Name: Analyse der Seitenpopulation in soliden Tumorzelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle und kostengünstige Methode zur Analyse der Seitenpopulation in soliden Tumorzelllinien. Diese Technik ermöglicht die Isolierung von Krebsstammzellen und unterstützt die Erforschung von Tumorbiologie.

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Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 und 81972787 finanziert; Naturwissenschaftliche Stiftung der Stadt Tianjin (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grundlagenforschungsfonds für die Zentralen Universitäten, Nankai University 63191153.

1. Zellvorbereitung
<ol><li>Zellverdauung und Neutralisation<ol>
<li>Samen Sie Tumorzellen (wie MDA-MB-231-Zellen) in einer 6-Well-Platte und kulturieren Sie sie in einem 37 °C-Inkubator, der mit 5% CO2versorgt wird.</li>
		<li>Ernten Sie Zellen, wenn ihre Dichte etwa 90% erreicht. Das Kulturmedium gründlich absaugen und die Zellen 2x mit 3 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen. HINWEIS: Um die Auswirkungen von Signalweginhibitoren (z. B. FRA1-Inhibitor) oder Aktivatoren (z. B. STAT3-Aktivator) auf die Stammmerkmale von Tumorzellen zu untersuchen, werden Tumorzellen in einer 6-Well-Platte ausgesät und vor der Ernte für eine bestimmte Zeit mit Inhibitoren oder Aktivatoren vorbehandelt.</li>
		<li>Fügen Sie 500 μL 0,25% Trypsin-EDTA zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu, legen Sie die Platte für 1-3 Minuten (min) in einen Inkubator bei 37 °C und klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen. HINWEIS: Eine längere Verdauung wirkt sich auf das SP-Profil aufgrund von Veränderungen der Zelllebensfähigkeit aus.</li>
		<li>Fügen Sie 3 ml PBS, ergänzt mit 2% fetalem Rinderserum (FBS), zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu, um die Verdauung zu beenden, und pipetieren Sie die Zellen sanft 3-5x auf und ab, um die Zellklumpen zu dispergieren.</li>
		<li>Fügen Sie 0,5 ml Zellsuspension zu einer Vertiefung einer neuen 6-Well-Platte hinzu und untersuchen Sie sie unter einem Mikroskop. Wenn Zellklumpen beobachtet werden, leiten Sie die Zellsuspension durch ein 70 μM Zellsieb. HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt.</li>
		<li>Die Zellen werden in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min zu Pelletzellen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 3 ml PBS, ergänzt mit 2% FBS. Pipetetten Sie die Zellen 3-5x auf und ab, um sie gründlich zu mischen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anzahl der Zellen<ol>
<li>50 μL der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit 50 μL trypanblauer Lösung mischen. Pipetten Sie 10 μL der Mischung, um die Anzahl der lebenden Zellen mit einer Standardmethode wie einem Hämozytometer zu zählen.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Zellen in PBS, ergänzt mit 2% FBS, auf eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml. 1 ml der Zellsuspension in ein 5 ml Polystyrol-Rundboden-Reagenzglas geben und zwei Probenröhrchen vorbereiten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Zellfärbung mit Hoechst 33342
<ol><li>Hoechst 33342 in ein Röhrchen geben, um eine entsprechende Endkonzentration zu erreichen. HINWEIS: Beispielsweise beträgt die geeignete Konzentration von Hoechst 33342 3 μg/ml für MDA-MB-231-Zellen.</li>
	<li>Fügen Sie einen Blocker (z. B. Fumitremorgin C, Verapamil oder Reserpin) in ein anderes Röhrchen in einer geeigneten Endkonzentration ein und inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 30 minuten, bevor Sie die gleiche Konzentration von Hoechst 33342 wie in Schritt 2.1 beschrieben hinzufügen. HINWEIS: Für MDA-MB-231-Zellen ist der geeignete Blocker Reserpine (40 μM). Reserpine wird als blockierendes Steuerelement verwendet, um das Fehlen von Zellen im geschlossenen SP-Bereich zu überprüfen.</li>
	<li>Bereiten Sie mehrere Röhrchen mit Zellen vor und fügen Sie Hoechst 33342 verschiedenen Konzentrationsgradienten hinzu. Wählen Sie nach einem Durchflusszytometrie-Assay die richtige Konzentration entsprechend dem Profil und dem Anteil des SP. HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt, um die richtige Konzentration von Hoechst 33342 zu definieren.</li>
	<li>Mehrere Röhrchen mit Zellen vorbereiten, den Blocker verschiedenen Konzentrationsgradienten zuordnen, die Röhrchen 30 min lang bei 37 °C inkubieren und dann Hoechst 33342 in einer entsprechenden Konzentration hinzufügen. Wählen Sie nach dem Durchflusszytometrie-Assay die richtige Konzentration entsprechend dem Fehlen von Zellen im gated SP-Bereich. HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt, um die richtige Konzentration des Blockers zu definieren.</li>
