Name: Bewertung der akuten Wundheilung mit den dorsalen subkutanen Polyvinylalkoholschwammimplantation und Exzisional Tail Skin Wound Models. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Lernen Sie zwei murine Wundheilungsmodelle kennen: den PVA-Schwamm zur Analyse von Leukozyten und das Schwanzhaut-Exzisionsmodell zur Visualisierung langsamer Wundheilung. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung zellulärer und zytokinischer Kinetiken.

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Die Autoren danken Kevin Carlson von der Brown University Flow Cytometry and Sorting Facility für die Beratung und Unterstützung bei Flow Cytometry-Experimenten. Bilder in Abbildung 1B und C wurden mit BioRender erstellt. Kayla Lee und Gregory Serpa wird für ihre fotografische Unterstützung gedankt. Diese Arbeit wurde durch Stipendien von folgenden unterstützt: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean es Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Training in Environmental Pathology) und der Brown University Research Seed Award.

Alle hier beschriebenen Tierstudien wurden vom Brown University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren der National Institutes of Health durchgeführt.  HINWEIS: Im Video wurde der chirurgische Vorhang zu Demonstrationszwecken weggelassen.
1. Subkutane Implantation von PVA-Schwämmen
<ol><li>Verwenden Sie Scheren, um Blätter aus PVA-Schwamm in 8 mm x 8 mm x 4 mm Stücke zu schneiden. Rehydrieren Sie die Stücke des PVA-Schwamms, indem Sie sie in sterile 1x PBS in einem Becher untertauchen.</li>
	<li>Autoclavdiedie Schwämme in 1x PBS zu sterilisieren, und vollständig abkühlen. Autoklavierte Schwämme in sterilen 1x PBS bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Vor der chirurgischen Implantation, aliquot die notwendige Anzahl von Schwämmen in eine sterile Kulturschale unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Strömungshaube. Bewahren Sie die zusätzlichen Schwämme in sterilen 1x PBS bei 4 °C für die zukünftige Verwendung auf. Stellen Sie sicher, dass die Schwämme nach der Rehydrierung auf 1 cm x 1 cm x 0,5 cm anschwellen. Ein Bild von dehydrierten PVA-Schwämmen ist in Abbildung 1Adargestellt. HINWEIS: Um die Sterilität der chirurgischen Stelle zu erhalten, erfordert das PVA-Schwammimplantationsverfahren eine Person, um die Maus zu behandeln und die chirurgische Stelle vorzubereiten, und eine zweite Person, um die Implantation durchzuführen.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie eine 8-12 Wochen alte männliche C57BL/6J Maus durch intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin. 40 mg/kg Xylazin intraperitoneal zur Analgesie verabreichen.  Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch den Verlust eines Pedalreflexes. Bereiten Sie die chirurgische Stelle vor, indem Sie das Haar entlang des Dorsums mit Clippern entfernen. Mit steriler Gaze, Povidon-Jod-Lösung auf den Rasierbereich 2x auftragen, gefolgt von 70% Ethanol.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf sterile chirurgische Vorhänge. Legen Sie ein beheiztes Pad unter die chirurgischen Vorhänge, um die Kerntemperatur der Maus zu halten.</li>
	<li>Tragen Sie sterile chirurgische Handschuhe für die Durchführung der Operation. Ziehen Sie die dorsale Haut mit Zangen vom darunter liegenden Gewebe weg und machen Sie mit einer sterilen chirurgischen Schere einen 2 cm großen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie ca. 2 cm vordere Richtung zur Basis des Schwanzes. Während Sie den Schnitt mit steriler Zange offen halten, verwenden Sie eine sterile gekrümmte, stumpfe chirurgische Schere, um eine subkutane Tasche entlang des Dorsums in einer der in Abbildung 1Bangegebenen Positionen zu bilden.</li>
	<li>Verwenden Sie weiterhin Zangen, um die Haut vom darunter liegenden Gewebe wegzuheben. Mit steriler chirurgischer Schere, drücken Sie vorsichtig einen PVA-Schwamm in der Kulturschale, um überschüssige PBS zu entfernen. Nehmen Sie den PVA-Schwamm um eine Ecke mit einer sterilen chirurgischen Schere und legen Sie den Schwamm mit der Ecke, die von der Schere gehalten wird, in die in Schritt 1.4 gebildete subkutane Tasche.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang 5x und legen Sie insgesamt sechs Schwämme in subkutane Taschen, wie in Abbildung 1Bdargestellt.</li>
