Name: Ex Vivo Druck hippocampal Kapillare-Parenchymale Arteriole Vorbereitung für die funktionelle Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Präparation von Kapillaren und Arteriolen aus dem Hippocampus der Maus für Druck-Myographie und immunfluoreszenzbasierte Analysen. Diese ex vivo Methode ermöglicht die Untersuchung vaskulärer Signalwege ohne Störeinflüsse umliegender Hirngewebe.

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Die Autoren danken Jules Morin für die aufschlussreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Forschung wurde durch Auszeichnungen der gemeinnützigen Organisation CADASIL Together We Have Hope, des Center for Women es Health and Research und des NHLBI R01HL136636 (FD) finanziert.

Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Colorado, Anschutz Medical Campus, genehmigt und nach den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt.
1. Lösungen
<ol><li>Verwenden Sie MOPS-gepufferte Saline für die Sezierung und halten Sie Proben bei 4 °C vor ihrer Nutzung. Vergasen Sie die Lösung nicht. Bereiten Sie MOPS gepufferte Saline mit folgender Zusammensetzung vor: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM Glukose, 3 mM MOPS, 0,02 mM EDTA, 2 mM Pyruvat, 10 mg/mL Rinderserumalbumin, pH 7,3 bei 4 °C.</li>
	<li>Verwenden Sie künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) als Badlösung und Pipettenlösung. Gas sowohl aCSF und Ca2+-frei aCSF mit 5% CO2, 20% O2, und N2 Balance. Bereiten Sie die Lösung mit der folgenden Zusammensetzung vor: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 4 mM Glucose, 2 mM CaCl2, pH 7.3 (mit Belüftung mit 5% CO2, 20% O2und N2 Balance).</li>
	<li>Erhalten Sie die maximale Dilatation in nominell Ca2+-frei aCSF (0 mM [Ca2+]o, 5 mM EGTA).</li>
</ol>2. Orgelkammervorbereitung
<ol><li>Borosilikatglaskapillaren (Außendurchmesser = 1,2 mm; Innendurchmesser = 0,69 mm; Länge = 10 cm) in einen Glasabzieher einlegen. Ziehen Sie die Kapillare, um eine lange, dünne Spitze an einem Ende zu machen.</li>
	<li>Auf einer Seite der Kammer, fügen Sie eine Kanüle, die zu einer Miniatur-Peristaltikpumpe verbinden kann, um das Gefäß luminally unter Druck zu setzen. Unter einem Seziermikroskop die Spitze der Kanüle so brechen, dass sie klein genug ist, um in das Gefäß des Interesses zu passen, aber groß genug, um Lösungen durch die Spitze fließen zu lassen. Stellen Sie sicher, dass die Spitze einen Durchmesser von ca. 10-15 m hat.</li>
	<li>Füllen Sie die Kanüle mit einer Spritze mit einem angeschlossenen 0,22 m Filter mit sauerstoffhaltigem aCSF. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen oder Schmutz in der Kanüle befinden.</li>
	<li>Fügen Sie auf der gegenüberliegenden Seite der Kammer zwei weitere Kanülen hinzu. Brechen Sie nicht ihre Spitzen.</li>
</ol>3. Hippocampus-Sektion und Isolierung
<ol><li>Eine Maus verleiten und enthaupten. Verwenden Sie für dieses Experiment eine 8 Wochen alte C57BL6/J-Maus, um Unterschiede zwischen Männern und Frauen zu vergleichen. Injizieren Sie die Maus mit Pentobarbital und enthaupten Sie mit chirurgischer Schere.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut mit einer kleinen Sezierschere entlang der Mittellinie an der Oberseite ihres Kopfes. Bewegen Sie die Haut an den Seiten.</li>
	<li>Beginnend an der kaudalen Seite des Schädels, schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie, bis die olfaktorischen Zwiebeln erreicht sind. Entfernen Sie Teile des Schädels, bis das Großhirn freigelegt ist.</li>
	<li>Entfernen Sie langsam das Gehirn, beginnend in der Nähe der Nase der Maus. Trennen Sie das Gehirn von den Riechzwiebeln, Denhirnnerven und dem Rückenmark, indem Sie die Strukturen mit der kleinen Sezierschere durchschneiden.</li>
