Name: Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Lernen Sie die Transplantation muriner Inseln in das leisten-subkutane weiße Fettgewebe zur Behandlung von Diabetes Typ I. Diese Methode ermöglicht stabile Blutzuckerwerte und funktionelle Inseltransplantate.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key F&D Program of China (2017YFC1103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province of China (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).

Alle Verfahren in diesem Protokoll folgten den Grundsätzen des Tierschutzes der Ethik-Überprüfungskommission des Shenzhen Second People es Hospital. Islet-Transplantat-Empfänger und Spender waren 8- bis 10 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse, die vom Medical Animal Center der Provinz Guangdong gekauft wurden. Das Verfahren der Ernte, Isolierung, Kultur oder Verabreichung der geernteten Zellen wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
1. Inselvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie eine Kollagenase Typ V Arbeitslösung vor. Kollagennase Typ V wiegen und mit d-Hank-Puffer auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml auflösen, mit einer spritzengetriebenen Filtereinheit von 0,22 m und einer 60 ml Spritze filtern und in Eis vorkühlen. Für jeden Spender ist ein Volumen von 5 ml erforderlich.</li>
	<li>Eine 10 Wochen alte C57BL/6-Maus (23 x 2 g) durch Zervixdislokation einschläfern und den äußeren Teil der Maus mit 75% Ethanol für einige Sekunden besprühen. In der Zwischenzeit eine 5 ml Spritze mit Kollagenaselösung füllen und die Spritzennadel mit einer biegsamen stumpfspitzen Perfusionsnadel (32 G) wechseln.</li>
	<li>Setzen Sie die Spendermaus in die Rückenlage auf einen Eisbeutel unter dem Sezieren, schneiden Sie eine Queröffnung mit geraden, gerichteten Augenscheren in die Haut des Schambereichs und schneiden Sie die Haut vollständig in Richtung des Kopfes. Dann den Bauch über einen V-Schnitt aus der Schamregion zum xiphoiden Prozess komplett öffnen.</li>
	<li>Setzen Sie die Gallenblase und die gesamte Länge des gemeinsamen Gallengangs durch Neupositionierung der Leber aus. Dann die Zwölffingerdarmöffnung des gemeinsamen Gallengangs mit einer Gefäßklemme einklemmen und eine kleine Öffnung in der Gallenblase schneiden. HINWEIS: Optimale Nadelplatzierung ist wichtig, um Rückfluss in die Leber und Gallenblase zu verhindern.</li>
	<li>Den gemeinsamen Gallengang aus der Gallenblasenöffnung mit der Perfusionsnadel in Schritt 1.2 zu keimen, dann 2 ml Kollagenaselösung in die Bauchspeicheldrüse injizieren. Danach trennen Sie die durchnässte Bauchspeicheldrüse mit zwei Paaren nichtinvasiver Mikropinezer von Darm, Magen und Milz und legen Sie sie in eine 50 ml kegelförmige Röhre auf Eis. HINWEIS: Wiederholen Sie den Vorgang für alle Spendermäuse. Drei aufeinander folgende durchlässige Bauchspeicheldrüsen (nicht mehr als 40 min voneinander entfernt) können zu einem 50 ml konischen Rohr kombiniert werden, das mit 3 ml Kollagennaselösung für jede Bauchspeicheldrüse vorgefüllt wird.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l DNase I (10 mg/ml) pro Bauchspeicheldrüse in die 50 ml konischen Röhren und verdauen Sie die Bauchspeicheldrüse in einem Wasserbad bei 37 °C, indem Sie die konischen Röhren 3–5 min schütteln. HINWEIS: Schütteln Sie die Schläuche in 10 s Intervallen kräftig 40x, um das Gewebe vor der Verdauung im Wasserbad zu trennen, und schütteln Sie die Schläuche dann während der Verdauung mäßig.</li>
	<li>Stop-Lösung (2,5 mg/ml BSA-HBSS-Lösung) bis zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen, um die Verdauung zu blockieren, und Pulszentrifugieren Sie die Rohre auf eine Geschwindigkeit von 750 x g bei 4 °C und stoppen Sie schnell.</li>
	<li>Den Überstand abgießen und die Pellets 2x waschen, indem man in 15–25 ml BSA-HBSS sanft wieder aufhält. Pulszentrifugieren Sie das Rohr mit den gleichen Geschwindigkeitsbedingungen wie in Schritt 1.7 für 1 min beschrieben.</li>
	<li>Gießen Sie den Überstand ab und bündeln Sie die Pellets der drei konischen Rohre in ein 50 ml konisches Rohr. Setzen Sie die Pellets in einem Gesamtvolumen von 10 ml Histopaque-1119 wieder aus. Homogen mischen und sequenziell 5 ml Histopaque-1077 und 5 ml HBSS durch langsames Pipetieren entlang der Seite des Rohres hinzufügen.</li>
	<li>Drehen Sie die Proben in der Zentrifuge bei 750 x g bei 4 °C 10 min ohne Bremsen.</li>
	<li>Die Inselchen von der HBSS/histopaque-1077-Schnittstelle in ein 50 ml konisches Rohr mit einer Einweg-5-ml-Pasteur-Pipette aspirieren, BSA-HBSS zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen und Pulszentrifuge bei 750 x g bei 4 °C.</li>
	<li>Den Überstand abgießen und die Inselchen mit 30 ml BSA-HBSS waschen. Zentrifuge für 1 min bei 750 x g bei 4 °C.</li>
	<li>Die Inselchen mit 30 ml Kulturmedium (10% FBS-1%P/S-CMRL-1066) pro Rohr aussetzen und in eine lichtdichte Kulturschale mit 10 cm Durchmesser gießen. Unter einem Stereomikroskop, mit 200 L Gel-Laden Pipetspitzen, handpicken Sie die Inselchen aus der Lösung auf der Grundlage ihrer Morphologie (d. h. sphäroidal, weiß). In ein unbehandeltes Zellkulturgericht mit 10 ml Kulturmedium. HINWEIS: Eine Sekundenhandpicking kann durchgeführt werden, wenn die Reinheit der erstgereinigten Inselchen nach der ersten Kommissionierung nicht optimal ist.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Reinheit der handverlesenen Inseln durch Dithionfärbung unter einem Lichtmikroskop und erkennen Sie die Lebensfähigkeit von Inseln durch Fluorescein-Diacetat (FDA)-Propidiumiodid (PI) Färbung unter einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Kultur die isolierten Inselchen im Kulturmedium (wie in Schritt 1.13) in einem Inkubator bei 37 °C, 95% Luft-5%CO2 vor der Transplantation.</li>