	<li>Legen Sie die Röhrchen in einen 37 °C-Inkubator und inkubieren Sie sie für 60 Minuten, wobei die Röhrchen alle 10 Minuten geschüttelt werden. HINWEIS: Das gründliche Schütteln von Röhrchen ist wichtig für die Färbung, da es einen vollständigen Kontakt zwischen den Zellen und dem Farbstoff für bessere Färbeergebnisse gewährleistet.</li>
	<li>Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g,4 °C für 5 min und saugen den Überstand vorsichtig an, da die Zellen sehr lose und instabile Pellets bilden.</li>
	<li>Resuspend Zellen jeder Röhre in 1 ml eiskaltem PBS, ergänzt mit 2% FBS und Pipette die Zellen 3-5x auf und ab pipetten, um gründlich zu mischen. Fügen Sie 1 μL 1 mg / ml Propidiiumiodid (PI) zur Suspension jedes Röhrchens hinzu, um tote Zellen zu identifizieren. HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Schritt sollten bei 4 °C durchgeführt werden, um den Ausfluss von Hoechst 33342 aus den Tumorzellen zu hemmen. Die Röhren sollten vor direkter Lichteinwirkung geschützt werden.</li>
</ol>3. Analyse mittels Durchflusszytometrie
HINWEIS: Anweisungen zur Verwendung der Durchflusszytometer-Software (siehe Materialtabelle)sind in diesem Abschnitt und den ergänzenden Abbildungen 1–10beschrieben.
<ol><li>Klicken Sie in der Durchflusszytometer-Software auf die Schaltfläche ORDNER. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment und dann auf Neues Experiment ( Ergänzende Abbildung1A,B).</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche OK. "Experiment_001" wird unter dem FOLDER angezeigt (Ergänzende Abbildung 2A,B).</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment_001, um den Ordnernamen in einen bestimmten Namen zu ändern (z. B. "20191118-SP"). Klicken Sie auf Enter. Der neue Name ("20191118-SP") wird unter FOLDER (Ergänzende Abbildung 3A, B )angezeigt.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Probe, um dem neuen Experimentordner ("20191118-SP") eine Probe hinzuzufügen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Tube, um der Probe eine Tube hinzuzufügen. Klicken Sie auf die Pfeilspitzenschaltfläche (Ergänzende Abbildung 4A-C).</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Parameter und richten Sie die Parameter des Durchflusszytometers ein (Ergänzende Abbildung 5).<ol>
<li>Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegelkurzepass (DMSP) von 610 nm, um die Emissionswellenlängen zu trennen. Verwenden Sie einen 450/20 nm BP-Filter, um die blaue Fluoreszenz zu sammeln, und einen 675 nm EFLP, um die rote Fluoreszenz zu sammeln. HINWEIS: Hoechst 33342 wird mit einem UV-Laser bei 355 nm und PI bei 488 nm angeregt.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Zellproben auf dem Durchflusszytometer aus. HINWEIS: SP-Zellen können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unter sterilen Bedingungen sortiert werden. Insgesamt sollten 100.000–500.000 Zellen für die Folgeexperimente gesammelt werden.<ol><li>Führen Sie mit Hoechst 33342 gefärbte Zellen auf dem Durchflusszytometer aus.<ol>
<li>Legen Sie Röhrchen mit mit Hoechst 33342 gefärbten Zellen auf das Zytometer.</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie dann auf die X-Achse und legen Sie sie auf "FSC-A" fest. Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "PI-A". Zeigen Sie das Punktdiagramm des Vorwärtsstreupulsbereichs (FSC-A, X-Achse auf linearen Modus eingestellt) im Vergleich zur PI-Fluoreszenz (Y-Achse auf logarithmische Skala eingestellt) an. Passen Sie die Spannungen so an, dass die lebenden Zellen auf der rechten Seite und die nicht lebenden Zellen, die hell mit PI gefärbt sind, in der oberen linken Ecke angezeigt werden. Richten Sie dann ein Polygon-Gate ein, um tote Zellen und Zelltrümmer auszuschließen (Abbildung 1A), indem Sie auf die Schaltfläche Polygon-Gate klicken, um die P1-Teilmenge, auch bekannt als FSC-A, PI-A-Teilmenge, zu gaten (Ergänzende Abbildung 6A,B).</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-W". Zeigen Sie das Punktdiagramm von FSC-A (X-Achse) im Vergleich zur Vorwärtsstreuimpulsbreite (FSC-W, Y-Achse) an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie auf die Schaltfläche P1 unter der Schaltfläche Populationen anzeigen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Rechteckiges Tor, um ein rechteckiges Tor zum Gate der P2-Teilmenge (auch als FSC-A, FSC-W-Teilmenge bezeichnet) zu erstellen. Dadurch werden Zellen mit großen Volumina ausgeschlossen (Ergänzende Abbildung 7A-C und Abbildung 1A).</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-W". Zeigen Sie das Punktdiagramm des seitlichen Streuimpulsbereichs (SSC-A, X-Achse) im Vergleich zur seitlichen Streuimpulsbreite (SSC-W, Y-Achse) an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie unter Der Schaltfläche Populationen anzeigen auf die Schaltfläche P2. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Rechteckiges Tor, um ein rechteckiges Tor zu erstellen, um die P3-Teilmenge (auch als SSC-A, SSC-W-Teilmenge bezeichnet) zu unterteilen. Dadurch erhält man eine Zellpopulation mit einheitlicher Granularität (Ergänzende Abbildung 8A-C und Abbildung 1A).</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Red-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Blue-A". Zeigen Sie das Punktdiagramm von Hoechst Red-A (X-Achse) und Hoechst Blue-A (Y-Achse) an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie auf die Schaltfläche P3 unter der Schaltfläche Populationen anzeigen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Polygon-Gate, um ein Polygon-Gate für die P4-Teilmenge (auch bekannt als Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-Teilmenge) zu erstellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie auf die Schaltfläche Bevölkerungshierarchie anzeigen, um die Populationshierarchie anzuzeigen. HINWEIS: Das Punktdiagramm zeigt drei verschiedene Populationen: 1) eine G0-G1-Phasenpopulation in der Nähe der Mitte des Diagramms; 2) eine S-G2/M-Phasenpopulation in der Nähe der oberen rechten Ecke; 3) die SP. Der SP wird dann für weitere Analysen eingezäunt (Ergänzende Abbildung 9A-D und Abbildung 1A). Wenn das Punktdiagramm von Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A kein SP-Profil ähnlich dem in Abbildung 1Azeigt, sollten die Spannungen angepasst werden, bis ein ähnliches Profil zu sehen ist. Passen Sie in der Zwischenzeit alle oben genannten Tore entsprechend an.</li>
			<li>Nachdem Sie den Gate-Bereich der SP-Zellen bestimmt haben, klicken Sie auf Daten erfassen, um 20.000 bis 100.000 Ereignisse aus jeder Probe zu sammeln, um den Prozentsatz der SP-Zellen zu analysieren (Ergänzende Abbildung 10).</li>
		</ol></li>
		<li>Führen Sie die mit Blocker behandelten Hoechst 33342-gefärbten Zellen auf dem Durchflusszytometer aus.<ol>
<li>Legen Sie Röhren mit Blocker auf das Zytometer und führen Sie Zellen mit den gleichen Spannungen und Gattern aus, um weiter zu überprüfen, ob die Spannungen und Gatter entsprechend ausgewählt sind. HINWEIS: Im Vergleich zur Hoechst 33342-Färbung allein sollte nur ein sehr kleiner Teil der Zellen, falls vorhanden, im geschlossenen Bereich des SP erscheinen (Abbildung 1B).</li>
			<li>Sammeln Sie 20.000 bis 100.000 Ereignisse aus jeder Probe, um den Prozentsatz der SP-Zellen zu analysieren.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Datenanalyse
HINWEIS: Anweisungen für die Verwendung der Durchflusszytometrie-Analysesoftware (siehe Materialtabelle)sind in diesem Abschnitt und den ergänzenden Abbildungen 11–16 beschrieben.
<ol><li>Kopieren Sie die Dateien im fcs-Format auf einen Computer, öffnen Sie die Durchflusszytometrie-Analysesoftware und ziehen Sie eine Beispieldatei in die Software (Ergänzende Abbildung 11A,B).
</li>
	<li>Gate-Zellen und erhalten Sie den Prozentsatz der SP-Zellen.<ol>
<li>Doppelklicken Sie auf diese Beispieldatei,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "PI-A". Erstellen Sie dann ein Polygon-Gate und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die FSC-A, PI-A-Teilmenge abzulegen (Ergänzende Abbildung 12A-E).</li>
		<li>Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei FSC-A, PI-A,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-W". Erstellen Sie dann ein rechteckiges Tor und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge FSC-A, FSC-W abzulegen (Ergänzende Abbildung 13A-E).</li>
		<li>Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei FSC-A, FSC-W,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-W". Erstellen Sie dann ein rechteckiges Tor und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge SSC-A, SSC-W zu erhalten (Ergänzende Abbildung 14A-E).</li>
		<li>Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei SSC-A, SSC-W,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Red-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Blue-A". Erstellen Sie dann ein Polygon-Gate und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A abzulegen (Ergänzende Abbildung 15A-E).</li>
		<li>Öffnen Sie den Layout-Editor, indem Sie auf die Schaltfläche Layout-Editor öffnen klicken. Ziehen Sie die Teilmengendatei SSC-A, SSC-W in den Layout-Editor, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Klicken, um das Fenster Layout in Datei zu speichern, um die Bildergebnisse zu speichern (Ergänzende Abbildung 16A-C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Speichern Sie den Arbeitsbereich, um die Gating-Informationen beim Schließen der Software beizubehalten.</li>
	<li>Führen Sie T-Test-Analysen mit statistischer Analysesoftware durch, um den Unterschied zwischen zwei Gruppen zu vergleichen. Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant definiert.</li>
</ol>

