Name: Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Lernen Sie die Präparation meiotischer Chromosomenaufstriche aus Zebrafisch-Spermatozyten mit Superresolution-Mikroskopie. Diese Methode liefert hunderte gut verteilter Kerne pro Objektträger mit weniger Debris.

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Wir danken Trent Newman und Masuda Sharifi für ihre Kommentare zum Manuskript und An Nguyen für ihre Hilfe bei der Optimierung von Methoden zur Verbreitung und Färbung von Chromosomen aus Zebrafisch-Meiocyten. Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM079115 an S.M.B.

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination%2C+Pairing%2C+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li>
<li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks%2C+synapsis%2C+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730(2019).</li>
<li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li>
<li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+progression+of+recombination+in+human+males%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li>
<li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+studies+of+human+meiosis%3A+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at%2C+or+prior+to%2C+establishment+of+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075(2013).</li>
<li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442(2014).</li>
<li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li>
<li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li>
<li>Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li>
<li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+by+breaking+and+repairing%3A+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Journal%22%5BJournal%5D)">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li>
<li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li>
<li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378(2017).</li>
<li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+chiasmata+and+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li>
<li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li>
<li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+%28Oreochromis+niloticus%29+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773(2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier beschreiben wir Methoden zur Untersuchung der Lage von Telomeren und chromosomassoziierten Proteinen in nuklearen Oberflächenausbreitungen aus Spermatozyten, die aus Zebrafischhoden isoliert sind. Wir erwarten, dass diese Methoden für die Analyse von Spermatozyten in anderen Teleostarten mit Anpassung an die Größe der Hoden anwendbar sein werden.
Während nur wenige Antikörper zu meiotischen Proteinen von Zebrafischen erhoben wurden, hatten wir Erfolg mit den folgenden Antikörpern, die auf...