</ol>2. ISWAT-Islet-Transplantation
<ol><li>Induzieren Sie Diabetes bei den 8 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen (22 x 2 g) durch eine einmalige Injektion von Streptozotocin (STZ). Am Tag -4 die Mäuse für 4–6 h schnell und bereiten Sie dann eine 2% STZ-Lösung mit 0,1 M Citratpuffer (pH 4,4) vor. Wiegen, im Puffer wieder aussetzen und die Mäuse intraperitoneal in einer Dosis von 180 mg/kg injizieren. HINWEIS: Die STZ-Lösung muss vor dem Gebrauch frisch zubereitet und aufgrund ihrer Lichtempfindlichkeit mit Aluminiumfolie überzogen werden. Es sollte sofort verwendet werden, da es aktivität innerhalb von 15-20 min verliert.</li>
	<li>Punktieren Sie die kaudalen Venen der STZ-injizierten Mäuse, um etwas Blut um etwa 10 Uhr tag-1 und Tag 0 zu sammeln und den nicht fastenden Blutzuckerspiegel mit einem Teststreifen und einem grundlegenden Blutzuckermessgerät zu messen. Die Mäuse werden als Empfänger der Letzentransplantation verwendet, wenn der Blutzuckerspiegel der beiden aufeinanderfolgenden Testtage beides mindestens 20 mmol/L beträgt.</li>
	<li>Wiegen und markieren Sie am 0. Tag alle Empfängermäuse. Anästhetisieren Sie jeden Empfänger durch Injektion von 60 mg/kg Pentobarbital-Natrium intraperitoneal. HINWEIS: Verabreichen Sie eine Zehenprise, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen. Wenn die Empfängermaus keinen Entzugsreflex hat, reicht das Niveau der Anästhesie für eine Operation aus. Ist dies nicht der Fall, verabreichen Sie zusätzlich 10 mg/kg Pentobarbital-Natrium. Das verwendete Pentobarbital-Natrium wurde in steriler physiologischer Saline in der Konzentration von 2% (m/v) verdünnt.</li>
	<li>Nehmen Sie das Hydrogel aus einem -20 °C Gefrierschrank und halten Sie es auf Eis, um das Auftauen zu ermöglichen. Das Hydrogel ist bei 4–10 °C flüssig und erstarrt bei einer höheren Temperatur.</li>
	<li>Wählen Sie für jeden Empfänger 450–500 Islet-Äquivalente (IEQ) in ein steriles 1,5 ml Zentrifugenrohr unter dem Stereomikroskop (wie in Schritt 1.13) mit 200 L Kulturmedium und halten Sie auf Eis, bis es für die Transplantation bereit ist.</li>
	<li>Wischen Sie den linken Leistenbereich des Empfängers mit 75% Ethanol ab. Legen Sie es in die Supine-Position und fixieren Sie die vier Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband. Rasieren Sie die Haare um die chirurgische Stelle mit elektrischen Clippern ab und wischen Sie den Bereich mit Iodophor ab.</li>
	<li>Machen Sie einen vertikalen Hautschnitt in diesem Bereich mit der Ophthalmschere und nichtinvasiven Mikropinezer, identifizieren Sie die minderwertige epigastrische Arterie und Vene im ISWAT und erstellen Sie eine kleine Tasche über den Gefäßen.</li>
	<li>Drehen Sie das Inselrohr für 30 s bei 200 x g und entfernen Sie den Überstand so weit wie möglich. 20 L vollständig aufgetautes Hydrogel ansaugen und mit den Inselchen in das Rohr laden. Setzen Sie die Inselchen vorsichtig aus, um Blasen zu vermeiden.</li>
	<li>Liefern Sie das gesamte Islet-Hydrogel-Gemisch im Rohr mit einer 200-L-Pipettenspitze in die Tasche (Schritt 2.7) des Empfängers. HINWEIS: Bei diesem Prozess sind zwei Techniker erforderlich, einer zum Aufheben der Ränder der Tasche mit nichtinvasiven Mikrowirbelzern und der andere für die Lieferung der Isletmischung in die Tasche.</li>
	<li>Fügen Sie 20 l Cephalosporin (ca. 5–10 mg) in die Transplantationsstelle ein, nachdem das Insel-Hydrogel-Gemisch vollständig erstarrt ist, und verwenden Sie dann eine 5-0 chirurgische Naht, um den Muskel und die Haut mit der kontinuierlichen Nahtmethode zu schließen. HINWEIS: Das Hydrogel benötigt ca. 3 min, um sich aufgrund der Körpertemperatur zu erstarren.</li>
	<li>Legen Sie den Empfänger in einen sauberen Käfig und halten Sie sich mit einem Thermopad warm. Halten Sie die Überwachung aufrecht, bis sich der Empfänger vollständig erholt und beginnt, sich autonom zu bewegen. Dann verabreichen 0,03 mg/ml Buprenorphin mit steriler physiologischer Salzmittel intraperitoneal, nach 0,1 mg/kg Dosis.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3–2.11 für jede Empfängermaus.</li>
	<li>Messen Sie den nicht fastenden Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse (wie in Schritt 2.2) 3–4x pro Woche für den ersten Monat und 1x pro Woche danach.</li>
	<li>Am Ende der Nachbeobachtung (100 Tage nach der Transplantation) wird unter Anästhesie (durchgeführt wie in Schritt 2.3) die ISWAT, die das Transplantat von den Empfängern trägt, nach den in Schritt 2.6 beschriebenen sterilen Schritten verbrauchen. Fixieren Sie das Gewebe in Formalin und Paraformaldehyd gemäß den histologischen Protokollen für Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbung und Immunfluoreszenz von Insulin und Glucagon.</li>
	<li>Cephalosporin hinzufügen und den Schnitt der Empfänger wie in Schritt 2.10 schließen, dann wie in Schritt 2.11 auf die Genesung vorbereiten.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine vielversprechende Therapie zur Behandlung von T1DM. Die Wirkung dieser Therapie wird von vielen Faktoren beeinflusst und die Wahl eines optimalen Ortes für die Implantation von Isleten ist äußerst wichtig. Die ideale anatomische Stelle für die Letentransplantation sollte folgende Merkmale aufweisen: Zugänglichkeit für einfache Transplantationen, Biopsie n- und Transplantatentnahmeverfahren; reduzierte Komplikationen; hohe Erfolgsrate der Blutzuckerkontrolle; und langfristiges Ü...