	<li>Legen Sie das Gehirn in eine Sezierplatte mit genügend MOPS-Lösung, um es vollständig zu versenken. Platzieren Sie das Gehirn mit einem Seziermikroskop in der Mitte der Sezierplatte mit der ventralen Seite nach unten.</li>
	<li>Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie das Gehirn in der Hälfte entlang der Längsspalte. Halten Sie die Klinge so, dass die scharfe Kante parallel zur Unterseite der Sezierplatte verläuft. Drücken Sie die Klinge auf einen Schlag durch das Gehirn. Bewegen Sie eine Hemisphäre zur Seite der Platte.</li>
	<li>Führen Sie die folgenden Schritte für jede Hemisphäre einzeln oder parallel aus.<ol>
<li>Platzieren Sie eine Hemisphäre in der Mitte der Platte, so dass die Mittellinie nach unten gerichtet ist. Dann verwenden Sie die Rasierklinge entlang der Querspalte entlang, um das Kleinhirn und den Hirnstamm zu entfernen. Drücken Sie die Klinge gerade durch das Gewebe.</li>
		<li>Drehen Sie die Halbkugel so, dass die mediale Seite nach oben gerichtet ist (Abbildung 1A). Verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten. Mit einem zweiten Spachtel, legen Sie die Spitze unter dem Corpus callosum und Schaufel darunter, um den Thalamus, Septum, und Hypothalamus zu entfernen, abdeckung der Hippocampus (Abbildung 1B).</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass der Hippocampus nun als gekrümmte Struktur in der Nähe der hinteren Seite des Großhirns sichtbar ist. Verwenden Sie einen Spachtel, um das Großhirn an Ort und Stelle zu halten, verwenden Sie den zweiten Spachtel, um den Hippocampus aus dem Großhirn zu schaufeln (Abbildung 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie das Hippocampi auf eine neue Sezierplatte, die etwa zur Hälfte mit MOPS-Lösung gefüllt ist. Entsorgen Sie den Rest des Gehirns.</li>
</ol>4. Hippocampal Arteriole Isolierung
<ol><li>Führen Sie die folgenden Schritte für jeden Hippocampus aus.<ol>
<li>Setzen Sie einen der Hippocampi mit kleinen Stiften an jedem Ende des Abschnitts. Die Hippocampus-Arterie steht nach oben.</li>
		<li>Mit sehr scharfen Zangen, sanft dehnen kleine Abschnitte des Hippocampus. Dadurch wird das Gewebe, das die Arteriolen umgibt, gelöst, wodurch es einfacher wird, sie zu sezieren.</li>
		<li>Durchsuchen Sie das dorsale Hippocampusgewebe, um die äußere Querarterie zu identifizieren (Abbildung 1C)16,27.</li>
		<li>Greifen Sie vorsichtig die äußere Querarterie und ziehen Sie sie langsam aus dem Gewebe, um die Arteriolen und Kapillaren zu sammeln, die den CA3-Bereich des Hippocampus durchdringen.</li>
		<li>Sobald es keine Gefäße mehr aus dem Gewebe entfernt werden, entsorgen Sie die Hippocampi. Halten Sie die Gefäße auf Eis in Platten, während nicht in Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Hippocampal Kapillare-parenchymale Arteriole-Kannulation
<ol><li>Finden Sie eine Arterie mit einem Ast, der mit Kapillaren endet. Übertragen Sie es in die Orgelkammer. Stellen Sie sicher, dass das Arteriol bei vollständiger Erweiterung ca. 15-30 m beträgt (Abbildung 1D).</li>
	<li>Montieren Sie das Blutgefäß vorsichtig, indem Sie die Kanülenspitze durch die Arterienwand unterhalb des Zielbereichs schieben. Schieben Sie das Gefäß vorsichtig auf die Kanüle, bis genügend Gewebe vorhanden ist, um die Krawatte aufzubringen.</li>
	<li>Machen Sie einen lockeren Knoten mit 12-0 Nylon Nähte, so dass es über das Blutgefäß und Kanüle passt. Verwenden Sie einen Halben-Hitch-Knoten, um Krawatten zu sichern. Ziehen Sie dann die Enden, um den Knoten zu ziehen und die Arterie an der Kanüle zu sichern. Entfernen Sie alle überflüssigen Gefäßzweige unter der Krawatte, indem Sie sie vorsichtig mit Zangen ziehen.</li>
	<li>Machen Sie eine weitere Krawatte und sichern Sie es am anderen Ende der Arterie, um sie zu versiegeln.</li>
	<li>Senken Sie die Kanüle mit dem befestigten Gefäß, bis es flach gegen den Deckelrutsch auf der Unterseite der Kammer ist. Achten Sie darauf, die Kanüle nicht zu stark zu senken, oder es wird brechen.</li>