Die sexuelle Fortpflanzung erfolgt durch die Kombination zweier haploider Gameten, die jeweils die Hälfte des Chromosoms einer somatischen Zelle tragen. Meiose ist eine spezialisierte Zellteilung, die haploide Gameten durch eine Runde DNA-Replikation und zwei aufeinander folgende Runden der Chromosomensegregation produziert. In proPhase I müssen homologe Chromosomen (Homologe) paarwerden, rekombinieren und synapsisieren, wobei letztere durch die Bildung des synaptonemalen Komplexes gekennzeichnet ist, der zwei Homologachsen umfasst, die durch das Querfilament, Sycp1 (Abbildung 1A,B) überbrückt werden. Wenn diese Prozesse nicht ordnungsgemäß ausgeführt werden, kann dies zur Produktion von aneuploiden Gameten führen, die eine der Hauptursachen für Fehlgeburten beim Menschen sind1. Unser Wissen über die Koordination zwischen Paarung, Rekombination und Synapse wurde durch Studien in einer Vielzahl von Organismen, wie Hefe, C. elegans,Maus und Drosophila,unter anderem2erleichtert. Während der allgemeine Prozess der homologen Chromosomenpaarung, gefolgt von Segregation, gut konserviert ist, variiert seine Abhängigkeit von Rekombination und Synapse und die Reihenfolge dieser Ereignisse.
Meiotische Doppelstrangbruchbildung (DSB), die eine homologe Rekombination initiiert, tritt in der Nähe von Telomere auf, die während Leptotene im Bouquet gebündelt sind, und Synapse folgt kurz nach3,4. Diese Konfiguration der DSB-Bildung und Synapsis-Initiation ist auch ein Merkmal der männlichen Meiose beim Menschen, aber nicht in Maus5,6,7,8, was darauf hindeutet, dass Zebrafische als Modell für die menschliche Spermatogenese dienen können. Es gibt auch mehrere praktische Vorteile des Studiums Zebrafisch Meiose. Sowohl Männchen als auch Weibchen durchlaufen Gametogenese während des gesamten Erwachsenenalters, ihre Gonaden sind leicht zugänglich, und Hunderte von Nachkommen werden aus einem einzigen Kreuz erzeugt. Darüber hinaus sind die Embryonen transparent und entwickeln sich extern, was die Früherkennung von Aberrationen in der embryonalen Entwicklung durch aneuploide Gameten3,9erleichtert. Nachteile der Verwendung von Zebrafischen sind, dass sie langsam die Geschlechtsreife erreichen (ca. 60 Tage) und die Menge an Material, das für nukleare Oberflächenausbreitungen benötigt wird, muss von 10-20 erwachsenen Tieren gesammelt werden, abhängig von ihrer Größe.
Meiotische Chromosomenausbreitungspräparate sind ein wichtiges Werkzeug, um die Chromosomendynamik über alle Modellorganismen hinweg zu untersuchen, da Schlüsselsignaturen der meiotischen Chromosomendynamik untersucht werden können. Bei Zebrafischen wurden Schlüsselaspekte des Fortschreitens des meiotischen Programms und der nuklearen Organisation durch die Sondierung von nuklearen Oberflächenausbreitungen, hier als Chromosomausbreitung bezeichnet, mit Antikörpern zum Immunfluoreszenznachweis von Proteinen und/oder Nukleinsäuren durch FISH3,4,9,10,11,12seziert. Tatsächlich kann die polarisierte Lokalisierung von gruppierten Telomere im Bouquet in der Ausbreitungszubereitung erhalten bleiben (Abbildung 1C). Kürzlich haben wir Zebrafisch-Spermatozyten-Chromosom-Spreads zusammen mit Fluoreszenz-Detektionsmethoden und superhochauflösender Mikroskopie verwendet, um das detaillierte Fortschreiten der Zebrafisch-Telomer-Dynamik, homologen Chromosomenpaarung, Doppelstrang-Break-Lokalisierung und Synapsen an wichtigen meiotischen Übergängen3zu klären. Hier stellen wir Methoden zur Vorbereitung von Chromosomenausbreitungen aus Spermatozyten der Zebrafischhoden vor und färben sie anschließend mit fluoreszierenden Peptidnukleinsäure-Sonden (PNA) zu wiederholten Telomersequenzen und Immunfluoreszenznachweis von Chromosomen-assoziierten Proteinen.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Mehrere Handelsmarken verfügbar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugen-Röhrchengestell</td><td>Mehrere Handelsmarken verfügbar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldehyd, methanolfrei</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>2 mL</td><td>Mehrere Handelsmarken verfügbar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm Glasdeckgläser</td><td>Corning</td><td>2980-245</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 mm Glasdeckgläser</td><td>VWR International</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>363696</td><td></td></tr><tr><td>Autoklavenbeutel</td><td>Mehrere Handelsmarken verfügbar</td><td></td><td>Wird zur Herstellung von Kunststoff-Deckgläsern verwendet.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td>Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 mg/ml in sterilem destilliertem Wasser vor.</td></tr><tr><td>Zellsieb, 100 & Mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CF405M Ziegen-Anti-Hühner-IgY (H+L), hochgradig kreuzadsorbiertes</td><td>Biotium</td><td>203775-500uL</td><td>Verwendung bei 1:1000</td></tr><tr><td>Hühner-Anti-zfSycp1</td><td>Erzeugt von Burgess-Labor</td><td>N/A</td><td>Verwendung bei 1:100</td></tr><tr><td>Kollagenase aus Clostridium Histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-Glas</td><td>Mehrere Verfügbare</td><td></td><td></td>Handelsmarken</tr><tr><td>DNase I, Grad II aus der Bauchspeicheldrüse von Rindern</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10014CV</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 5</td><td>Forceps Fine Science Tools</td><td>11252-30</td> Für <td>die Präparierung der Hoden werden zwei benötigt.</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td><td>VWR International</td><td>89429-308</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Hühner-IgY (H+L)-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11039</td><td>Anwendung bei 1:1000</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Hühner-IgY (H+L)-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11042</td><td>Verwendung bei 1:1000</td></tr><tr><td>Ziege anti-hDMC1</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-8973</td><td>Funktioniert nicht in unseren Händen</td></tr><tr><td>Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>Anwendung bei 1:1000</td></tr><tr><td>Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11012</td><td>Verwendung bei 1:1000</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Feuchtigkeitskammer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-3683</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungsofen</td><td>VWR International</td><td>230401V (Modell 5420)</td><td></td></tr><tr><td>Inkubatorschüttler</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Modell Classic C25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimerbly-Clark Professional</td><td>34155</td><td>Wird für die Feuchtigkeitskammer</td></tr><tr><td>verwendet KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td> Mehrere <td>Handelsmarken verfügbar</td><td></td><td>Jedes Standardmikroskop, das eine mindestens ~1,65-fache Vergrößerung ermöglicht, ist ausreichend.</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-HamsterSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>Funktioniert nicht in unseren Händen</td></tr><tr><td>Maus Anti-hMLH1</td><td>BD Biosciences 550838</td><td></td><td>Funktioniert nicht in unseren</td></tr><tr><td>Händen Maus Anti-hRPA</td><td>Sigma-Alrich</td><td>MABE285</td><td>Funktioniert nicht in unseren Händen</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &middot; 7 H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Transferpipetten</td> Mehrere <td>Handelsmarken verfügbar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PNA TelC-Alexa647</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1013</td><td>Vorbereiten gemäß Hersteller" s Anweisungen.</td></tr><tr><td>PNA TelC-Cy3</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>Bereiten Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Eindeckmittel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Eindeckmittel gegen Ausfaden mit DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-hRPA</td><td>Bethyl</td><td>A300-244A</td><td>Verwendung bei 1:300</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-hSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab150292</td><td>Verwendung bei 1:200</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-hRad51</td><td>GeneTex</td><td>GTX100469</td><td>Verwendung bei 1:300</td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Fisher</td><td>Scientific S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Supercut Schere, 30° Winkel, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-353</td><td>Kann auch mit jeder kleinen Schere verwendet werden.</td></tr><tr><td>Sylgard Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9897184</td><td>Bereiten Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>In sterilem destilliertem Wasser verdünnen, um eine 20%ige Arbeitslösung herzustellen. Bei Raumtemperatur lagern. Triton X-100 bildet einen Niederschlag, wenn es in Wasser verdünnt wird; Niederschlag löst sich über Nacht auf.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington Biochemischer</td><td>LS003708</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Inhibitor aus Hühnereiweiß</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td> In <td>sterilem destilliertem Wasser verdünnen, um eine 20%ige Arbeitslösung herzustellen. Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Vannas Federschere - 4 mm (Mikroschere)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr></tbody></table>