Die weltweite Inzidenz und Prävalenz von Typ-1-Diabetes mellitus (T1DM) steigt laut den statistischen Daten der International Diabetes Federation (IDF)1schnell an. Die Islet-Transplantation ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung von T1DM4. Seit der große Durchbruch in der klinischen Islet-Transplantation mit dem Edmonton-Protokoll2 berichtet wurde, erreicht das funktionierende Islet-Transplantat-Überleben bei T1DM-Empfängern nach 5 Jahren nun etwa 50%3.
In der Vergangenheit wurden mehrere Transplantationsstellen, wie Leber, Nierenkapsel, Milz, intramuskuläre Region, subkutaner Raum, Knochenmark und Omentalbeutel für experimentelle IsletTransplantation5,6,7untersucht. Einige der oben genannten Seiten wurden in klinischen Einstellungen getestet8. Obwohl die Letentransplantation in die Leber die am weitesten verbreitete Methode in der klinischen Anwendung derzeit9bleibt, gibt es mehrere wichtige Probleme bei der Verwendung dieser Website zu beheben. Zum Beispiel, wie man den frühen Verlust der transplantierten Inselchen durch die sofortige blutvermittelte Entzündungsreaktion (IBMIR) und schlechte Sauerstoffversorgung10,11 und wie man die Insel transplantiert, wenn nötig, zu reduzieren, weil sie diffus in der Leber lokalisieren. Die Nierenkapsel kann ein idealer Ort für Nagetier-Empfänger sein. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender allogener Inselchen beim Menschen, obwohl sie aufgrund der hochgereinigten Poreninselpräparate, die klinisch verwendet werden, besser für die Inselxenotransplantation geeignet seinkann. Daher ist die Suche nach einem geeigneteren Standort für die Letentransplantation im Gange.
Der subkutane Raum kann aufgrund seiner Zugänglichkeit als klinisch anwendbarer Standort für die Letentransplantation genutzt werden. Allerdings ist die Effizienz der Inseltransplantation in den subkutanen Raum extrem gering, so dass eine relativ große Anzahl von Inselchen erforderlich ist, um Hyperglykämie umzukehren13. Kürzlich fand ein japanisches Forscherteam die ISWAT, eine neuartige subkutane Stelle, die für die Letentransplantation in einem murinen Modell im Vergleich zur Leber14überlegen ist. Die ISWAT enthält die epigastrische Arterie und Vene, so dass die reiche Blutversorgung kann Islet Transplantat Revaskularisation gewährleisten. In diesem Manuskript schlagen wir eine einfache Implantationsmethode mit einem Kellermembran-Matrix-Hydrogel vor, um syngene murinische Inselchen im ISWAT zu fixieren. Dieses Protokoll erweist sich als wirksam für die Letentransplantation.