<ol><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Es gibt mehrere wichtige Punkte, die für den SP-Assay zu beachten sind. Die erste ist die Auswahl eines geeigneten Blockers, wie Verapamil oder Reserpine, für jede Zelllinie, da die "Gate" -Position der SP-Zellen nach der Position bestimmt wird, an der eine große Anzahl von SP-Zellen nach der Zugabe des Blockers verschwindet. Für die Zelllinie MDA-MB-231 funktioniert Reserpine gut. Für andere Zelllinien könnten jedoch verschiedene Blocker besser funktionieren.
Die zweite ist die Konzentration ...

Krebsstammzellen (CSCs) sind Untergruppen von Zellen mit Selbsterneuerungsfähigkeit und multiplem Differenzierungspotenzial, die eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum, der Metastasierung und dem Wiederauftreten spielen1,2. Derzeit wurden CSCs in einer Vielzahl von bösartigen Tumoren identifiziert, einschließlich Lungen-, Gehirn-, Bauchspeicheldrüsen-, Prostata-, Brust- und Leberkrebs3,4,5, 6,7,8,9. Die Identifizierung von CSCs in diesen Tumoren basiert hauptsächlich auf dem Vorhandensein von Oberflächenmarkerproteinen, wie z. B. hoher und / oder niedriger Expression von CD44, CD24, CD133 und Sca-19,10, aber ein einzigartiger Marker, der CSCs von Nicht-CSCs unterscheiden kann, wurde bisher nicht berichtet. Derzeit werden verschiedene Techniken verwendet, um CSCs in Tumorgewebe oder Tumorzelllinien zu identifizieren und zu reinigen. Diese Techniken basieren auf den spezifischen Eigenschaften von CSCs. Unter ihnen sind Assays und Sortierung von Side Population (SP) Zellen zwei der am häufigsten verwendeten Methoden.
SP-Zellen wurden ursprünglich von Goodell et al.11entdeckt, als sie hämatopoetische Stammzellen in Knochenmarkzellen von Mäusen charakterisierten. Als die Knochenmarkzellen der Maus mit dem fluoreszierenden Farbstoff Hoechst 33342 markiert wurden, erschien eine kleine Gruppe von Hoechst 33342 schwach gefärbten Zellen im zweidimensionalen Punktdiagramm eines Durchflusszytometrie-Assays. Hoechst 33342 ist ein DNA-bindender Farbstoff und hat mindestens zwei Bindungsmodi, die zu unterschiedlichen spektralen Eigenschaften führen. Bei gleichzeitiger Betrachtung der Fluoreszenzemission bei zwei Wellenlängen können mehrere Populationen aufgedeckt werden12. In ihrem Assay wurde der Hoechst 33342 bei 350 nm angeregt und die Fluoreszenz mit dem 450/20 nm Bandpassfilter (BP) und dem 675 nm Kantenfilter Long-Pass (EFLP)11gemessen. Im Vergleich zur gesamten Population von Knochenmarkzellen wurde diese Gruppe von Zellen mit hämatopoetischen Stammzellen angereichert, die SP-Zellen genannt werden11. SP-Zellen sind in der Lage, Hoechst 33342 schnell auszustoßen. Der Ausfluss dieses Farbstoffs ist mit ATP-bindenden Kassettentransportern (ABC)13verwandt, die durch einige Mittel wie FumitremorginC14,Verapamil und Reserpin15,16gehemmt werden können. Danach wurden unterschiedliche Anteile von SP-Zellen in einer Vielzahl von Geweben, Organen, Tumorgeweben und Tumorzelllinien17,18,19nachgewiesen. Diese SP-Zellen haben viele Eigenschaften von Stammzellen17,19.
Dieses Manuskript beschreibt die Hoechst 33342-Markierung und Färbung von kultivierten Tumorzellen und die Analyse von SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Darüber hinaus werden die Optimierung der Hoechst 33342-Konzentration und die richtige Blockerauswahl für eine bestimmte Tumorzelllinie mit diesem Ansatz gezeigt. Abschließend werden die Auswirkungen von Stängelförder- oder Hemmungssignalen auf den Sp-Anteil in Tumorzellen nachgewiesen. Die experimentellen Beispiele zeigen, dass die Analyse von SP verwendet werden kann, um die Auswirkungen verschiedener Signale wie Genexpression, kleine Inhibitoren, Aktivatoren, Zytokine und Chemokine auf die Tumorstammhaftigkeit zu untersuchen. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Isolierung und Reinigung von CSCs, wie z. B. Sortierung von CD44+/ CD24- Population, Aldehyddehydrogenase (ALDH) -Analyse und Tumorsphärenbildungsassays, ist diese Methode einfacher zu manipulieren und kostengünstig.