	<li>Mit einer Kanüle auf der gegenüberliegenden Seite der Kammer, senken Sie es, so dass der Punkt davon die Krawatte am Ende der Arterien festsetzt.</li>
	<li>Verwenden Sie die dritte Kanüle, um den Kapillarzweig an den Deckelzuschlag festzunageln. Platzieren Sie die Spitze nahe am Ende des Asts, während Sie die Enden der Kapillaren exponiert lassen (nicht unter der Kanüle).</li>
</ol>6. Druckmyographie
<ol><li>Bewegen Sie die Kammer mit der Aufnahmesoftware vom Sezierbereich auf das Mikroskop.</li>
	<li>Schließen Sie den Zu- und Abflussschlauch zur Durchblutung an die Kammer an. Beginnen Sie die Perfusion mit erhitztem aCSF (37 °C) bei einer Durchflussrate von 4 ml/min.</li>
	<li>Befestigen Sie die Druckkanüle an einer peristaltischen Pumpe gepaart mit einem Druckaufnehmer und bringen Sie den Innendruck auf 20 mm Hg.</li>
	<li>Starten Sie die Aufnahmesoftware. Passen Sie die Einstellungen für das Mikroskop und die Bildgebung an, um ein möglichst klares Bild zu erhalten. Beginnen Sie die Aufzeichnung, sobald die Einstellungen für die Erkennungssoftware optimiert sind.</li>
	<li>Erhöhen Sie den Druck des Behälters auf bis zu 40 mm Hg, während Sie den Arteriendurchmesser mit einer Kantenerkennungssoftware aufzeichnen.</li>
	<li>Lassen Sie die MOPS-Lösung mit einem CSF aus der Kammer waschen und lassen Sie die HiCaPA-Zubereitung ausgleichen und myogenen Ton entwickeln.</li>
	<li>Um die Lebensfähigkeit eines Behälters zu testen, wenden Sie 1 M NS309-Lösung auf die Badperfusion an (siehe Abbildung 2A,B und Abschnitt Repräsentative Ergebnisse). Das arteriolar Segment muss sich erweitern und zeigt etwa 30-40% myogenen Ton, wie zuvor beschrieben3,14,20.</li>
</ol>7. Fokale Stimulation von Kapillarenden
<ol><li>Sobald der Ausgangston für die Artezolalermittelte festgelegt und die Endothelfunktion bewertet wurde, testen Sie das Ansprechen der Kapillarstimulation.</li>
	<li>Mit einem Glasabzieher, machen Kanülen, so dass es einen feinen Punkt an einem Ende. Brechen Sie die Spitze aus einer Kanüle, so dass das getestete Medikament durch die Spitze reibungslos bei 5 psi fließen kann.</li>
	<li>Füllen Sie die Kanüle mit der Wirkstofflösung von Interesse und fügen Sie sie zu einem 3-Achsen-Mikromanipulator am Mikroskop befestigt. Schließen Sie die Schläuche vom Druckauswurfsystem an die Kanüle an.</li>
	<li>Senken Sie langsam die Kanüle in das Bad in der Nähe der Kapillaren, achten Sie darauf, keinen Teil des Gefäßes oder Hardware in der Kammer zu treffen. Manövrieren Sie die Spitze der Kanüle neben den Enden der Kapillaren, ohne sie zu berühren. Halten Sie die Spitze der Kanüle direkt neben dem Deckelschlupf, um zu verhindern, dass das Gefäß stimuliert wird, wenn die Kanüle austritt.</li>
	<li>Wenn Sie bereit sind, die Kapillaren zu stimulieren, senken Sie die Kanüle auf den Deckelrutsch und direkt neben den Kapillaren. Aktivieren Sie das Druckauswurfsystem mit der gewünschten Auswurfzeit (hier 20 s). Sobald die Stimulation abgeschlossen ist, heben Sie die Kanüle leicht an, um eine weitere Stimulation zu vermeiden.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Stimulation bei Bedarf. Ändern Sie die Kanüle des Druckauswurfsystems, um verschiedene Wirkstoffverbindungen zu testen.</li>
	<li>Um zu bestätigen, dass nur die Kapillaren stimuliert werden, füllen Sie die Kanüle mit 1 M NS309 Lösung und wiederholen Sie die oben genannten Schritte. HINWEIS: Kapillaren-Endothelzellen drücken keine K+ Kanäle aus, die durch NS309 aktiviert werden, so dass die Arteriole nicht auf die Stimulation reagieren darf. Wenn sich die Arteriole datiert, muss die Kanüle neu positioniert werden, oder der Durchmesser der Bohrung muss kleiner sein (siehe Abbildung 2A,B und abschnitt repräsentative Ergebnisse).</li>
</ol>

