Name: Quantifizierung der Zytotoxizität von Staphyloccus aureus gegen humane polymorphonukleare Leukozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung polymorphkerniger Leukozyten aus menschlichem Blut und zwei Assays zur Quantifizierung der Zytotoxizität von Staphylococcus aureus. Diese Methoden ermöglichen Untersuchungen zur Wirt-Pathogen-Interaktion.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von den U.S. National Institutes of Health Grants NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 sowie Mitteln der Montana State University Agriculture Experiment Station und einem Ausrüstungsstipendium des Murdock Charitable Trust unterstützt. .

Heparinisiertes venöses Blut von gesunden Spendern wurde gemäß dem vom Institutional Review Board for Human Subjects an der Montana State University genehmigten Protokoll gesammelt. Alle Spender gaben ihre schriftliche Zustimmung zur Teilnahme an dieser Studie ab.
1. Reinigung von humanen polymorphonuklearen Leukozyten und Isolierung des menschlichen Serums
HINWEIS: Alle Reagenzien sollten routinemäßig auf das Vorhandensein von Endotoxin mit einem handelsüblichen Endotoxin-Detektionskit überprüft werden und <25.0 pg/mL-Endotoxin enthalten, um unerwünschtes Priming von PMNs zu verhindern.
<ol><li>Bringen Sie 50 ml von 3% dextran-0,9% NaCl (w/v), 35 ml von 0,9% NaCl (w/v), 20 ml von 1,8% NaCl (w/v), 12 ml mit 1,077 g/ml Dichtegradientenlösung und 20 ml Injektions- oder Bewässerungswasser auf Raumtemperatur.</li>
	<li>Um menschliches Serum zu isolieren, inkubieren Sie 4 ml frisch entnommenes menschliches Blut ohne Antikoagulans bei 37 °C in einem 15 ml Glasrohr für 30 min. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur 10 min bei 2.000–3.000 g. Die obere Serumschicht in ein frisches 15 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr geben und auf Eis legen.</li>
	<li>Kombinieren Sie 25 ml frisch gezogenes heparinisiertes (1000 Einheiten/ml) Vollmenschliches Blut mit 25 ml Raumtemperatur 3% dextran-0,9% NaCl (1:1 Verhältnis) in zwei replizieren 50 ml konische Zentrifugenrohre (50 ml Gesamtvolumen pro Tube). Mischen Sie durch sanftes Schaukeln jedes 50 ml konische Rohr und dann bei Raumtemperatur für 30 min stehen lassen.</li>
	<li>Nach der Inkubation bei Raumtemperatur werden zwei separate Schichten angezeigt. Übertragen Sie die deckgeschichtliche Schicht jedes Dextran-Blut-Gemischs in neue 50 ml konische Schläuche und Zentrifuge bei 450 x g für 10 min bei Raumtemperatur mit niedrigen oder keinen Bremsen.</li>
	<li>Sorgsam beide Überstande ansaugen und entsorgen, ohne die Zellpellets zu stören. Jedes Zellpellet vorsichtig in 2 ml Raumtemperatur 0,9% NaCl wieder aufhängen, die resuspendierten Pellets in einem einzigen 50 ml konischen Rohr kombinieren und dann die restlichen 0,9% NaCl (Endvolumen von 35 ml) hinzufügen.</li>
	<li>Unterlegen Sie mit einer Handpipette 10 ml Raumtemperatur von 1.077 g/ml Dichtegradientenlösung unter der Zellsuspension. Drehen Sie bei 450 x g für 30 min bei Raumtemperatur mit niedrigen oder keinen Bremsen. Den Überstand sanft ansaugen, ohne das Zellpellet zu stören. Supernatant wird periphere mononukleäre Blutzellen enthalten, die wie zuvor beschrieben14gesammelt werden können.</li>