<table><tbody><tr><td>0,22 μm m spritzenbetriebene Filtereinheit</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pasteur-Pipette</td><td>JingAn Biological, China</td><td>J00085</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Spritze</td><td>Szboon, China</td><td>20170829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>5-0 chirurgisches Nahtmaterial</td><td>sh-Jinhuan, China</td><td>CR537</td><td></td></tr><tr><td>60 mL Spritze</td><td>Szboon, China</td><td>20170623</td><td></td></tr><tr><td>75% Ethanol</td><td>LIRCON, China</td><td>9180527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgG(H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Verdünnung (1:200)</td></tr><tr><td>Anti-Maus Glucagon Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>Verdünnung (1:100)</td></tr><tr><td>Anti-Maus Insulin Antikörper</td><td>Zelle Signaling Technology</td><td>3014s</td><td>Verdünnung (1:100)</td></tr><tr><td>stumpf-spitze Perfusionsnadel</td><td>Oloey, China</td><td>005</td><td>32G, gelb</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Meilune, China</td><td>MB4219</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6 Mäuse</td><td>Medical Animal Center der Provinz</td><td></td> Guangdong <td>8 ~ 10 Wochen</td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>BIOFIL, China</td><td>TCD000100</td><td>Allgemein, unbehandelt, 87,8 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Cephalosporin</td><td>Lukang medical, China</td><td>150303</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0422</td><td></td></tr><tr><td>Codos Pet Clipper</td><td>Szcodos, China</td><td>CP-8000</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ V</td><td>Sigma</td><td>C9262</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-hank's Puffer</td><td>Coolaber, China</td><td>PM5140-10</td><td></td></tr><tr><td>Dithizon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Färbemedium</td><td>Beyotime Biotech, China</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30084</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceindiacetat (FDA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen zum Gelladen</td><td>Corning</td><td>CLS4884</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Coolaber, China</td><td>PM5150-10</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Färbemedien</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>14166S</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RNBG0522</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1119</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RNBG0536</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Basalmembran-Matrix</td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>LIRCON, China</td><td>5190313</td><td></td></tr><tr><td>lichtdichte Kulturschale</td><td>DVS, China</td><td>AN-5058548</td><td>selbstgebaut, Glasschale mit schwarzer Farbe besprüht</td></tr><tr><td>Medizinisches Klebeband</td><td>Cofoe, China</td><td>K12001</td><td></td></tr><tr><td>nicht-invasive Mikropinzette</td><td>RWD Life Science</td><td>F11033-11 und F12016-15</td><td></td></tr><tr><td>One Touch ultraeasy Basic Blutzuckermesssystem</td><td>Johnson & Ltd. Johnson</td><td>33391713</td><td></td></tr><tr><td>Augenschere</td><td>RWD Life Science</td><td>S12012-12 und S11001-08</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicillin / Streptomycin)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital-Natrium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>STZ (Streptozotocin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Teststreifen</td><td>GenUltimate</td><td>100-50</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-konjugierte Ziege Anti-Kaninchen IgG(H+L)</td><td>proteintech</td><td>SA00007-2</td><td>Verdünnung (1:200)</td></tr><tr><td>Gefäßklemme</td><td>RWD Life Science</td><td>R31006-04</td><td></td></tr></tbody></table>