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<li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li>
<li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis%2C+potentially+impacting+cognitive+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die unter Druck stehende HiCaPA (hippocampal kapillar-parenchymale Arteriole) Präparation, die in diesem Manuskript beschrieben wird, ist eine Erweiterung unseres etablierten Verfahrens zur Isolierung, Unterdruck bildung und Untersuchung von parenchymalen Arteriolen29. Wir berichteten vor kurzem, dass Kir2.1 Kanäle in Gehirnkapillaren Endothelzellen Wahrnehmen steigt in [K+]o mit neuronaler Aktivierung verbunden, und erzeugen ein aufsteigendes hyperpolarisierendes Signal, das...

Die piale Zirkulation auf der Oberfläche des Gehirns war Gegenstand vieler Untersuchungen, teilweise wegen seiner experimentellen Zugänglichkeit. Die Topologie der zerebralen Vaskulatur schafft jedoch unterschiedliche Regionen. Im Gegensatz zum robusten pialen Netzwerk reich an Anastomosen mit beträchtlicher Kapazität zur Umleitung des Blutflusses, die intrazerebralen parenchymalen Arteriolen (PAs) bieten eine begrenzte Kollateralversorgung, die jeweils ein diskretes Volumen an Nervengewebe1,2durchdringen. Dies erzeugt einen Engpass-Effekt auf den Blutfluss, die, kombiniert mit einzigartigen physiologischen Merkmalen3,4,5,6,7,8, macht intracerebral arterioles eine entscheidende Stelle für zerebrale Durchblutung (CBF) Regulierung9,10. Trotz der technischen Herausforderungen, die mit der Isolierung und Cannulation von PAs verbunden sind, hat das Interesse an ex vivo funktionellen Studien mit Druckgefäßen11,12,13,14,15,16,17zugenommen. Einer der Gründe für dieses erhöhte Interesse ist der beträchtliche Forschungsaufwand an neurovaskulärer Kopplung (NVC), dem Mechanismus zur Erhaltung der funktionellen Hyperämie des Gehirns18.
Regional kann CBF nach lokaler neuronaler Aktivierung schnell ansteigen19. Die zellulären Mechanismen und Signaleigenschaften, die NVC steuern, sind unvollständig verstanden. Wir identifizierten jedoch eine bisher unerwartete Rolle für die Hirnkapillaren während NVC bei der Erfassung der neuronalen Aktivität und der Übersetzung in ein hyperpolarisierendes elektrisches Signal zur Ausgliederung der vorgelagerten Arteriolen20,21,22. Aktionspotentiale23,24 und Öffnung von Großleitfähigkeit Ca2+-aktivierten K+ (BK) Kanälen auf den astrozytischen Endfüßen25,26 erhöhen die interstitielle Kaliumionenkonzentration [K+]o, was zur Aktivierung starker nachinnen gleichrichternder K+ (Kir) Kanäle im vaskulären Endothel von Kapillaren führt. Dieser Kanal wird durch externes K+, aber auch durch Hyperpolarisation selbst aktiviert. Der hyperpolarisierende Strom, der sich durch Spaltknoten ausbreitet, regeneriert sich dann in benachbarten Kapillaren-Endothelzellen bis zur Arteriole, wo er Myozytenentspannung und CBF-Erhöhung20,21verursacht. Die Untersuchung dieses Mechanismus führte uns dazu, ein unter Druck stehendes kapillar-parenchymale Arteriol (CaPA) Präparat zu entwickeln, um den arteriolaren Durchmesser während der Kapillarstimulation mit vasoaktiven Wirkstoffen zu messen. Das CaPA-Präparat besteht aus einem kanülierten intracereralen Arteriolsegment mit einer intakten, nachgeschalteten Kapillarverzweigung. Die Kapillarenden werden durch eine Mikropipette gegen den Kammerglasboden verdichtet, die die gesamte Gefäßbildung verdichtet und stabilisiert20,21.
Wir haben zuvor instrumentale Innovationen durch die Abbildung CaPA-Präpa-Präpa-Präpa-Präpaden aus dem Mauskortex20,21 und Arteriolen aus der Rattenamygdala13 und hippocampus16,17gemacht. Da die Hippocampus-Vaskulatur aufgrund ihrer Anfälligkeit für pathologische Bedingungen mehr Aufmerksamkeit erhält, bieten wir hier eine Schritt-für-Schritt-Methode zur CaPA-Vorbereitung aus dem Maus-Hippocampus (HiCaPA), die nicht nur in funktionellen NVC-Studien, sondern auch in der Molekularbiologie, Immunchemie und Elektrophysiologie eingesetzt werden kann.