	<li>Kneifen Sie die eingeschnittene Rückenhaut mit steriler Zange zusammen und schließen Sie den Schnitt mit zwei Edelstahl-Wundclips.</li>
	<li>Verwenden Sie einen neuen Satz steriler chirurgischer Instrumente für jede Maus. Alternativ können Sie einen Perlensterilisator verwenden, um Instrumente zwischen Mäusen zu sterilisieren.</li>
</ol>2. Isolierung von Flüssigkeiten aus PVA-Schwämmen
<ol><li>Um das akute Zytokinmilieu zu bewerten, isolieren Sie Schwämme zwischen 1 und 14 Tagen nach der Implantation.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Flüssigkeitssammelrohr vor, indem Sie den Lauf einer 5 ml Spritze in ein 16 ml Kulturrohr verschachteln.</li>
	<li>Euthanisieren Sie eine Maus mit implantierten PVA-Schwämmen durch CO2-Erstickung, gefolgt von zervikaler Dislokation. </li>
	<li>Entfernen Sie die chirurgischen Klammern und öffnen Sie den Schnitt mit zahngezahnten Zangen. Verwenden Sie eine Schere, um den Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie zu verlängern.</li>
	<li>Mit Zangen einen Schwamm aus seiner subkutanen Tasche extrahieren und in den vorbereiteten Spritzenfass geben, wobei darauf geachtet wird, den Druck auf den Schwamm zu minimieren. Entkortieren Sie alle Bindegewebe, das an der Oberfläche des Schwamms haftet. Verwenden Sie eine Schere, um den Schwamm aus dem umgebenden Gewebe zu sezieren, wenn nötig. Wiederholen Sie den Schwammentfernungsprozess mit den restlichen Schwämmen. Legen Sie das Rohr mit den Schwämmen auf Eis.</li>
	<li>Um die Wundflüssigkeit zu isolieren, zentrieren Sie das Kulturrohr, das die 5 ml Spritze enthält, mit den Schwämmen bei 700 x g für 10 min.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation die Spritze und die Schwämme entsorgen. Die Wundflüssigkeit wird sich in der 16 ml Kulturröhre gesammelt haben. Ein repräsentatives Bild der Flüssigkeit, die aus einer Wunde am Tag 7 gesammelt wurde, ist in Abbildung 1Ddargestellt. Übertragen Sie die Wundflüssigkeit zur Langzeitlagerung bei -80 °C in ein Sauberes Rohr.</li>
</ol>3. Isolierung von Zellen aus PVA-Schwämmen
<ol><li>Um das akute wundheilende Zellmilieu zu bewerten, sammeln Sie Schwämme zwischen 1–14 Tagen nach der Implantation. Schwämme, die 7 Tage nach der Implantation aus einer Wunde gewonnen wurden, sind in Abbildung 1Edargestellt.</li>
	<li>Bereiten Sie Sammelmedium mit 1x HBSS (+Calcium/+Magnesium/-Phenol rot) vor, das mit 1% FBS, 1% HEPES und 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt wird.</li>
	<li>Aliquot 5 ml HBSS-Sammelmedium in ein 15 ml konisches Rohr.</li>
	<li>Extrahieren Sie die PVA-Schwämme von eingeschläferten Mäusen, wie in 2.2–2.4 beschrieben. Legen Sie die Schwämme in das konische Rohr mit 5 ml HBSS-Sammelmedium.</li>
	<li>Übertragen Sie die Schwämme und das HBSS-Sammelmedium in einen 80 ml Mixerbeutel durch Gießen. Hängen Sie den Mixerbeutel aus der Luke des Paddelmixers, so dass die Paddel die Schwämme und Medien treffen. Passen Sie die Einstellungen des Paddelmixers so an, dass er 60 s hoch läuft. Drücken Sie den Start.</li>
	<li>Übertragen Sie die Medien aus dem Mixerbeutel mit einer Pipette zurück auf das 15 ml konische Rohr und lassen Sie die Schwämme im Beutel zurück. Drücken Sie die Schwämme, um die Medien gründlich freizugeben. Passen Sie die Einstellungen des Paddelmixers so an, dass er 30 s hoch läuft. Fügen Sie 5 ml Medien in den Mixerbeutel und wiederholen Sie den Magenprozess 2x für insgesamt drei Schwammwasachten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 250 x g für 5 min. Ein rotes Pellet aus Zellen und roten Blutkörperchen wird nach der Zentrifugation am Boden des konischen Röhrchens sichtbar sein.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und führen Sie eine rote Blutzelllyse durch: Fügen Sie 900 l dH2O in das Zellpellet und die Pipette ein, um sie zu mischen. Neutralisieren Sie mit 100 l mit 10x PBS. Fügen Sie 4 ml 1x PBS in das Rohr, um die Lyse vollständig zu neutralisieren, dann Zentrifuge bei 250 x g für 5 min. HINWEIS: Der Lyseschritt sollte kurz sein; Das Wasser mehr als 3-5 s in Kontakt mit den Zellen zu lassen, kann zu einer Lyse nicht-roter Blutkörperchen führen.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation wird ein weißes Zellpellet mit Wundzellen ohne rote Blutkörperchen am Boden des konischen Röhrchens vorhanden sein. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet im gewünschten Medium für nachgeschaltete Analysen wieder aus.</li>