	<li>Lyse die roten Blutkörperchen durch Wiederaufsetzen der Zelle Pellet in 20 ml Raumtemperatur Wasser. Mischen Sie sanft, indem Sie die Röhre für 30 s schaukeln. Die Lyse der roten Blutkörperchen wird von einer deutlichen Abnahme der Trübung begleitet werden.</li>
	<li>Sofort 20 ml 1,8% NaCl (bei Raumtemperatur [RT]) und Zentrifugenprobe bei 450 x g für 10 min bei Raumtemperatur hinzufügen. HINWEIS: Es ist wichtig, die Zeit zu minimieren, die PMNs nach der Roten Blutkörperchenlyse allein im Wasser gelassen werden, um die PMN-Ausbeute zu maximieren und PMN-Lyse und/oder Aktivierung zu verhindern.</li>
	<li>Den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Zellpellet zu stören. Das Zellpellet vorsichtig in 2 ml RT RPMI 1640 Medium wieder aufhängen und auf Eis legen.</li>
	<li>Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Gereinigte PMNs mit einer Konzentration von 1 x 107 Zellen/ml mit eiskaltem RPMI wieder aufsetzen und auf Eis halten.</li>
	<li>Kombinieren Sie 100 l gereinigte PMNs (1 x 106 Zellen) mit 300 l eiskalten Dulbecco-Phosphat-gepufferten Saline (DPBS), die 1 L Propidiumjodidfleck in zwei replizierenden Durchflusszytometrieröhren enthalten. Für eine positive Kontrolle von Plasmamembranschäden fügen Sie 40 L 0,5% Triton X-100 Lösung in eine der Durchflusszytometrieröhren und mischen gründlich.</li>
	<li>Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung und Propidiumjodidfärbung (Erregungs-/Emissionsmaxima bei 535/617 nm) gereinigter Zellen zu messen (Abbildung 1). HINWEIS: Die Vorwärts- und Seitenstreuungsanalyse identifiziert unerwünschte Populationen von Lymphozyten und Monozyten. Propidiumiodid wird nur Zellen mit einer kompromittierten Plasmamembran färben und gereinigte PMNs, die ausgeprägte Populationen von Propidiumjodid-positiven Zellen haben, sollten nicht verwendet werden. Für diese Studien wurden gereinigte PMNs nur verwendet, wenn sie >98% der gereinigten Zellen und <5% positiv für Propidiumjodid enthielten.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 96-Well-Platte für PMN-Zytotoxizitätstests vor, indem Sie einzelne Brunnen, die in diesem Test verwendet werden, mit 100 l isoliertem humanem Serum, das mit DPBS verdünnt wurde, beschichten. HINWEIS: Das Plattieren von PMNs direkt auf Kunststoff oder Glas führt zur Aktivierung der Zellen. Achten Sie darauf, mindestens eine negative Kontrollgut, die nur Medien und mindestens eine positive Kontrolle gut, die 0,05% Triton X-100 erhalten erhalten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 30 min. Waschen Sie die beschichteten Brunnen nach der Inkubation zweimal mit eiskaltem DPBS, um überschüssiges Serum zu entfernen. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte auf den Kopf, um eventuelle Rest-DPBS zu entfernen und auf Eis zu legen.</li>
	<li>Fügen Sie vorsichtig 100 l gereinigte menschliche PMNs bei 1 x 107 Zellen/ml zu jedem beschichteten Brunnen (1 x 106 PMNs/Well) hinzu. Lassen Sie PMNs in Brunnen absetzen, indem Sie die Platte mindestens 5 min auf Eis brüten. Halten Sie den Plattenstand, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in jedem Brunnen zu ermöglichen, und lassen Sie sie auf Eis, um eine unerwünschte Aktivierung von PMNs zu vermeiden.</li>