<table><tbody><tr><td>0.22&Mikro; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229751</td><td></td></tr><tr><td>12-0 Nylon (12cm) Schwarz</td><td>Microsurgery Instruments, Inc</td><td>S12-0 NYLON</td><td></td></tr><tr><td>Automatischer Temperaturregler</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas Außendurchmesser: 1,2 mm, Innendurchmesser: 0,68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsbereich</td><td>Olympus</td><td>SZ11</td><td></td></tr><tr><td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &mdash; komplette Pumpe mit Antrieb und MS/CA 4-12 Pumpenkopf</td><td>Ismatec</td><td>ISM 1090</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Inline-Warmwasserbereiter</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Integra&Trade; Miltex&Handel; Gewebezange</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>MgCl wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>ML 133 Hydrochlorid</td><td>Tocris</td><td>4549</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>NS309</td><td>Tocris</td><td>3895</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III - Intrazelluläre Mikroinjektions-Dosiersysteme, 2-Kanal</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Druckservoregler mit Schlauchpumpe</td><td>Living Systems Instrumentierung</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>Superfeinzange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere - Scharf-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Vertikaler Mikropipettenabzieher</td><td>Narishige</td><td>PP-83</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo druck hippocampal kapillare-parenchymale arteriole vorbereitung für die funktionelle studie

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Von subtilen Verhaltensänderungen bis hin zu Demenz im spätstadium entwickelt sich in der Regel eine vaskuläre kognitive Beeinträchtigung nach zerebraler Ischämie. Schlaganfall und Herzstillstand sind bemerkenswert geschlechtsdiamorphe Erkrankungen, und beide induzieren zerebrale Ischämie. Der Fortschritt beim Verständnis der vaskulären kognitiven Beeinträchtigung und der Entwicklung geschlechtsspezifischer Behandlungen wurde jedoch teilweise durch Herausforderungen bei der Untersuchung der Mikrozirkulation des Gehirns aus Mausmodellen in funktionellen Studien begrenzt. Hier stellen wir einen Ansatz zur Untersuchung der Kapillar-Arteriole-Signalisierung in einem ex vivo hippocampalen Kapillar-Parenchymal-Arteriole (HiCaPA)-Präparat vom Maushirn vor. Wir beschreiben, wie man die Mikrozirkulation isoliert, cannulate und unter Druck setzt, um den Arteriolardurchmesser als Reaktion auf die Kapillarstimulation zu messen. Wir zeigen, welche geeigneten funktionellen Kontrollen verwendet werden können, um die Integrität der HiCaPA-Präparation zu validieren und typische Ergebnisse anzuzeigen, einschließlich der Prüfung von Kalium als neurovaskulärem Kopplungsmittel und der Wirkung des kürzlich charakterisierten Inhibitors der Kir2-Inwärtsrektifigungs-Kaliumkanalfamilie ML133. Darüber hinaus vergleichen wir die Reaktionen in Präparaten von männlichen und weiblichen Mäusen. Während diese Daten funktionelle Untersuchungen widerspiegeln, kann unser Ansatz auch in molekularbiologischen, Immunchemie- und Elektrophysiologiestudien verwendet werden.

Endotheliale Kleinleitfähigkeit (SK) und Zwischenleitfähigkeit (IK) Ca2+-sensitive K+ Kanäle üben einen dilatatorischen Einfluss auf den Durchmesser von PAs aus. Badapplikation von 1 M NS309, einem synthetischen IK- und SK-Kanalagonisten, verursachte eine nahezu maximale Dilatation (Abbildung 2A,B). Kapillaren-Endothelzellen fehlen jedoch keine IK- und SK-Kanäle und haben als Reaktion auf NS30920k...