</ol>4. Optionale Durchflusszytometrie-Analyse von angeborenen Leukozyten, die aus PVA-Schwammwunden isoliert sind
<ol><li>0,5–1 x 106 Wundzellen in 25 l einer 2x-Lösung von blockierendem Antikörper, der 10 g/ml Anti-CD16/CD32 FCR-II/III-Antikörper enthält, in 1x PBS + 1% BSA verdünnt. HINWEIS: Alle Antikörper sollten titriert werden, um optimale Konzentrationen für die Durchflusszytometrieanalyse zu bestimmen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit blockierendem Antikörper für 10 min auf Eis.</li>
	<li>Machen Sie einen 2x Master-Mix von Antikörpern, die 2,5 mg/ml PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/ml FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F und 10 mg/ml eFluor660-F4-80 in 1x PBS + 1% BSA verdünnt enthalten. Fügen Sie den Zellen, die in blockendem Antikörper brüten, direkt 25 l des Antikörpercocktails hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen für 20 min auf Eis, vor Licht geschützt.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 2x mit 1x PBS.</li>
	<li>Machen Sie eine Master-Mischung aus amin-reaktive fixierbare Lebensfähigkeit Farbstoff-eFluor506 verdünnt 1:1.000 in 1x PBS. Setzen Sie das Zellpellet in 50 l der Lebensfähigkeitsfarbstofflösung wieder auf. HINWEIS: Serum muss von der fixierbaren Lebensfähigkeitsstufe ausgeschlossen werden, da es die Bindung des Farbstoffs an endogene Proteine verhindert. Inkubieren Sie die Zellen für 20 min auf Eis, vor Licht geschützt.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 2x mit 1x PBS. Setzen Sie das Zellpellet in 50 l mit 1% Paraformaldehyd aus.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 1% Paraformaldehyd für 15 min auf Eis, geschützt vor Licht.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 1x mit 1x PBS und setzen Sie das Pellet in 1x PBS für die zytometrische Durchflussanalyse wieder auf.</li>
</ol>5. Schwanzhautexzision
<ol><li>Anästhetisieren Sie eine 8-12 Wochen alte männliche C57BL/6J Maus durch intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin. 40 mg/kg Xylazin intraperitoneal zur Analgesie verabreichen. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch den Verlust eines Pedalreflexes.</li>
	<li>Bereiten Sie die chirurgische Stelle am Schwanz der anästhesierten Maus vor, indem Sie sterile Gaze verwenden, um Povidon-Jod-Lösung 2x aufzutragen, gefolgt von einer Anwendung von 70% Ethanol.</li>
	<li>Definieren Sie einen 10 mm x 3 mm Abschnitt auf der dorsalen Oberfläche des Schwanzes, 10 mm von der Basis des Schwanzes (Abbildung 1C) mit einem permanenten Marker, um von einer vorgefertigten Schablone zu verfolgen.</li>
	<li>Legen Sie die anästhesierte Maus auf sterile chirurgische Vorhänge.</li>
	<li>Tragen Sie sterile chirurgische Handschuhe, um die chirurgischen Eingriffe durchzuführen. Mit einer sterilen Skalpellklinge, machen Sie einen vollen Dicke Schnitt entlang der rechten, unteren und linken Ränder des Wundbereichs.</li>
	<li>Mit sterilen Zangen, schälen Sie die ausgeschnittene Haut weg vom Schwanz, und verwenden Sie sterile chirurgische Schere, um den oberen Rand des Wundbereichs zu schneiden.</li>
	<li>Drücken Sie mit steriler Gaze, um die Blutung zu stoppen.</li>
	<li>Tragen Sie einen Sprühbarrierefilm auf das Wundbett auf.</li>
	<li>Fotografieren Sie die Wunden in regelmäßigen Zeitabständen aus einem festen Abstand. Analysieren Sie Fotos durch planimetrische Analyse, um Wundbereichsmessungen zu bestimmen. Alternativ können Sie Sättel verwenden, um Wundlängen- und Breitenmessungen zu erhalten.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieser Artikel beschreibt zwei traktierbare murine Wundmodelle, die die Beurteilung der akuten Wundheilungsreaktion ermöglichen. Die erste Methode beinhaltet die chirurgische Implantation von PVA-Schwämmen im dorsalen subkutanen Raum. Dieser Ansatz bietet einen deutlichen Vorteil gegenüber biopsiebasierten Wundmodellen für die Untersuchung der zellulären Wundheilungsreaktion aufgrund der großen Anzahl von Zellen und der Menge an Wundflüssigkeiten, die aus den isolierten Schwämmen gewonnen werden. Für die erfolgreiche Dur...