zubereitung von meiotischen chromosomenaufstrichen aus zebrafisch spermatozyten

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiose ist der wichtigste zelluläre Prozess erforderlich, um haploide Gameten für die sexuelle Reproduktion zu erstellen. Modellorganismen haben entscheidend dazu beigetragen, die Chromosomenereignisse zu verstehen, die während der meiotischen Prophase stattfinden, einschließlich der Paarungs-, Synapsen- und Rekombinationsereignisse, die eine korrekte Chromosomensegregation gewährleisten. Während die Maus ein wichtiges Modell für das Verständnis der molekularen Mechanismen war, die diesen Prozessen zugrunde liegen, sind nicht alle meiotischen Ereignisse in diesem System analog zur menschlichen Meiose. Kürzlich haben wir das spannende Potenzial des Zebrafisches als Modell der menschlichen Spermatogenese demonstriert. Hier beschreiben wir detailliert unsere Methoden zur Visualisierung meiotischer Chromosomen und zugehöriger Proteine in Chromosomenausbreitungspräparaten. Diese Präparate haben den Vorteil, dass eine hochauflösende Analyse von Chromosomenstrukturen möglich ist. Zunächst beschreiben wir das Verfahren zur Zersebung von Hoden von erwachsenen Zebrafischen, gefolgt von Zelldissoziation, Lyse und Verbreitung der Chromosomen. Als Nächstes beschreiben wir das Verfahren zum Nachweis der Lokalisation von meiotischen Chromosomenproteinen durch Immunfluoreszenznachweis und Nukleinsäuresequenzen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Diese Techniken umfassen eine nützliche Reihe von Werkzeugen für die zytologische Analyse der meiotischen Chromatin-Architektur im Zebrafischsystem. Forscher in der Zebrafischgemeinschaft sollten in der Lage sein, diese Techniken schnell zu beherrschen und in ihre Standardanalysen der Fortpflanzungsfunktion zu integrieren.

Wir haben eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung von Zebrafisch Spermatozyten-Spread-Präparate skizziert. Bei korrekter Durchgeführte ergibt unser Verfahren gut verteilte, nicht überlappende Kerne. Um solche Kerne zurückzugewinnen, ist es wichtig, die entsprechende Menge an Ausgangsmaterial (d.h. Hoden), Hoden für eine ausreichende Dauer in Trypsin und eine ausreichende Anzahl von DNase I Behandlungen zu behandeln. Diese Aufstriche können dann für Telomere und meiotische Protein...

Nukleare Oberflächenausbreitungen sind ein unverzichtbares Werkzeug, um Chromosomenereignisse während der Meiose zu untersuchen. Hier zeigen wir eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung meiotischer Chromosomen während der Prophase I aus Zebrafisch-Spermatozyten.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafisch entwickelt sich zu einem ausgezeichneten Wirbeltiermodell für die Untersuchung der Chromosomenereignisse der Meiose einschließlich homologer Chromosomenpaarung, Synapsis und Rekombination. Dieses Protokoll zur Verbreitung nuklearer Oberflächen hat es uns ermöglicht, die wichtigsten Merkmale der meiotischen Chromosomenarchitektur mithilfe der Superauflösungsmikroskopie zu visualisieren. Forscher können Hunderte von gut verteilten Kernen pro Rutsche mit weniger Schutt als andere Zebrafisch-Verbreitungprotokolle erwarten.Der technisch anspruchsvollste Teil dieses Verfahrens ist die Zerlegung der Zebrafischhoden, da sie sich in unmittelbarer Nähe zur Haut befinden und auch an anderen Organen befestigt sind. Die Visualisierung des Sezierverfahrens ermöglicht es den Forschern zu wissen, was sie erwartet, wenn sie die Imobaden im Gewebe des Tieres eingebettet sehen. Nach der Einschläferne männlicher Zebrafische enthaupten Sie einen Fisch nach dem anderen mit einer kleinen Schere und verwenden Sie dann eine Mikroschere, um entlang der ventralen Mittellinie zu schneiden, um die Körperhöhle freizulegen.Legen Sie den Fisch in eine silikonbeschichtete Petrischale und decken Sie ihn