Das vorliegende Manuskript beschreibt, wie Hippocampus-Arteriolen und Kapillaren aus dem Maushirn isoliert werden können und wie man sie für Druckmyographie, Immunfluoreszenz, Biochemie und molekulare Studien unter Druck setzt.

Ex Vivo Druck hippocampal Kapillare-Parenchymale Arteriole Vorbereitung für die funktionelle Studie

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Unsere Methode ermöglicht die Untersuchung von Blutgefäßen in Strukturen, die sonst in Vivo schwer abzubilden wären, wie z. B. dem Hippocampus. Da die Blutgefäße aus dem Hirngewebe entfernt werden, kann die Signalisierung zwischen den Kapillaren und der Arteriole ohne off-target-Effekte auf das umgebende Gewebe untersucht werden. Um den Hippocampus zu isolieren, verwenden Sie eine kleine Sezierschere, um die Haut entlang der Mittellinie an der Oberseite des Mauskopfes zu schneiden und die Haut an die Seiten zu bewegen.Beginnend an der kaudalen Seite des Schädels, schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie, bis die olfaktorischen Zwiebeln erreicht sind und entfernen Sie Teile des Schädels, bis das Großhirn freigelegt wird. Beginnend in der Nähe der Nase der Maus, langsam entfernen Sie das Gehirn, mit der Schere durch die Olfaktor-Glühbirnen schneiden, Hirnnerven, und Rückenmark. Tauchen Sie das Gehirn, ventrale Seite nach unten in MOPS Gepufferte Kochlinie, in der Mitte einer Sezierplatte, und legen Sie die Platte unter einem Seziermikroskop.Halten Sie die scharfe Kante parallel zum Boden der Schale, verwenden Sie Rasierklinge, um das Gehirn in der Hälfte entlang der Längsspalte in einem Schlag zu schneiden. Platzieren Sie eine Hemisphäre in der Mitte der Platte mit der Mittellinie nach unten und drücken Sie die Rasierklinge gerade durch das Gewebe entlang der Querspalte, um das Kleinhirn und den Hirnstamm zu entfernen. Drehen Sie die Hemisphäre so, dass die mediale Seite nach oben gerichtet ist, und verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten.Setzen Sie die Spitze eines zweiten Spachtels unter dem Corpus callosum ein und schaufeln Sie unter dem Gewebe, um Thalamus, Septum und Hypothalamus aus dem Hippocampus zu entfernen. Der Hippocampus sollte nun als gekrümmte Struktur in der Nähe der hinteren Seite des Großhirns sichtbar sein. Verwenden Sie einen Spachtel, um das Großhirn an Ort und Stelle zu halten, verwenden Sie den zweiten Spachtel, um den Hippocampus aus dem Großhirn zu schaufeln.Dann den Hippocampi auf eine neue Sezierplatte übertragen, die etwa zur Hälfte mit frischer MOP-Lösung gefüllt ist. Für hippocampale Arteriole Isolierung, legen Sie kleine Stifte an jedem Ende eines Hippocampus, um die Probe Hippocampus Arterie Seite nach oben zu sichern. Mit sehr scharfen Zangen, dehnen Sie sanft kleine Abschnitte des Hippocampi, um das Gewebe um die Arteriolen zu lösen.Und durchforsten Sie die dorsalen Hippocampusgewebe, um die äußeren Transversalarterien zu identifizieren. Wenn die Arterie gefunden wurde, greifen Sie die äußere Querarterie aus dem Hippocampus und ziehen Sie sie langsam aus dem Gewebe, um die Arteriolen und Kapillaren zu sammeln. Die Arterie aus jedem Hippocampus wird separat entfernt.Wenn keine Gefäße mehr entfernt werden müssen, legen Sie die Proben auf Eis und entsorgen Sie das verbleibende Hippocampusgewebe. Für die Cannulation der Arteriolen, lokalisieren und Arteriole mit einem Zweig, der mit Kapillaren endet und legen Sie die Arteriole in eine Orgelkammer. Schieben Sie die Kanülenspitze vorsichtig durch die Arterienwand unterhalb des Zielbereichs, um das Blutgefäß zu montieren.Dann schieben Sie das Gefäß vorsichtig auf die Kanüle, bis genügend Gewebe vorhanden ist, auf das sie die Krawatte legen kann. Verwenden Sie 12-0 Nylon Nähte, um einen lockeren Knoten zu machen, der über das Blutgefäß und die Kanüle passt, und verwenden Sie einen halben Hakenknoten, um die Krawatten zu sichern, ziehen Sie die Enden, um den Knoten zu ziehen, um die Arterie an der Kanüle zu sichern. Sichern Sie eine weitere Krawatte am anderen Ende der Arterie, um sie zu versiegeln.Auf der gegenüberliegenden Seite der Kammer, senken Sie eine zweite Kanüle, bis der Punkt der Kanüle die Krawatte am Ende der Arterie nistet. Verwenden Sie dann eine dritte Kanüle, um den Kapillarzweig an den Deckelzuschlag zu heften und die Spitze nahe am Ende des Asts zu platzieren, während die Enden der Kapillaren freigelegt werden. Da