Es gibt viele murine Modellsysteme zur Verfügung, um Wundheilungsprozesse zu untersuchen, die jeweils spezifische Vorteile und Einschränkungenbesitzen 1,2. Die folgenden Methoden stellen zwei murine Wundmodelle dar, von denen jedes einen bestimmten Aspekt der Wundheilungsreaktion behandelt und die verwendet werden können, um Ursache und Wirkung von Störungen in der Reaktion auf Verletzungen zu identifizieren. Der Prozess der Wundheilung findet in verschiedenen Phasen statt. Die erste Phase ist entzündlich, gekennzeichnet durch den schnellen Zustrom von Thrombozyten, Neutrophilen und Monozyten/Makrophagen, sowie die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen. Nach der Auflösung der Entzündung übergeht die Umgebung in einen reparativen Zustand mit der Induktion von profibrotischen und proangiogenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren. Granulationsgewebe wird abgelagert und Neogefäße bilden sich mit der Migration von Myofibroblasten, Fibroblasten, Epithelzellen und Endothelzellen. In den letzten Stadien wird die provisorische extrazelluläre Matrix umgebaut, und Narbenbildung und Wundverschluss gehenweiter 2,3,4,5,6,7,8.
Kein einziges murines Modell bietet ein System, um alle Stadien der Wundheilung zu studieren2. Hier werden zwei chirurgische Wundmodelle beschrieben: Eines erläutert akute zelluläre und zytokine Wundheilungsreaktionen, das andere ermöglicht die Beurteilung des Wundverschlusses sowie histologische Analysen. Diese beiden Methoden können komplementär eingesetzt werden, um die Auswirkungen einer Störung oder Komorbidität auf verschiedene Aspekte der Wundheilungsreaktion zu bewerten. Die dorsale subkutane Implantation von Polyvinylalkoholschwämmen (PVA) ist ein System, das seit Jahrzehnten in Nagetiermodellen verwendet wird, um zahlreiche Aspekte der zellulären und Granulationsgewebereaktionen9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Dieser Ansatz ermöglicht die Rückgewinnung von zytokinreichen Wundflüssigkeiten und zellulären Infiltraten. Bei diesem Modell werden 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA-Schwammstücke durch einen 2 cm Schnitt an der hinteren dorsalen Mittellinie in subkutane Taschen gelegt. Der Schnitt wird mit chirurgischen Clips geschlossen, und die Schwämme können zu späteren Zeitpunkten für die Zell- und Flüssigkeitsisolierung abgerufen werden. Das zelluläre und zytokinische Milieu isolierter Schwämme spiegelt die normalen Stadien der akuten Wundheilung bis etwa 14 Tage nach der Implantation wider. Zu späteren Zeitpunkten ist das Modell vorteilhafter für die Untersuchung der Granulationsgewebebildung und der Fremdkörperreaktion1. Mit diesem System ist es möglich, >106 Zellen zu isolieren, was einen deutlichen Vorteil für phänotypische und funktionelle Assays und RNA-Isolierung bietet, gegenüber der Isolierung von Zellen von anderen biopsiebasierten Methoden1,22,23,25,26.
Die Rate des Wundverschlusses wird anhand des Schwanzhautexzessionsmodells bestimmt. In diesem Modell, wie ursprünglich von Falanga et al. beschrieben und von anderen berichtet27,28,29,30, wird ein 1 cm x 0,3 cm voller Dicke Abschnitt der Schwanzhaut in der Nähe der Basis des Schwanzes entfernt. Der Wundbereich ist leicht zu visualisieren und kann im Laufe der Zeit gemessen werden. Alternativ kann Schwanzgewebe für die histologische Analyse isoliert werden. Dieser Ansatz kann als Alternative zur oder in Verbindung mit der etablierten Dorsal-Punch-Biopsiemethode verwendet werden. Die primären Unterscheidungen zwischen diesen beiden Modellen sind die Rate des Wundverschlusses, das Vorhandensein oder Fehlen von Fell und die Hautstruktur2,31,32. Schwanzhautwunden bieten einen längeren Zeitrahmen, um den Wundverschluss zu beurteilen, da es etwa 21 Tage dauert, bis eine Vollsperrung auftritt. Dies steht im Gegensatz zu unplinierten dorsalen Punschbiopsien, die viel schneller heilen (ca. 7–10 Tage), vor allem durch Kontraktion aufgrund der Wirkung des Panniculus carnosus. Splinted dorsal Punch Biopsien heilen langsamer und verringern die Auswirkungen der kontraktilen Heilung, aber verlassen Sie sich auf die Anwesenheit eines Fremdkörpers, kontraktile-basierte Mechanismen zu beschränken1,2,27,30,31,33.
Die beschriebenen Wundmodelle sind informativ, um normale Wundheilungsprozesse ohne Störung zu verstehen. Während sich die Heilung der Nagetierhaut in sehr signifikanter Weise von der menschlichen Haut unterscheidet, einschließlich loser Struktur, Abhängigkeit von kontraktiler Heilung und anderen anatomischen Unterschieden, bietet das murine System bestimmte Vorteile für mechanistische und Screening-Studien. Dazu gehören vor allem die Verfügbarkeit von inzuchtierten Stämmen und genetischen Mutanten, genetische Traktionsfähigkeit und niedrigere Kosten. Mechanistische Erkenntnisse aus murinen Studien können in komplexe Tiermodelle übersetzt werden, die die Heilung menschlicher Haut stärker nachahmen, wie das Schweinesystem2,31.
Zusätzlich zur Untersuchung der Wundheilungsreaktionen im stationären Zustand können diese Modelle mit komorbiden Bedingungen kombiniert werden, um die Grundlage von Wundheilungsdefekten auf Zell-, Zytokin- und Bruttogewebeebene zu verstehen. In diesem speziellen Umfeld können die beiden Modelle gemeinsam verwendet werden, um die Auswirkungen einer bestimmten komorbiden Erkrankung, wie z. B. einer postoperativen Lungenentzündung, sowohl auf die akute zelluläre Wundheilungsreaktion als auch auf die Rate des Wundverschlusses30zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>10x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen, Olympus</td><td>Genesee</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (+Kalzium, +Magnesium, &ndash; ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>5ml Spritze</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45.2-APC Fire750</td><td>BioLegend</td><td>109852</td><td>Klon 104</td></tr><tr><td>Anti-Maus F4/80-eFluor660</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-4801-82</td><td>Klon BM8</td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly6C-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553104</td><td>Klon AL-21</td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly6G-PerCP-eFluor710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9668-82</td><td>Klon 1A8-Ly6G</td></tr><tr><td>Anti-Maus Siglec-F-APC-R700</td><td>BD Biosciences</td><td>565183</td><td>Klon E50-2440</td></tr><tr><td>Autoclip Edelstahl Wound Clip Applier</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9021392</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip Edelstahl Wickelclips, 9mm</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9334081</td><td></td></tr><tr><td>Mixerbeutel, 80 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14258201</td><td></td></tr><tr><td>Kulturröhrchen, 16 ml, 17x100</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-130</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum - Standard</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor506</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Hepeslösung, 1 M</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-534</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (5000 U/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalkohol-Schwamm - große Porengröße</td><td>Ivalon/PVA Unbegrenzt</td><td></td><td>www.sponge-pva.com</td></tr><tr><td>Povidon-Jod-Lösung, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>3955-16</td><td></td></tr><tr><td>Sprühbarrierefolie, Cavilon</td><td>3M</td><td>3346E</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Biomaster, 110V</td><td>Seward</td><td>0080/000/AJ</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der akuten wundheilung mit den dorsalen subkutanen polyvinylalkoholschwammimplantation und exzisional tail skin wound models.