<table><tbody><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td>9,5 cm2 (ca.)</td></tr><tr><td>Colivelin</td><td>MCE</td><td>HY-P1061A</td><td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biological Industries (BIOIND)</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD LSRFortessa</td></tr><tr><td>Software für Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva</td></tr><tr><td>Software für die Durchflusszytometrie-Analyse</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FlowJo</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>bisBenzimid H 33342 Trihydrochlorid</td></tr><tr><td>Polystyrol Reagenzglas mit rundem Boden</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td>12 x 75 mm, 5 mL</td></tr><tr><td>Propidium iodid (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridiniumdiiodid</td></tr><tr><td>Reserpin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83580</td><td>(3&beta;, 16&beta;, 17&alpha;, 18&beta;, 20&alpha;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carbonsäuremethylester</td></tr><tr><td>SKLB816</td><td>bereitgestellt von Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Verapamilhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]
-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrilhydrochlorid</td></tr></tbody></table>

analyse der seitenpopulation in soliden tumorzelllinien

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Krebsstammzellen (CSCs) sind eine wichtige Ursache für Tumorwachstum, Metastasierung und Rezidiv. Die Isolierung und Identifizierung von CSCs sind für die Tumorforschung von großer Bedeutung. Derzeit werden verschiedene Techniken zur Identifizierung und Reinigung von CSCs aus Tumorgeweben und Tumorzelllinien eingesetzt. Die Trennung und Analyse von Side Population (SP)-Zellen sind zwei der am häufigsten verwendeten Methoden. Die Methoden basieren auf der Fähigkeit von CSCs, fluoreszierende Farbstoffe wie Hoechst 33342 schnell auszustoßen. Der Ausfluss des Farbstoffs ist mit den ATP-bindenden Kassettentransportern (ABC) assoziiert und kann durch ABC-Transporter-Inhibitoren gehemmt werden. Es werden Methoden zur Färbung kultivierter Tumorzellen mit Hoechst 33342 und zur Analyse des Anteils ihrer SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie beschrieben. Dieser Assay ist bequem, schnell und kostengünstig. Die in diesem Assay generierten Daten können zu einem besseren Verständnis der Wirkung von Genen oder anderen extrazellulären und intrazellulären Signalen auf die Stammeigenschaften von Tumorzellen beitragen.