die Mikrozirkulation des Gehirns exquisit zerbrechlich ist, achten Sie darauf, die Dehnung und Handhabung der Gefäße während des Cannulationsverfahrens zu minimieren, um das Überleben der Arteriolen zu gewährleisten.Für die Druckmyographieanalyse übertragen Sie die Kammer mit Aufnahmesoftware auf eine Lichtmikroskopstufe und verbinden Sie die Zu- und Abflussschläuche zur Überflutung mit der Kammer. Beginnen Sie die Profusion mit 37 Grad Celsius Künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit mit einem Durchfluss von vier Millilitern pro Minute und befestigen Sie die Druckkanüle an der peristaltischen Pumpe gepaart mit einem Druckwandler. Bringen Sie den innendruck auf 20 Millimeter Quecksilber und starten Sie die Aufnahmesoftware.Passen Sie das Mikroskop und die Bildeinstellungen an, um ein möglichst klares Bild zu erzielen. Und verwenden Sie die Edge Detection Software, um zu überprüfen, ob die Arteriole etwa 15 bis 30 Mikrometer im Durchmesser hat, wenn sie vollständig erweitert ist. Sobald die Einstellungen optimiert wurden, beginnen Sie mit der Aufnahme und erhöhen Sie den intravaskulären Druck im Gefäß bis zu 40 Millimeter Quecksilber, während Sie den Arteriendurchmesser mit der Edge Detection Software aufzeichnen.Dann die Kammer für 15 bis 20 Minuten überziehen, um die MOP-Lösung auszuwaschen. Um die Lebensfähigkeit des Gefäßes zu testen, wenden Sie eine Mikromolar NS309-Lösung auf die Badprofusion an, das arteriolarSegment sollte sich erweitern und einen 30 bis 40% myogenen Ton aufweisen. Sobald der Grundton für die Arterie festgelegt wurde, verwenden Sie einen Glasabzieher, um Kanülen mit einem feinen Punkt an einem Ende zu machen, und verwenden Sie Zangen, um die Spitze jeder Kanüle zu brechen, so dass das Medikament von Interesse reibungslos durch die Spitze bei fünf Pfund Druck pro Quadratzoll fließen kann.Füllen Sie die Kanüle mit dem Medikament von Interesse. Und laden Sie die Kanüle auf einen dreiachsigen Mikromanipulator, der am Mikroskop befestigt ist. Schließen Sie die Schläuche vom Druckauswurfsystem an die Kanüle an und senken Sie die Kanüle langsam in das Bad in der Nähe der Kapillaren, wobei darauf geachtet wird, dass kein Teil des Gefäßes oder der Kammer getroffen wird.Um die Kapillaren zu stimulieren, senken Sie die Kanüle auf den Deckelrutsch direkt neben den Kapillaren und aktivieren Sie das Druckauswurfsystem mit der gewünschten Auswurfzeit. Am Ende der Stimulation die Kanüle leicht anheben, um eine weitere Stimulation zu vermeiden. Um zu bestätigen, dass nur die Kapillaren stimuliert wurden, füllen Sie die neue Kanüle mit einem Mikromolaren der NS309-Lösung und stimulieren Sie die Kapillaren, wie gezeigt.Dann erhalten Sie die maximale Vasodilatation, indem Sie die Zubereitung mit der Calcium-freien Lösung baden. Die Bathapplikation eines einmikromollaren NS309 verursacht eine nahezu maximale Dilatation der Artezolole aufgrund der Calcium-empfindlichen Kaliumkanäle im Endothel. Kapillaren-Endothelzellen jedoch, fehlen Zwischen- und kleine Leitfähigkeitskanäle und nicht hyperpolarisieren als Reaktion auf den Agonisten, als Ergebnis, stimulierenkapillare Enden mit NS309, verursacht keine vorgelagerte arteriolar Dilatation, dies deutet darauf hin, dass NS309 die Arteriole nicht erreicht hat, und kann als Kontrolle verwendet werden, um die räumliche Beschränkung der Verbindung auf die Kapillare durch Druckauswurf zugreifen.Mit hilfe der hippocampalen Kapillarprävale parenchymale Arteriole-Präparation, wie gezeigt, führt die Anwendung einer künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit, die mit 10 Millimolaren-Kalium auf die Kapillarenenden ergänzt wird, zu einer vorgelagerten arteriolaren Dilatation, die sich nicht zwischen Präparaten von männlichen und weiblichen Mäusen unterscheidet. Darüber hinaus wird durch die Zugabe des Kir2-Inhibitors ML 133 die kapillarinduzierte arteriolare Dilatation als Reaktion auf 10 Millimolar Kalium in Präparaten von männlichen und weiblichen Mäusen praktisch abgeschafft. Bei der Montage des Blutvesssels, begrenzen Sie direkte Wechselwirkungen mit dem Blutgefäß, um die Schäden zu minimieren, und erhöhen Sie die Lebensfähigkeit des Gefäßes.Sobald das Blutgefäß isoliert ist, können verschiedene Wirkstoffverbindungen getestet oder das Blutgefäß für Olekuläre Biologie-, Immunchemie- oder elektrophysiologische Studien weiterverarbeitet werden.