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der das geordnete Fortschreiten von Entzündungen, Granulationsgewebebildung, Fibrose und Auflösung erfordert. Murine Modelle bieten wertvolle mechanistische Einblicke in diese Prozesse; Kein einziges Modell berücksichtigt jedoch alle Aspekte der Wundheilungsreaktion vollständig. Stattdessen ist es ideal, mehrere Modelle zu verwenden, um die verschiedenen Aspekte der Wundheilung anzusprechen. Hier werden zwei verschiedene Methoden beschrieben, die verschiedene Aspekte der Wundheilungsreaktion behandeln. Im ersten Modell werden Polyvinylalkoholschwämme subkutan entlang des Mausdorsums implantiert. Nach dem Abruf von Schwämmen können Zellen durch mechanische Störungen isoliert werden, und Flüssigkeiten können durch Zentrifugation extrahiert werden, was eine detaillierte Charakterisierung der zellulären und zytokinen Reaktionen in der akuten Wundumgebung ermöglicht. Eine Einschränkung dieses Modells ist die Unfähigkeit, die Rate des Wundverschlusses zu beurteilen. Dazu wird ein Schwanzhautexzisionsmodell verwendet. Bei diesem Modell wird ein 10 mm x 3 mm rechteckiges Stück Schwanzhaut entlang der rückenden Oberfläche, in der Nähe der Basis des Schwanzes, ausgeschnitten. Dieses Modell kann leicht für die planimetrische Analyse fotografiert werden, um Heilungsraten zu bestimmen, und kann für histologische Analysen ausgeschnitten werden. Beide beschriebenen Methoden können in genetisch veränderten Mausstämmen oder in Verbindung mit Modellen von komorbiden Erkrankungen wie Diabetes, Alterung oder Sekundärinfektionen eingesetzt werden, um Wundheilungsmechanismen aufzuklären.