Vier experimentelle SP-Analysen wurden nach dieser Methode durchgeführt. In der ersten haben wir den Anteil der SP-Zellen in MDA-MB-231, einer dreifach negativen menschlichen Brustkrebszelllinie, unter normalen Bedingungen nachgewiesen. Nach der Zellzählung wurde Hoechst 33342 in ein Röhrchen mit 1 x 106 Zellen in einer Endkonzentration von 3 μg/ml gegeben. Reserpin und Hoechst 33342 wurden einem anderen Röhrchen in Endkonzentrationen von 40 μM bzw. 3 μg/ml zugesetzt. PI wurde zu beiden Röhren hinzugefügt. Das...

Vorgestellt wird eine komfortable, schnelle und kostengünstige Methode zur Messung des Anteils von Seitenpopulationszellen in soliden Tumorzelllinien.

Analyse der Seitenpopulation in soliden Tumorzelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Die Analyse von Seitenpopulationszellen ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden, um Krebsstammzellen aus Tumorgeweben und Tumorzelllinien zu isolieren und zu identifizieren. Dieser Assay ist bequem, schnell und kostengünstig. Diese Methode kann zu einem besseren Verständnis der Wirkung von Genen oder anderen extrazellulären und intrazellulären Signalen auf die Stammeigenschaften von Tumorzellen beitragen.Viele Faktoren können den Prozentsatz der SP-Zellen in dieser Analyse beeinflussen, daher ist es wichtig, die richtigen Bedingungen vor dem formalen Experiment zu untersuchen. Samen Sie Tumorzellen in einer Sechs-Well-Platte und inkubieren Sie sie in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator, der mit 5% Kohlendioxid versorgt wird. Wenn die Zelldichte etwa 90% erreicht, saugen Sie das Kulturmedium an und waschen Sie die Zellen zweimal mit drei Millilitern PBS.Dann fügen Sie 500 Mikroliter von 0,25% Trypsin-EDTA zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für ein bis drei Minuten. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen, fügen Sie drei Milliliter PBS mit 2% FBS zu jeder Vertiefung hinzu und pipetieren Sie die Zellen drei- bis fünfmal auf und ab, um die Zellklumpen zu dispergieren. Untersuchen Sie die Zellsuspension unter dem Mikroskop.Wenn Zellklumpen vorhanden sind, leiten Sie die Suspension durch ein 70-Mikrometer-Sieb. Die Zellen werden in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen und fünf Minuten lang bei 200 g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in drei Millilitern PBS, ergänzt mit 2% FBS, wieder auf und ab, wobei Die Zellen drei- bis fünfmal nach oben und unten pipettiert werden, um sich zu mischen.Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter dem Mikroskop und verdünnen Sie sie in PBS, ergänzt mit 2% FPS, bis zu einer Endkonzentration von einmal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter. Bereiten Sie zwei Fünf-Milliliter-, Polystyrol-Rundboden-Reagenzgläser vor und fügen Sie jedem Röhrchen einen Milliliter der Zellsuspension hinzu. Kennzeichnen Sie ein Röhrchen als Reagenzglas und das andere als Blockersteuerrohr.Bereiten Sie eine Blockerlösung vor, indem Sie sie auf die entsprechende Konzentration verdünnen. Fügen Sie es in das Blocker-Steuerrohr und mischen Sie es gut, dann inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Schütteln Sie die Tube alle 10 Minuten.Bereiten Sie eine Lösung von Hoechst 33342 vor, indem Sie sie auf die entsprechende Konzentration verdünnen. Geben Sie es separat in das Reagenzglas und das Blockersteuerrohr und mischen Sie es gut, dann inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Schütteln Sie die Röhrchen alle 10 Minuten.Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 mal g und vier Grad Celsius und saugen dann vorsichtig den Überstand an. Resuspendieren Sie die Zellen in jedem Röhrchen mit einem Milliliter eiskaltem PBS, ergänzt mit 2% FBS, und pipetieren Sie dann die Zellen auf und ab, um sie zu mischen. Fügen Sie ein Mikroliter pro Milligramm pro Milliliter Propidiiumiodid oder PI zu jeder Tube hinzu und mischen Sie.Klicken Sie in der Durchflusszytometer-Software auf die Registerkarte Parameter. Wählen Sie zunächst die Parameter FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red und PI aus. Wählen Sie zweitens die logarithmische Skala für den PI-Parameter aus.Wählen Sie abschließend Flächen- und Breitenskalen für die Parameter FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red und PI aus. Führen Sie die Zellen zuerst aus dem Reagenzglas aus und lassen Sie dann die Zellen aus dem Blockersteuerrohr mit den gleichen Spannungen und Gattern laufen. Sammeln Sie 20 bis 100.000 Ereignisse aus jeder Probe, um den Prozentsatz der SP-Zellen zu analysieren.Diese Methode wurde verwendet, um den Anteil von SP-Zellen in der MDA-MB-231 menschlichen Brustkrebszelllinie nachzuweisen. Das Punktdiagramm von FSC-A versus PI-A zeigte eine Population von toten Zellen, Zelltrümmern und der Hauptpopulation von PI-negativen Zellen, die einer weiteren Analyse unterzogen wurde. Eine Einzelzellpopulation, die aus dem Punktdiagramm von FSC-A versus FSC-W und dem Punktdiagramm von SSC-A versus SSC-W abgliedert wurde, wurde verwendet, um den Anteil der SP-Zellen zu analysieren, der in unbehandelten Zellen etwa 0,9% und in mit Reserpin behandelten Zellen etwa 0,09% betrug.An MDA-MB-435-Zellen wurden unterschiedliche Färbekonzentrationen von Hoechst 33342 getestet und festgestellt, dass zwei Mikrogramm pro Milliliter für die SP-Analyse optimal waren. Niedrige Konzentrationen machten es schwierig, SP-Zellen von anderen Populationen zu unterscheiden, während hohe Konzentrationen sp-Zellen verschwinden ließen. Verapamil und Reserpin wurden getestet, um den richtigen Blocker für die MDA-MB-435-Zellen zu bestimmen.Etwa 0,4% der Zellen stießen den Farbstoff nach der Verapamil-Behandlung aus, aber das Verhältnis sank nach der Reserpin-Behandlung auf etwa 0,1%, was zeigt, dass Reserpin ein geeigneterer Blocker für diese Zelllinie ist. Dieses Protokoll wurde auch verwendet, um den Anteil von SP-Zellen in A549-humanen Lungenadenokarzinomzellen, die mit STAT3-Aktivator Colivelin behandelt wurden, und in T47D-menschlichen Brustkrebszellen, die mit fra1-Inhibitor SKLB816 behandelt wurden, zu bestimmen. Dieser Assay liefert Hinweise auf die regulatorische Wirkung von Signalwegen auf die Eigenschaften von Krebsstammzellen und ermöglicht die Entdeckung neuer Mechanismen, die letztendlich die gezielte Therapie von Tumoren leiten können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung der Seitenpopulation von T-Zell-Tumorzellen der akuten lymphatischen Leukämie (T-ALL), bestehend aus Stammzellen, aus einem adulten Zebrafisch. Der Seitenpopulation fehlen markante Zellmarker, daher verwenden wir den Hoechst 33342 Farbstoff-Efflux-Assay, um sie zu isolieren.

Side Population Assay: Eine Methode zur Isolierung der Seitenpopulation von Tumorzellen aus Zebrafischen

In diesem Video beschreiben wir die Isolierung einer Subpopulation von Krebsstammzellen aus Plattenepithelzelllinien im Kopf- und Halsbereich mit Hilfe des fluoreszenzaktivierten Zellsortierers oder FACS. Die isolierte Seitenpopulation von Zellen kann für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden.