</ol>2. Zytotoxizitätstest von S. aureus extrazellulären Proteinen gegen humane polymorphonukleare Leukozyten
<ol><li>Culture S. aureus über Nacht in tryptischer Sojabrühe (TSB) mit einem Schüttelinkubator bei 37 °C. Für diese Studien wurden 20 ml TSB in separaten 150 ml Erlenmeyerkolben mit gefrorenen Kulturen der S. aureus-Stämme USA300 oder USA300saeR/S geimpft und für ca. 14 h mit Schütteln bei 250 U/min angebaut.</li>
	<li>Subkultur S. aureus durch eine 1:100 Verdünnung der über Nacht bakteriellekultur mit frischen Medien. Bei 37 °C mit Schütteln bebrüten, bis die Bakterien eine frühe stationäre Wachstumsphase erreichen. HINWEIS: Für diese Experimente wurden 20 ml tryptische Sojabrühe in 150 ml Erlenmeyerkolben mit 200 L der über Nacht kultivierten USA300 oder USA300saeR/S geimpft und bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min für 5 h inkubiert.</li>
	<li>Wenn Bakterien eine frühe stationäre Wachstumsphase erreicht haben, übertragen Sie 1 ml subkulturierten S. aureus in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und zentrifugieren bei 5.000 g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation überlagern Sie den Überstand in eine 3 ml Spritze. Überstand durch einen 0,22 m Filter und in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr auf Eis passieren.</li>
	<li>Führen Sie serielle Verdünnungen von Übertreibungen mit eiskalten Medien, die verwendet werden, um S. aureuszu kultur. HINWEIS: Für die gezeigten Experimente wurden Überstandstoffe aus USA300 und USA300saeR/S vier aufeinander folgende 1/2-Log-Verdünnungen mit eiskaltem TSB unterzogen.</li>
	<li>Fügen Sie allein (für negative und positive Kontrollen) vorsichtig überwasserstehende Proben oder Medien zu einzelnen Brunnen mit PMNs auf Eis ab Schritt 1.15 hinzu. Für diese Experimente wurden jedem Brunnen 10 L USA300 oderUSA300-SaeR/S-Überstandproben zugesetzt. Sanft Gesteinsplatte, um Überstand in Brunnen zu verteilen und bei 37 °C zu brüten.</li>
	<li>Zu den gewünschten Zeiten die Platte aus dem Inkubator entfernen und auf Eis legen. Fügen Sie 40 l von 0,5% Triton X-100 zur Positivkontrolle hinzu.</li>
	<li>Pipette die Proben in jedem Brunnen sanft nach oben und unten, um alle an der Platte haftenden PMNs vollständig abzuziehen, und dann die Proben in zytometrierische Rohre auf Eis übertragen, die 300 l eiskalteDPBS mit 1 L Propidiumjodid enthalten.</li>
	<li>Messen Sie den Anteil der Propidium-iodid-positiven PMNs mit Hilfe der Durchflusszytometrie (Abbildung 2A). Wenn propidium iodid an DNA gebunden ist, hat es eine Anregung/Emission bei 535/617 nm.</li>
</ol>3. S. aureus Cytotoxizität ssay gegen humane polymorphonukleare Leukozyten nach Phagozytose
HINWEIS: Wachstumskurven, die durch die optische Dichte bei 600 nm (OD600) und die Konzentration von Bakterien definiert sind, müssen empirisch bestimmt werden, damit die S. aureus-Stämme vor Beginn dieses Tests getestet werden können. Der Erfolg dieser Experimente erfordert die konsistente Ernte gleicher Konzentrationen jedes S. aureus-Stamms, der in der mittleren exponentiellen Wachstumsphase mit dem OD600 subkultivierter Bakterien getestet wurde.