Systemische Entzündungsreaktion nach PVA-Schwammimplantation Die PVA-Schwammimplantationschirurgie erzeugte eine systemische Entzündungsreaktion, wie die Induktion von IL-6 im Plasma 1 Tag nach der Wundwunde zeigte (Abbildung 2A). Andere proinflammatorische Zytokine, einschließlich TNF-A und IL-1, sowie eine Reihe von Chemokinen einschließlich CCL2 und CXCL1 wurden in den ersten 7 Tagen nach der PVA-Schwammimplantation systemisch induziert und an anderer Stelle beschriebe...

Hier werden zwei murine Wundheilungsmodelle beschrieben, eines zur Beurteilung der zellulären und zytokinen Wundheilungsreaktionen und das andere zur Quantifizierung der Rate des Wundverschlusses. Diese Methoden können mit komplexen Krankheitsmodellen wie Diabetes verwendet werden, um Mechanismen verschiedener Aspekte der schlechten Wundheilung zu bestimmen.

Bewertung der akuten Wundheilung mit den dorsalen subkutanen Polyvinylalkoholschwammimplantation und Exzisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Diese Modelle können implementiert werden, um verschiedene Aspekte der Wundheilungsreaktion zu bewerten, einschließlich Zell- und Zytokinkinkinkinetik und Wundverschluss. Das PVA-Schwammmodell ermöglicht die Rückgewinnung von Millionen von Wundleukozyten für phänotyptische und funktionelle Analysen, während das Schwanzhautexzisionsmodell die einfache Visualisierung von langsam heilenden Wunden ermöglicht. Die PVA-Schwamm- und Exzisionalschwanzwundenmodelle können in Verbindung mit komorbiden Erkrankungen wie Diabetes oder Lungenentzündung verwendet werden, um deren Auswirkungen auf die Wundheilung zu verstehen.Die Verfahren mit Meredith Crane demonstrieren Bill Henry, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, schneiden Sie mit einer Schere Blätter aus PVA-Schwamm in acht mal acht mal vier Millimeter große Stücke. Rehydrieren Sie die Schwammstücke in sterilem PBS in einem Becher für 10 Minuten, bevor Autoklav die Schwämme im PBS sterilisiert.Wenn die Schwämme abgekühlt sind, lagern Sie die in PBS getauchten Schwämme bei vier Grad Celsius. Legen Sie am Tag des Eingriffs sechs Schwämme pro Versuchstier in eine sterile Kulturschale in eine sterile laminare Fließhaube und bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkniff in einer anästhesierten, acht bis 12 Wochen alten, männlichen, C57-Black/6-Maus. Lassen Sie einen Assistenten Clippers verwenden, um das Haar entlang der Dorsum und sterile Gaze zu entfernen, um Povidon-Jod-Lösung auf den rasierten Bereich zweimal auftragen, gefolgt von einer einzigen 70%Ethanol-Anwendung.Der Assistent sollte dann die Maus auf sterile chirurgische Vorhänge übertragen, die über ein beheiztes Pad gelegt werden. Tragen Sie sterile Handschuhe, verwenden Sie Zangen, um die rückenförmige Haut vom darunter liegenden Gewebe wegzuziehen, und verwenden Sie sterile chirurgische Scheren, um einen zwei Zentimeter großen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie etwa zwei Zentimeter vor der Basis des Schwanzes zu machen. Halten Sie den Schnitt mit steriler Zange offen, verwenden Sie sterile, gekrümmte, stumpfe chirurgische Schere, um eine subkutane Tasche entlang des Dorsums in einer der in der Abbildung angegebenen Positionen zu bilden.Sobald die Schere eingesetzt wurde, öffnen und schließen Sie die Spitzen zweimal, um eine Tasche zu bilden, die groß genug ist, um einen eingelegten Schwamm zu halten. Wenn die Tasche erstellt wurde, verwenden Sie sterile chirurgische Schere, um sanft einen PVA-Schwamm in der Kulturschale zu drücken, um überschüssige PBS zu entfernen. Als nächstes heben Sie den Schwamm um eine Ecke, und legen Sie den Schwamm mit der Ecke, die von der Schere gehalten wird, in die subkutane Tasche.Wenn alle sechs Schwämme wie gezeigt platziert wurden, verwenden Sie sterile Zangen, um die eingeschnittene Rückenhaut zusammenzuklemmen, und schließen Sie den Schnitt mit zwei Edelstahl-Wundclips. Für die Isolierung von PVA-Schwammflüssigkeiten entfernen Sie ein bis 14 Tage nach der Implantation die chirurgischen Klammern und öffnen Sie den Schnitt mit Zahnzangen. Verwenden Sie eine Schere, um den Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie zu verlängern, und verwenden Sie Zangen, um einen Schwamm aus seiner subkutanen Tasche zu extrahieren.Legen Sie den Schwamm in den Lauf einer Fünf-Milliliter-Spritze, die in einem 16-Milliliter-Kulturrohr verschachtelt ist, auf Eis und entfernen Sie mit einer Schere jedes Bindegewebe, das bei Bedarf an der Oberfläche des Schwamms haftet. Wenn alle Schwämme extrahiert und übertragen wurden, wie gezeigt, zentrifugieren Sie das Kulturrohr, um die Wundflüssigkeit zu sammeln. Um die Zellen von den PVA-Schwämmen zu isolieren, legen