Cancer Side Population Discrimination Assay: Eine Methode zur Isolierung von krebsstammähnlichen Zellen mit dem Hoechst Dye Efflux Assay

Eingehende Analysen von Krebszellproteomen erleichtern die Identifizierung neuer Wirkstoffziele und diagnostischer Biomarker. Wir beschreiben einen experimentellen Workflow zur quantitativen Analyse von (Phospho-)Proteomen in Krebszell-Subpopulationen, die aus flüssigen und festen Tumoren stammen. Dies wird durch die Kombination von zellulären Anreicherungsstrategien mit quantitativer Super-SILAC-basierter Massenspektrometrie erreicht.

Quantitative massenspektrometrische Analyse von Krebs-Zellen-Proteome Abgeleitet von Liquid und soliden Tumoren

Das Verständnis der Rolle von Krebsstammzellen beim Wiederauftreten von Tumoren und der Resistenz gegen Therapien ist in den letzten zehn Jahren zu einem Thema von großem Interesse geworden. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung und Charakterisierung der Subpopulation von Krebsstammzellen aus Plattenepithelzelllinien des Kopf- und Halses (HNSCC).

Isolierung und Charakterisierung eines Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom Subpopulation nach Stammzelleigenschaften

Methoden, die die Charakterisierung und Isolierung von Stammzellpopulationen aus biologischen Proben ermöglichen, sind entscheidend für den Fortschritt der Stammzell-zielgerichteten Behandlungen bei Krebs und darüber hinaus. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Krebs-Stammzell-Isolierung mit dem Farbstoff-ausgelösten Seiten-Population Phänotyp.

Die DNA-Farbstoff-ausgelöste Seitenbevölkerung Phänotyp zur Erkennung und Reinigung von Krebsstammzellen aus biologischen Proben

Hier beschreiben wir eine Technik, die die Seitenpopulation Zellen aus einem Zebrabärbling Modell der myc-induzierten T-Zell-akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL) zu isolieren. Diese Seite Bevölkerung Test ist hochempfindlich und wird für Zebrabärbling T-ALL beschrieben, aber es kann auch auf andere maligne und nicht-maligne Zebrabärbling Zelltypen anwendbar.

Die Isolierung der Seiten Bevölkerung in Myc-induzierte T-Zell akute lymphatische Leukämie in Zebrabärbling

Wir haben ein neuartiges Protokoll für das Studium der heterozellulären Populationsdynamik als Reaktion auf Störungen entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt eine bildgebende Plattform, die quantitative Datensätze zur gleichzeitigen Charakterisierung mehrerer zellulärer Phänotypen heterocyclischer Populationen in einer robusten Weise erzeugt.

Diskriminierung und Charakterisierung von Heterocellular Populationen mit quantitativen Imaging-Techniken

Hier beschreiben wir eine Methode zum Trennen und Bestandteil der Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebung in etablierte subkutane Tumoren zu bereichern. Diese Technik ermöglicht die separate Analyse der Tumor immun infiltrieren und nicht-immunen Tumor Fraktionen die umfassende Charakterisierung der Tumor immun Mikroumgebung ermöglichen können.

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

Die Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) ist ein beliebtes Thema in der translationalen Forschung. Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Immunfluoreszenztest (IF) zur PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung von CTCs in Nicht-Kleinzell-Lungenkrebsproben (NSCLC).

Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Der vorgestellte Ansatz bewertet gleichzeitig die Krebszellinvasion in 3D-Sphäroid-Assays und t-Zell-Zytotoxizität. Sphäroide werden in einem gerüstfreien Agarose-Multi-Mikrowell-Guss erzeugt. Co-Kultur und Einbettung in Typ I Kollagenmatrix werden innerhalb des gleichen Geräts durchgeführt, das Krebszellinvasion und T-Zell vermittelte Zytotoxizität zu überwachen ermöglicht.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Hier zeigen wir, dass Hochleistungslaser 375 nm und 405 nm Laser Hoechst 33342 effektiv anregen und als praktikable Alternative zum 355 nm Laser für die Detektion von Seitenpopulationszellen (SP) dienen können, wodurch das Spektrum der verfügbaren Laser in der Durchflusszytometrie erweitert wird.

Effektiver Nachweis von Zellen der Hoechst-Seitenpopulation mittels Durchflusszytometrie

Erfahren Sie eine schnelle und kostengünstige Methode zur Analyse der Seitenpopulation in soliden Tumorzelllinien. Diese Technik ermöglicht die Isolierung von Krebsstammzellen und unterstützt die Erforschung von Tumorbiologie.

Analyse der Seitenpopulation in soliden Tumorzelllinien

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