<ol><li>Beginnen Sie die Nachtkulturen von S. aureus-Stämmen und Subkulturbakterien, wie in den Schritten 2.1.1 und 2.1.2 beschrieben.</li>
	<li>Ernten Sie subkultivierte S. aureus, wenn es mittelexponentielles Wachstum erreicht hat, indem 1 ml kultivierte Bakterien auf ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen und zentrifugieren bei 5.000 g für 5 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Unter unseren Wachstumsbedingungen erreichten DIE USA300 und DIE USA300saeR/S nach ca. 135 min Inkubation6.</li>
	<li>Waschen Sie S. aureus nach der Zentrifugation, indem Sie den Überstand ansischmachen, die pelletierten Bakterien in 1 ml DPBS wieder aufhängen, die Probe für 30 s wirbeln lassen und bei 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.</li>
	<li>Opsonize S. aureus durch Wiederaussetzung des bakteriellen Pellets in 1 ml von 20% menschlichem Serum mit DPBS verdünnt und bei 37 °C mit Agitation für 15 min inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge opsonisierte Bakterien bei 5.000 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie S. aureus nach der Zentrifugation, indem Sie den Überstand ansischmachen, die pelletierten Bakterien in 1 ml DPBS wieder aufhängen und dann die Probe wirbeln, bis das bakterielle Pellet vollständig auseinander gebrochen wird, plus weitere 30 Sekunden. Zentrifugenbakterien bei 5.000 g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Resuspend opsonized S. aureus Stämme in 1 mL RPMI, Wirbel die Probe, bis bakterielle Pellet vollständig auseinander gebrochen ist, und dann für weitere 30 s. Legen Sie Bakterien auf Eis.</li>
	<li>Verdünnt opsonisierte S. aureus-Stämme mit eiskaltem RPMI auf die gewünschte Konzentration. Wirbel für 30 s und auf Eis legen.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Konzentration von opsonisiertem S. aureus, indem Sie 1:10 serielle Verdünnungen von Bakterien auf tryptischen Soja-Agar. HINWEIS: Da Unterschiede in der Konzentration der in diesem Test verwendeten Bakterien einen großen Einfluss auf die nachfolgende PMN-Plasmamembrandurchlässigkeit haben können (Abbildung 3A), ist es sehr wichtig, dass die Konzentration jedes getesteten Stammes für jedes Experiment bestimmt wird und zwischen den Stämmen gleichwertig ist.</li>
	<li>Fügen Sie ab Schritt 100 l/Well jeder S. aureus-Sorte oder RPMI (für positive und negative Kontrollen) in der 96-Well-Platte auf Eis ab Schritt 1.14 vorsichtig zu PMNs hinzu. Sanft Rockplatte, um S. aureus in Brunnen zu verteilen.</li>
	<li>Phagozytose synchronisieren, indem Sie die Platte bei 500 x g für 8 min bei 4 °C15zentrieren. Inkubationsplatte bei 37 °C unmittelbar nach zentrifugieren (T = 0).</li>
	<li>Zu den gewünschten Zeiten die Platte aus dem Inkubator entfernen und auf Eis legen. Fügen Sie 40 l von 0,5% Triton X-100 zur Positivkontrolle hinzu.</li>
	<li>Pipette die Proben in jedem Brunnen sanft nach oben und unten, um alle an der Platte haftenden PMNs vollständig abzuziehen, und dann die Proben in zytometrierische Rohre auf Eis übertragen, die 200 l eiskalteS DPBS mit 1 L Propidiumjodid enthalten.</li>
	<li>Analysieren Sie Proben für Propidiumjodidfärbung mit Durchflusszytometrie, wie in Schritt 2.9 beschrieben.</li>
</ol>

<ol><li>Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., Höök, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion%2C+invasion+and+evasion%3A+The+many+functions+of+the+surface+proteins+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2014).</li>
<li>Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+manipulation+of+host+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal manipulation of host immune responses.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).</li>
<li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus toxins.</a> Current Opinion in Microbiology. , (2014).</li>
<li>Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epic+Immune+Battles+of+History%3A+Neutrophils+vs.+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).</li>
<li>Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Management+of+Infections+in+the+Immunocompromised+Host%22%5BJournal%5D)">Phagocytes.</a> Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).</li>
