Dissoziation, Percoll-Zentrifugation und Immunfärbung, um die Heterogenität der Mikroglia aufzudecken und das Verständnis ihrer Rolle bei der Kleinhirnentwicklung und -erkrankung zu verbessern.

Durchflusszytometrie und Einzelzellanalyse zur Charakterisierung der Mikroglia-Aktivierung in der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Mäusen

Dieses Protokoll bietet eine optimierte rechnerische Pipeline zur Quantifizierung von naszierenden Enhancer-Transkripten. Durch die Integration von Chromatinzugänglichkeit, Chromatinmerkmal und Transkriptionsdaten ermöglicht es einen genauen Nachweis und eine strangspezifische Analyse der Enhanceraktivität in komplexen intragenen Regionen, während es für Forscher ohne umfangreiche bioinformatische Ausbildung zugänglich bleibt.

Eine computergestützte Pipeline für die Quantifizierung intergener/intragener Enhancer-RNA in embryonalen Stammzellen der Maus

Mutationen, die zu angeborenen Herzfehlern führen, profitieren von der in vivo Untersuchung der Herzstruktur während der Entwicklung, aber hochauflösende Strukturstudien im embryonalen Herzen der Maus sind technisch anspruchsvoll. In dieser Arbeit stellen wir eine robuste Immunfluoreszenz- und Bildanalysemethode vor, um Kardiomyozyten-spezifische Strukturen im sich entwickelnden Mausherz zu beurteilen.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

Die experimentelle Validierung der Enhancer-Aktivität erfolgt am besten durch eine Funktionsverlustanalyse. Hier wird ein effizientes Protokoll vorgestellt, das die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion verwendet, um die allelspezifische Regulation der Gentranskription in F1-ES-Zellen zu untersuchen, die ein Hybridgenom (Mus musculus129 x Mus castaneus) enthalten.

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Lernen Sie die multiplexierte Einzelzell-mRNA-Sequenzierung zur Genexpressionsanalyse in Mausembryonalzellen. Diese kosteneffiziente Methode reduziert Batch-Effekte und ermöglicht gleichzeitige Probenanalyse.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

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