leisten-subkutanes weißes adiposeengewebe (iswat) transplantationsmodell von murine-inseln

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine etablierte therapeutische Behandlung für Typ-1-Diabetes. Die Nierenkapsel ist die am häufigsten verwendete Stelle für die Letentransplantation in Nagetiermodellen. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender Inselchen bei großen Tieren und Menschen. Das inguinale subkutane weiße Fettgewebe (ISWAT), ein neuer subkutaner Raum, wurde als potenziell wertvoller Ort für die Zelltransplantation gefunden. Diese Seite hat eine bessere Blutversorgung als andere subkutane Räume. Darüber hinaus beherbergt die ISWAT eine größere Isletmasse als die Nierenkapsel, und die Transplantation in sie ist einfach. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Isolierung und Transplantation von Mausinselaufderungen in der ISWAT-Site von syngenen diabetischen Mausempfängern. Mit diesem Protokoll wurden murine Pankreasinseln durch Standard-Kollagennase-Verdauung isoliert und ein Kellermembran-Matrix-Hydrogel wurde zur Befestigung der gereinigten Inselchen am ISWAT-Standort verwendet. Der Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse wurde mehr als 100 Tage lang überwacht. Islet-Transplantate wurden am Tag 100 nach der Transplantation zur histologischen Analyse geborgen. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll für die Letentransplantation an der ISWAT-Site ist einfach und effektiv.