<li>Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SaeR+Binds+a+Consensus+Sequence+within+Virulence+Gene+Promoters+to+Advance+USA300+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SaeR%2FS+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li>
<li>Borgogna, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Bacterial+Pneumonia+by+Staphylococcus+aureus+Following+Influenza+A+Infection+Is+SaeR%2FS+Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li>
<li>Guerra, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+SaeR%2FS-regulated+factors+reduce+human+neutrophil+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).</li>
<li>Zurek, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+innate+immunity+in+promoting+SaeR%2FS-mediated+virulence+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus.</a> J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).</li>
<li>Nygaard, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartic+Acid+Residue+51+of+SaeR+Is+Essential+for+Staphylococcus+aureus+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 9, at https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2018.03085 3085(2018).</li>
<li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocidins%3A+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li>
<li>Bøyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).</li>
<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+mechanisms+used+by+Staphylococcus+aureus+to+avoid+destruction+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils.</a> J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SaeR%2FS+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung von PMNs aus menschlichem Blut und zwei verschiedene Assays, die Propidiumjodid zur Quantifizierung der Zytotoxizität von S. aureus gegen diese wichtigen angeborenen Immunzellen verwenden. Der Erfolg dieser Verfahren hängt von der Qualität der gereinigten PMNs und der geeigneten Herstellung von S. aureus und extrazellulären Proteinen ab, die von diesem Erreger produziert werden. Für die Isolierung von PMNs ist es wichtig, die PMN-Aktivierung während und nach der Reinigung zu minimieren, indem Reagenzien frei von Endotoxinkontamination verwendet werden, Zellpräparate schonend behandelt und Zellen bei der entsprechenden Temperatur gehalten werden. Anzeichen, die auf die Aktivierung von PMNs hinweisen, sind das Verklumpen von Zellen während der Reinigung und wenn mehr als 5% der isolierten Zellen positiv für Propidiumjodid färben. Aufgrund der relativ kurzen Lebensdauer von PMNs müssen diese Zellen aus menschlichem Blut isoliert und am selben Tag getestet werden. PMNs werden beginnen, Anzeichen einer spontanen Apoptose zu zeigen, wenn sie nach der Reinigung mehr als 3 h auf Eis gelassen werden. Wie bereits erwähnt, ist es sehr wichtig, dass jedes PMN-Präparat sorgfältig mit der Durchflusszytometrieanalyse der Vorwärts- und Seitenstreuung sowie der Propidiumjodidfärbung bewertet wird, um die Reinheit und Integrität isolierter Zellen zu gewährleisten.
Die Expression von Zweikomponenten-Leukocidinen durch S. aureus ist verantwortlich für die Mehrheit der kompromittierten PMN-Plasmamembranintegrität, die mit den in diesem Protokoll beschriebenen Assays beobachtet wird. Variationen in der Expression dieser Toxine und anderer porenbildender Peptide, wie phenollösliche Module, zwischen S. aureus-Stämmen führen zu Unterschieden in der Zytotoxizität gegenüber menschlichen PMNs. Signifikante Abweichungen während des In-vitro-Wachstums zwischen S. aureus-Stämmen beeinflussen auch die Expression von porenbildenden Toxinen und die anschließende Zytotoxizität. Darüber hinaus hat das Verhältnis von S. aureus zu PMNs in phagozytose-Assays einen großen Einfluss auf die nachfolgende PMN-Plasmamembrandurchlässigkeit (Abbildung 3A), und diese Experimente erfordern die konsistente Ernte gleicher Konzentrationen jedes S. aureus-Stamms, der in der mittelexponentiellen Wachstumsphase mit den OD600 subkultivierter Bakterien getestet wurde. Angesichts dieser Überlegungen ist es sehr wichtig, Wachstumskurven für alle Stämme zu definieren, die vor Beginn der Zytotoxizitätstests untersucht werden. Wir empfehlen diese Methoden zur Analyse der S. aureus Zytotoxizität mit Stämmen, die signifikante Wachstumsunterschiede in vitro aufweisen.