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dies ist ein Verfahren zur Erzeugung gynogenetic diploid Zebrafischembryonen (Embryonen, deren einzige genetische Beitrag kommt von der Mutter) durch die Blockierung der zweiten Reifeteilung unmittelbar nach der Befruchtung mit UV-Licht-inaktivierten Sperma. EP Embryonen sind nicht vollständig homozygot durch Rekombination während der ersten meiotischen Teilung, aber sie sind homozygot überhaupt loci, die nicht von ihrem Zentromer wurden durch Rekombination getrennt.

Machen Gynogenetic Diploid Zebrafisch von Anfang Druck

Es wird ein Protokoll für die Vorbereitung hochwertiger mitotischer pflanzlicher Chromosomenausbreitungen durch eine schnelle Air-Dry-Dropping-Methode beschrieben, die für den FISH-Nachweis von Einzel- und High-Copy-DNA-Sonden geeignet ist.

Eine schnelle Klima trockenen Dropping Chromosom Herstellungsverfahren Geeignet für FISH in Pflanzen

Mitose ist für jeden lebenden Organismus von entscheidender Bedeutung und Defekte führen oft zu Krebs und Entwicklungsstörungen. Mit diesem Bildgebungsprotokoll und dem Zebrafisch als Modellsystem können Forscher die Mitose in einem lebenden Wirbeltierorganismus und die Vielzahl von Defekten sichtbar machen, die entstehen, wenn mitotische Prozesse defekt sind.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Ein modifiziertes Protokoll zur Ploidie Manipulation verwendet einen Hitzeschock eine Ein-Zyklus-Stall in cytokinesis im frühen Embryo zu induzieren. Dieses Protokoll wird in dem Zebrafisch gezeigt, sondern kann auf andere Arten anwendbar.

Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

Meiose ist der Entwicklungsprozess durch den Gameten durch eine einzelne Runde der DNA-Replikation und zwei aufeinanderfolgenden Runden Chromosom Segregation gebildet werden. Säugetier-Meiose kann untersucht werden, durch die Verwendung einer Technik um meiotische Chromosomen breitet sich vorzubereiten. Hier zeigen wir einen Weg der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.

Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten

Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit der Methode in fünf verschiedenen Zebrafisch-Sorten getestet.

Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung

Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Hier stellen wir eine einfache Methode zur Trennung von Follikelzellen und Eizellen in Zebrafisch-Ovarialfollikel vor, die Untersuchungen der Eierstockentwicklung bei Zebrafischen erleichtern.

Trennung von Follikulärzellen und Oozyten in Denrogarischen Follikel von Zebrafischen

Die CRISPR-Cas-Technologien haben die Genom-Editierung revolutioniert. Das Finden und Isolieren der gewünschten Keimbahnreduktion bleibt jedoch ein großer Engpass. Daher beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum schnellen Screening von F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien auf Keimbahn-Editierungen unter Verwendung von Standard-PCR-, Restriktionsverdauungs- und Gelelektrophoresetechniken.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

Meiotische Fehler in Synapsen und Rekombination sind bei Säugetier-Eizellen üblich. Eine rigorose Analyse der Proteine, die an diesen Prozessen beteiligt sind, ist unerlässlich, um zu verstehen, wie und warum die Oogenese oft schief geht. Die hier vorgestellten Techniken ermöglichen ein umfassendes Monitoring von Rekombination und Synapsen, um die Eizellqualität bei Mäusen zu bewerten.

Präparation meiotischer Chromosomenspreizungen aus Maus-Eizellen zur Beurteilung von Synapse und Rekombination

Lernen Sie die Präparation meiotischer Chromosomenaufstriche aus Zebrafisch-Spermatozyten mit Superresolution-Mikroskopie. Diese Methode liefert hunderte gut verteilter Kerne pro Objektträger mit weniger Debris.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

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