Sie sie nach dem Sammeln der Schwämme, wie gerade gezeigt, in ein 15-Milliliter konisches Rohr mit fünf Millilitern HBSS-Sammelmedium.Wenn alle Schwämme gesammelt sind, dekantieren Sie die Schwammfederung in einen 80-Milliliter-Mixerbeutel und hängen Sie den Beutel aus der Luke des Paddelmixers auf, so dass die Paddel die Schwämme und das Medium treffen. Stellen Sie den Paddelmixer auf hoch für 60 Sekunden, und drücken Sie Start. Wenn der Mixer angehalten hat, drücken Sie die Schwämme in den Beutel, um das Medium vollständig freizugeben, und verwenden Sie eine Pipette, um das Medium aus dem Mixerbeutel zurück in das 15-Milliliter-Rohr zu übertragen.Passen Sie die Einstellungen des Paddelmixers so an, dass er 30 Sekunden lang hoch läuft, und fügen Sie dem Mixerbeutel fünf Milliliter Medium hinzu. Wiederholen Sie den Magenprozess zwei weitere Male, bevor Sie das Rohr des gesammelten Mediums zentrieren. Ein rotes Pellet aus Zellen und roten Blutkörperchen sollte an der Unterseite des konischen Röhrchens sichtbar sein.Mischen Sie 900 Mikroliter destilliertes Wasser mit den Zellen für drei bis fünf Sekunden, bevor Sie die Lyse mit 100 Mikrolitern 10x PBS und vier Milliliter 1x PBS neutralisieren. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, und setzen Sie das weiße Zellpellet im geeigneten Medium für die nachgelagerte Analyse wieder aus. Um eine Schwanzhautwunde zu erstellen, nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung in der anästhesierten, acht bis 12 Wochen alten, männlichen, C57-Black/6 Maus, verwenden Sie sterile Gaze, um Povidon-Jod-Lösung zweimal auf die chirurgische Stelle aufzutragen, gefolgt von einer Anwendung von 70%Ethanol.Verfolgen Sie mit einem permanenten Marker und einer vorgefertigten Schablone einen 10 mal drei Millimeter großen Abschnitt auf der Dorsaloberfläche des Schwanzes, 10 Millimeter von der Schwanzbasis entfernt, und legen Sie die Maus auf sterile chirurgische Vorhänge. Verwenden Sie sterile chirurgische Handschuhe, verwenden Sie eine sterile Skalpellklinge, um einen Schnitt mit voller Dicke entlang der rechten, unteren und linken Ränder des Wundbereichs zu machen. Mit sterilen Zangen, schälen Sie die ausgeschnittene Haut weg vom Schwanz, und verwenden Sie sterile chirurgische Schere, um den oberen Rand des Wundbereichs zu schneiden.Verwenden Sie sterile Gaze, um Druck auf die Wunde auszuüben, um die Blutung zu stoppen, und wenden Sie einen Sprühbarrierefilm auf das Wundbett an. Fotografieren Sie dann die Wunden in regelmäßigen Zeitabständen aus einem festen Abstand und analysieren die Fotos durch planimetrische Analyse, um die Wundbereichsmessungen zu bestimmen. Die PVA-Schwammimplantationschirurgie erzeugt eine systemische Entzündungsreaktion, wie die Induktion von IL-6 im Plasma einen Tag nach der Wundwunde zeigt.Die Anzahl der Zellen, die aus PVA-Schwammwunden zurückgewonnen werden können, nimmt mit der Zeit zu, mit Neutrophilen, Monozyten und Makrophagen, die die primären zellulären infiltrierenden Populationen innerhalb der Schwämme umfassen. Neutrophile werden als Ly6G-positive, Siglec-F-negative Zellen identifiziert. Siglec-F-positive Zellen sind in erster Linie Eosinophile.Die Angating auf den Ly6G-negativen, Siglec-F-negativen Zellen ermöglicht die Identifizierung von F4/80-positiven Monozyten und Makrophagen. F4/80-positive Zellen können durch ihre Ly6C-Expression weiter differenziert werden, um Ly6C hochentzündliche Monozyten und Ly6C-niedrige Monozyten-abgeleitete Makrophagen zu unterscheiden. Das exzisionale Schwanzhautmodell bietet eine Alternative zur dorsalen Hautpunschbiopsiemethode, um den Wundverschluss in fester Haut ohne dichtes Fell zu untersuchen.Der Wundverschluss kann quantifiziert werden, indem der Bereich des Wundbettes im Laufe der Zeit gemessen wird. Die Schwanzhautwunde kann auch im Querschnitt durch histologische Analyse über H und E und Massons trichrome Färbung beobachtet werden. In diesen Bildern werden die seitlichen Ränder der ausgeschnittenen Haut durch die Pfeilspitzen auf der Dorsaloberfläche des Schwanzes angezeigt.Um die stationäre Wundheilung zu verstehen, können therapeutische Verbindungen oder Interventionen auch durch ihre Injektion direkt in den PVA-Schwamm oder durch Lieferung an das Schwanzwundbett getestet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein nützliches Werkzeug, um die Wirkungen von Arzneimitteln, Wachstumsfaktoren und / oder manipulierte Zellen in einem Tiermodell der Wundheilung Analyse beschrieben. Diese Technik nutzt die Eigenschaften eines Polyvinylalkohol (PVA) Schwamm zu liefern und beinhalten die gewünschte Behandlung und auch eine Plattform zum ausgeschnitten und analysiert werden.