In diesem Protokoll werden zwei Verfahren eingeführt: die Präparation von murinen Inselen und die Inseltransplantation in den ISWAT-Standort. Im ersten Verfahren, nach durchdringenden und verdauenmit Mit Typ V Kollagenase-Lösung, Reinigung mit Histopaque-1119 und Histopaque-1077 und einem zusätzlichen Hand-Picking-Schritt, werden die isolierten murinen Inseln ausreichend rein für die Transplantation sein (wie in Abbildung 1gezeigt ) und die isolierten Inselchen, die eine hohe Lebensfähigkeit...

In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.

Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Die Islet-Transplantation ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung von Typ-I-Diabetes mellitus. Und die Suche nach einem geeigneten Standort für die Letentransplantation läuft. Die Islet-Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe ist eine einfache, aber wirksame Methode, die klinische Implikationen haben kann.Die Extrapolation dieses Verfahrens auf die Klinik kann zur Entwicklung einer Heilung für Typ-I-Diabetiker führen. Diese Methode könnte Einblicke in die klinische Islettransplantation geben, da die Lingual als kein idealer Ort für die Transplantation von Isleten bestimmt wurde. Es ist wichtig, sorgfältig jeden Schritt des Verfahrens zu folgen, insbesondere wichtige Schritte, wie die Pankreasverdauung.Visuelle Demonstration wird Forschern helfen, die mit der Technik neu zu finden sind, um besser zu bestimmen, wie die Isolierung der Kleinen und die Transmutation durchgeführt werden. Für die Inselernte zuerst das Fell einer 10 Wochen alten C57 black six mouse mit 75% Ethanol besprühen und eine Fünf-Milliliter-Spritze mit frisch zubereiteter Kollagennaselösung füllen. Rüsten Sie die Spritze mit einer 32-Spur-Biegestumpf-Spitzen-Perfusionsnadel aus, und legen Sie die Maus in die Supine-Position auf einem Eisbeutel.Verwenden Sie gerade spitze Augenscheren, um eine Queröffnung in der Haut des Schambereichs zu machen, und erweitern Sie den Schnitt in Richtung des Kopfes des Tieres. Öffnen Sie den Bauch vollständig über einen V-Inzis aus der Schamregion zum xiphoiden Prozess, und bewegen Sie die Leber, um die Gallenblase und die gesamte Länge des gemeinsamen Gallengangs freizulegen. Dann verwenden Sie eine Gefäßklemme, um die Zwölffingerdarmöffnung des gemeinsamen Gallengangs zu schließen und eine kleine Öffnung in der Gallenblase zu schneiden.Den gemeinsamen Gallengang durch die Öffnung mit der zuvor vorbereiteten Perfusionsnadel zu nulaten und etwa zwei Milliliter Kollagenaselösung in die Bauchspeicheldrüse zu injizieren. Wenn die gesamte Kollagenase geliefert wurde, verwenden Sie zwei Paare von nichtinvasiven Mikro-Pinzetten, um die durchgeflossene Bauchspeicheldrüse von Darm, Magen und Milz zu trennen und die Bauchspeicheldrüse in eine 50 Milliliter konische Röhre auf Eis zu legen. Wenn alle Proben gesammelt wurden, fügen Sie 100 Mikroliter Dnase I pro Bauchspeicheldrüse zu den 50 Milliliter-Röhren hinzu und schütteln Sie jede Röhre etwa 40 Mal über einen Zeitraum von 10 Sekunden kräftig, bevor Sie das Gewebe drei bis fünf Minuten lang in ein 37 Grad Celsius Wasserbad mit moderatem Schütteln legen.Am Ende der Inkubation, addieren Sie sich zu einem endgültigen Volumen von 50 Milliliter Stop Solution, um die Verdauung zu stoppen. Und Pulszentrifugieren Sie die Rohre auf eine Geschwindigkeit von 750 mal G bei vier Grad Celsius, bevor sie die Zentrifuge schnell stoppen. Nach dem Wegwerfen der Überstände die Pellets zweimal in 15 bis 25 Milliliter Stop Solution pro Wäsche unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen waschen, wie soeben gezeigt.Nach der zweiten Wäsche drei Pellets pro Rohr in neue 50 Milliliter konische Röhren bündeln. Und setzen Sie die Bauchspeicheldrüsenzellen in einem Gesamtvolumen von zehn Millilitern Histopaque 1119 wieder aus. Als nächstes vorsichtig fünf Milliliter Histopaque 1077 an der Seite jeder Röhre hinzufügen, gefolgt von fünf Milliliter HBSS.Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pasteur-Pipette, um die Inselchen von der HBSS Histopaque 1077 Schnittstelle zu sammeln. Die Inselchen in einem neuen 50-Milliliter-Konusrohr in einem Endvolumen von 50 Millilitern Stop Solution für die Pulszentrifugation bündeln und den Überstand entsorgen. Das Pellet in 30 Milliliterfrischer Stop-Lösung für eine einminütige Zentrifugation wieder aufhängen und die Inselchen in 30 MilliliterKulturmedium wieder aufhängen.Dekantisieren Sie die Inselchen in eine 10 Zentimeter lichtdichte Kulturschale pro Röhre. Und legen Sie die Schale unter das Stereomikroskop. Mit 200 Mikroliter-Gel-Ladepipettenspitzen, von Hand wählen Sie die weißen sphäroidalen Inselchen aus der Lösung.Legen Sie die Inselchen in eine unbehandelte Zellkulturschale mit 10 Milliliter Kulturmedium, wie sie geerntet werden. Überprüfen Sie die Reinheit der handgepflückten Inseln durch Dithionfärbung unter einem Lichtmikroskop. Und die Lebensfähigkeit der Inseln durch Fluorescein-Diacetat propidium iodid färbung unter einem Floreszenzmikroskop erkennen.Dann kulturieren Die isolierten Inselchen in frischem Kulturmedium bei 37 Grad Celsius in 95% Luft und 5% Kohlendioxid bis zur Transplantation. Beginnend an den Tagen drei und vier nach der Diabetes-Induktion, punktieren Sie die kaudale Vene jedes Streptozotocin-injizierten acht Wochen alten männlichen C57 schwarz sechs Maus um 10:00 a.m. um eine Blutprobe von jedem EmpfängerTier zu sammeln.Verwenden Sie ein grundlegendes Blutzuckermessgerät, um den nicht fastenden Blutzuckerspiegel jeder Maus zu bestimmen und fügen Sie das Blut dann auf einzelne Teststreifen. Wenn ein Tier zwei Tage hintereinander einen Blutzuckerspiegel von mindestens 20 Millimole pro Liter nachgewiesen hat, wiegen und markieren Sie die Empfängermaus und bestätigen Sie eine mangelnde Reaktion auf Pedalreflexe bei den anästhesierten Tieren. Legen Sie ein Aliquot von Hydrogel von minus 20 Grad Celsius Lagerung auf Eis zum Auftauen.Und übertragen Sie 450 bis 500 Islet-Äquivalente pro Empfänger in ein steriles 1,5 Milliliter-Zenififugenrohr mit 200 Mikrolitern Medium pro Tube auf Eis. Den linken Leistenbereich des Empfängers mit 75% Ethanol abwischen und die Maus in die Supine-Position stellen. Fixieren Sie die Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband, und verwenden Sie Clipper, um das Haar um die chirurgische Stelle zu entfernen.Den Operationsbereich mit Iodophor abwischen und einen vertikalen Schnitt in der desinfizierten Haut machen. Identifizieren Sie die minderwertige epigastrische Arterie und Vene innerhalb des ISWAT und erstellen Sie eine kleine Tasche über den Gefäßen. Sedimentieren Sie die Inseln durch Zentrifugation und entfernen Sie so viel Überstand wie möglich.Fügen Sie 20 Mikroliter aufgetautes Hydrogel in jedes Rohr, und halten Sie die Inselchen vorsichtig wieder auf, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden. Wenn eine homogene Suspension erhalten wurde, verwenden Sie eine 200 Mikroliter Pipettenspitze, um die gesamte Islet Hydrogelmischung vorsichtig aus einem Rohr in die Tasche zu liefern. Wenn das Hydrogel vollständig verfestigt ist, fügen Sie 20 Mikroliter Cephalosporin an die Transplantationsstelle und schließen Sie den Muskel und die Haut mit einer kontinuierlichen chirurgischen Naht von 5-0.Legen Sie den Empfänger dann in einen sauberen Käfig auf einem Thermopad mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. Nach der murinen Inselverarbeitung, wie gezeigt, sind die isolierten murinen Inseln ausreichend rein für die Transplantation. Für die Transplantation sollten nur isolierte Inselchen mit hoher Lebensfähigkeit verwendet werden.Nach gründlichem Mischen der Islettransplantate mit Hydrogel kann das Transplantat in die ISWAT-Stelle implantiert werden. Nach etwa einem Monat Transplantation in die ISWAT kehren die Islettransplantate die Hyperglykämie um, während das Körpergewicht der Empfängermäuse allmählich zunimmt. Nach 100 Tagen nach der Transplantation führt die Entfernung der Transplantate zu einer sofortigen Erhöhung der 10:00 a.m.nicht fastenden Blutzuckerspiegel. Histologische Analysen zu diesem Zeitpunkt zeigen, dass die Islettransplantate intakt geblieben sind. Und Insulin und Glucagon immunfluoreszierende Färbung zeigen, dass die transplantierten Inseln auch an 100 Tagen nach der Transplantation funktionsfähig sind.Achten Sie darauf, die profused Bauchspeicheldrüsenzellen nicht zu robust zu schütteln, sonst wird die Fähigkeit der erhaltenen Inseln beeinträchtigt. Isolierte Inselchen können unter der Nierenkapsel als Kontrolle transplantiert werden, um die Auswirkungen der isolierten Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe an der Stelle zu vergleichen. Das Verfahren wird die Einleitung klinischer Studien zur Letztransplantation an anderen Stellen außer der Leber hinzufügen.