USA300 ist ein virulentes MRSA-Isolat, das bekanntermaßen hochzytoxisch gegen humane PMNs15 ist, und der Verlust von SaeR/S in diesem Stamm reduziert die Transkription zahlreicher Bi-Komponenten-Leukocidine, die auf humane PMNs6,12abzielen, was diese Stämme zu idealen Modellen für den Vergleich der Zytotoxizität mit den beschriebenen Assays macht. Es gibt jedoch umfangreiche genetische Unterschiede zwischen verschiedenen S. aureus Isolaten und die in diesen Protokollen beschriebenen Parameter können bei der Prüfung anderer S. aureus-Stämme nicht zu wesentlichen Veränderungen der Zytotoxizität gegenüber menschlichen PMNführen führen. Die Anpassung der Wachstumsbedingungen, der zugesetzten Überstände oder des Verhältnisses von Bakterien zu PMNs kann für den Erfolg mit diesen Methoden mit anderen Stämmen von S. aureuserforderlich sein.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
to:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.

Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus ist ein grampositives Bakterium, das beim Menschen ein breites Spektrum an Krankheiten verursacht. Dieser prominente Erreger produziert zahlreiche Virulenzfaktoren, die zu verschiedenen Aspekten der Infektion beitragen. Dazu gehören Oberflächenmoleküle, die es S. aureus ermöglichen, an verschiedenen Arten von Wirtsgewebehaften 1, extrazelluläre Proteine, die mit der Wirtsimmunantwort stören2, und eine Reihe von abgesonderten Toxinen, die verschiedene Arten von Wirtszellen 3 . In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode, die die Zytotoxizität von extrazellulären Proteinen quantifiziert, die von S. aureus gegen menschliche polymorphonukleare Leukozyten (PMNs oder Neutrophile), primäre Effektorzellen des Angeborenen der Immunantwort des Wirts, produziert werden.
PMNs sind die häufigsten Leukozyten bei Säugetieren. Diese zirkulierenden Immunzellen werden schnell an die Stelle der Wirtsgewebe Beleidigung als Reaktion auf Gefahrensignale von ansässigen Zellen oder von Verbindungen einzigartig für eindringende Mikroben rekrutiert. Die extrazelluläre Eingabe dieser Moleküle und aus direkten Kontakten mit aktivierten ansässigen Wirtszellen während der Extravasation erhöhen den Aktivierungszustand von PMNs in einem Prozess, der als Priming4,5bekannt ist. Primed PMNs, die beunruhigtes Gewebe erreicht haben, führen dann wichtige angeborene Immunantworten aus, die die Etablierung einer Infektion verhindern sollen. Dazu gehören die Bindung und Internalisierung, oder Phagozytose, von eindringenden Mikroorganismen, die eine Kaskade von intrazellulären Ereignissen auslösen, die in der Mikrobenzerstörung durch eine Batterie von potenten antimikrobiellen Verbindungen kumulieren5.
PMNs spielen eine wesentliche Rolle zum Schutz des Menschen vor eindringenden Krankheitserregern und sind besonders wichtig, um eine S. aureus-Infektion zu verhindern4. Dieses Bakterium produziert jedoch eine breite Palette von Virulenzgenen, die verschiedene PMN-Funktionen behindern. Dazu gehören extrazelluläre Proteine, die die Erkennung von Signalmolekülen blockieren, die Haftung an Wirtsgewebe verhindern, die Produktion antimikrobieller Verbindungen hemmen und die Integrität der Plasmamembran beeinträchtigen4. S. aureus orchestriert die zeitliche Expression dieser Virulenzgene durch den kollektiven Input mehrerer zweikomponentischer sensorischer Systeme, die spezifische Umwelthinweise erkennen. Das SaeR/S Zweikomponentensystem ist ein wichtiger Aufregulator der S. aureus Virulenz-Gentranskription während der Infektion6,7,8,9,10,11. Insbesondere hat sich dieses Zweikomponentensystem als entscheidend für die Herstellung von Zweikomponenten-Leukocidinen erwiesen, die speziell auf menschliche PMNsabzielen 12.