Die Polyvinylalkoholschwamm Modell Implantation

Ein Mausmodell von kutanen Wundheilung, die zur therapeutischen Verbindungen in physiologischen und pathophysiologischen Einstellungen beurteilen kann.

Mausmodell der Wundheilung

Vaskularisierung ist der Schlüssel zur erfolgreichen Ansätze in der Gewebezüchtung. Daher werden sichere Technologien erforderlich, um die Entwicklung von Gefäßnetze im Gewebekonstrukte bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung Vaskularisierung in vivo.

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein dreidimensionales Hautäquivalent in voller Dicke aufzubauen, das der natürlichen Haut ähnelt. Mit einer eigens konstruierten automatisierten Aufwickelvorrichtung können präzise und reproduzierbare Wunden unter Beibehaltung der Sterilität erzeugt werden.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

Die Ratte, aufgrund seiner Größe, Verfügbarkeit und eher fügsam Verhalten hat als Forschungsmodell für viele Jahre in Anspruch genommen. Das Ziel des Protokolls ist es, die Ratte als ischämische Haut Wundheilung Modell zu verwenden, um einen wertvollen Einblick in die Pathophysiologie von chronischen Wunden bereitzustellen.

Demonstration der Ratte ischämische Hautwunde Modell

Hier stellen wir ein Protokoll für einen In-vitro-Scratch-Assay mit primären Fibroblasten und für einen in vivo Hautwundheilungstest bei Mäusen vor. Beide Assays sind einfache Methoden zur Beurteilung der In-vitro- und In-vivo-Wundheilung.

Scratch Migration Assay und Dorsal Skinfold Kammer für In Vitro und In Vivo Analyse der Wundheilung

Dieses Protokoll beschreibt, wie bilaterale, volldicke Exzisionswunden bei Mäusen erzeugt werden und wie man anschließend die Wunden für die morphometrische Analyse überwacht, erntet und vorbereitet. Enthalten ist eine ausführliche Beschreibung der Verwendung von seriellen histologischen Abschnitten zur Definition, präzisen Quantifizierung und Erkennung morphometrischer Defekte.

Murine Excisional Wound Healing Model und histologische morphometrische Wundanalyse

Hier demonstrieren wir eine optimierte Technik zur Beurteilung der Wundreparatur mit ex vivo menschlicher Haut in Kombination mit einem Whole-Mount-Färbeansatz. Diese Methodik bietet eine präklinische Plattform für die Bewertung potenzieller Wundtherapien.

Humanes Ex-vivo-Wundmodell und Whole-Mount-Färbeansatz zur genauen Bewertung der Hautreparatur

Diese Studie stellt zwei entscheidende experimentelle Techniken vor: die Konstruktion eines murinen Wundmodells zur Beurteilung des Wundverschlusses und die Herstellung von einzelligen Suspensionen aus der Haut von Mäusen, um die zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten.

Maus-Wundmodelle und Herstellung von Einzelzellsuspensionen

Wunden stellen eine globale gesundheitliche Herausforderung dar. In dieser Studie wurde eine standardisierte Fotokabine mit digitaler Planimetrie entwickelt, um die Variabilität der Wundmessung zu minimieren. Die Überwachung der Wunden bei Mäusen über einen Zeitraum von 14 Tagen zeigte eine anfängliche Zunahme der Wundfläche und des Wundumfangs, gefolgt von einem allmählichen Verschluss. Diese Methodik kann bei der Bewertung der Wundverschlusskinetik in präklinischen Modellen hilfreich sein.

Digitale Planimetrie zur Beurteilung der Wundverschlusskinetik in einem Mausmodell

Ein Rattenhaut-Wundmodell wird beschrieben, das die Bewertung verschiedener therapeutischer Wirkstoffe unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen über die verschiedenen Heilungsphasen hinweg ermöglicht. Darüber hinaus wird ein Protokoll zur manuellen Planimetrie zur Überwachung der Wundkontraktionsrate während der gesamten Gewebereparatur detailliert beschrieben.

Ein chirurgisches Ratten-Hautwundmodell: Ein Ansatz für Wundheilungsstudien und Biomaterialbewertung

Lernen Sie zwei murine Wundheilungsmodelle kennen: den PVA-Schwamm zur Analyse von Leukozyten und das Schwanzhaut-Exzisionsmodell zur Visualisierung langsamer Wundheilung. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung zellulärer und zytokinischer Kinetiken.

Bewertung der akuten Wundheilung mit den dorsalen subkutanen Polyvinylalkoholschwammimplantation und Exzisional Tail Skin Wound Models. (Video) | JoVE Journal

Bewertung der akuten Wundheilung mit den dorsalen subkutanen Polyvinylalkoholschwammimplantation und Exzisional Tail Skin Wound Models.

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