ex-vivo-pressurized-hippocampal-capillary-parenchymal-arteriole

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, mit der die Gefäßarchitektur im Gehirn mittels in vivo und ex vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie quantifiziert werden kann.

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Während die Multiphotonen-Bildgebung nur in begrenzten Tiefen von der Gewebeoberfläche aus effektiv ist, ist es möglich, eine Bildgebung mit einer Auflösung von 3 μm in jeder Tiefe über pCLE zu erreichen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von pCLE-Bildgebung zur Messung der mikrovaskulären Dynamik im Hippocampus von iktalen und Wildtyp-Mäusen vor.

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Isolierte Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe dient als ein präklinischen Modell Barrierefunktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein optimiertes Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe zu isolieren.

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Wir präsentieren eine Methode, die bieten weitere Einblicke in die frühe Ereignisse zugrunde liegenden Neurodegeneration und basiert auf der etablierten Ex-Vivo -Gehirn-Technik verbindet die Vorteile eines in Vivo und in Vitro Experimente. Darüber hinaus stellt es eine einzigartige Gelegenheit zum direkten Vergleich von behandelten und unbehandelten Gruppe in der gleichen anatomischen Ebene.

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Das aktuelle Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Rückverfolgung von ventralen Tegmentalflächen (VTA) Glutamatprojektionen auf den Hippocampus. Die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen wurde mit CA1-Aufnahmen kombiniert, um zu zeigen, wie VTA-Glutamat-Terminals die mutmaßliche pyramidale CA1-Feuerrate in vivo modulieren.

Kombinierte in vivo anatomische und funktionelle Spurensuche von ventralen Tegmentalflächen-Glutamat-Terminals im Hippocampus

Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer "Röhrchen" der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca2+] und des Membranpotentials.

Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Das vorliegende Protokoll bietet eine detaillierte dynamische Echtzeit-Probenahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus wacher Ratten unter Verwendung eines Mikrodialysesystems.

Dynamische Echtzeit-Entnahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus von bewussten Ratten mit Hilfe eines Mikrodialysesystems

Erfahren Sie die Präparation von Kapillaren und Arteriolen aus dem Hippocampus der Maus für Druck-Myographie und immunfluoreszenzbasierte Analysen. Diese ex vivo Methode ermöglicht die Untersuchung vaskulärer Signalwege ohne Störeinflüsse umliegender Hirngewebe.

Ex Vivo Druck hippocampal Kapillare-Parenchymale Arteriole Vorbereitung für die funktionelle Studie

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