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Medicine

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Die Transplantation von isolierten Inseln wurde vorgeschlagen, eine potenzielle Behandlungsoption für Typ-1-Diabetes sein. Hier beschreiben wir eine Methode, um kleine Inseln aus Maus Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und verpflanzen sie in die subkapsulären Raum der Niere.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Weißen Fettgewebe (WAT) hat kritische Mängel in seiner aktuellen Primärkultur Modelle, pharmakologischen Entwicklung und metabolische Studien zu behindern. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine adipöse Microphysiological System durch sandwichartig WAT zwischen den Blättern der Stromazellen Zellen zu produzieren. Diese Konstruktion bietet eine stabile und flexible Plattform für WAT Primärkultur.

Eine Microphysiologic Plattform für menschliches Fett: weißen Fettgewebe eingeklemmt

Dieser Artikel beschreibt eine Transplantationsmethode, um Spenderratten-Epithelzellen in das interskapulierliche weiße Fettpolster von Empfängertieren zu transplantieren. Diese Methode kann verwendet werden, um wirtliche und/oder Spendereffekte auf die Entwicklung von Brustepithel zu untersuchen und eliminiert die Notwendigkeit einer Vorabklärung, wodurch die Nützlichkeit dieser Technik erweitert wird.

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Funktionelle Bildgebung und Quantifizierung von thermogenen Fettdepots in Mäusen mit einem mikro-PET/MR-bildgebenden Ansatz.

Visualisierung und Quantifizierung von braunem und beigem Fettgewebe in Mäusen mittels [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

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Untersuchung der Biologie und des Stoffwechsels von beigefarbenem Fett mit dem CRISPR SunTag-p65-HSF1 Aktivierungssystem

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Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

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Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln

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