Dieses Protokoll ist in drei verschiedene Abschnitte unterteilt. Der erste Abschnitt beschreibt die Reinigung von PMNs aus menschlichem Blut mittels Dichtegradientenzentrifugation mit einem Protokoll, das an methoden angepasst wurde, die von B'yum13 und Nauseef14festgelegt wurden. Der zweite und dritte Abschnitt beschreiben zwei verschiedene Techniken zur Untersuchung der Zytotoxizität von S. aureus; eine berauscht PMNs mit extrazellulären Proteinen, die von S. aureus produziert werden, während der andere die Fähigkeit lebender Bakterien untersucht, PMNs nach Phagozytose zu schädigen. Bei diesen Verfahren wird Propidiumjodid verwendet, um den Verlust der PMN-Plasmamembranintegrität zu messen, der durch S. aureus porebildende Toxine verursacht wird. Propidiumiodid ist ein DNA-bindendes Fluorophor, das normalerweise zellmembranen undurchlässig ist, aber Plasmamembranen kreuzen kann, die durch S. aureus Toxine gestört wurden. Die Durchflusszytometrie-Analyse ermöglicht die schnelle Quantifizierung von propidiumiodid-positiven PMNs, um die relative Zytotoxizität von S. aureus-Stämmen zu messen. Methicillin-resistenter S. aureus (MRSA), der als gepulste Gelelektrophorese typ USA300 identifiziert wurde, und ein isogenes Deletionsmutant von saeR/S in diesem Stamm (USA300'saeR/S) wurden als Modelle verwendet, um zu demonstrieren, wie diese Verfahren die Zytotoxizität von S. aureus gegenüber menschlichen PMNs quantifizieren können.

<table><tbody><tr><td>0,9 % Natriumchlorid-Injektion, USP, 500 mL VIAFLEX Kunststoffbehälter</td><td>Baxter</td><td>2B1323Q</td><td>PMN-Aufreinigung</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschlüssen</td><td>VWR</td><td>89000-044</td><td>Wird in Waschzellen verwendet</td></tr><tr><td>1,8 % Natriumchloridlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>PMN-Aufreinigung</td></tr><tr><td>12x75 mm Kulturröhrchen</td><td>VWR</td><td>60818-430</td><td>Wird als Durchflusszytometrie verwendet Röhrchen</td></tr><tr><td>20% (w/w) Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8802</td><td>PMN-Aufreinigung</td></tr><tr><td>3125 Hand-Zählzähler</td><td>rückverfolgbare Produkte</td><td>3125CC</td><td>Zum Zählen von Zellen</td></tr><tr><td>50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td>Zum Dispensieren</td></tr><tr><td>von Medien Bacto Tryptic Sojabrühe, Sojabohnen-Kasein Auftragmedium</td><td>FischerScientific</td><td>211823</td><td>Für die Züchtung von Zellkulturen</td></tr><tr><td>BD Einwegspritzen mit Luer-Lok-Spitzen, 3 mL</td><td>FischerScientific</td><td>BD 309657</td><td>Zur Filterung von Überständen</td></tr><tr><td>Bright-Line Hämozytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Zellzählgerät</td></tr><tr><td>DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) mit Calcium und Magnesium</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>Wird in Waschzellen</td></tr><tr><td>verwendet Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>PMN-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterile serologische Einwegpipetten aus Polystyrol</td><td>FischerScientific</td><td>13-678-11E</td><td>Zum Aspirieren von Flüssigkeit</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 Well-Platten</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0687</td><td>Platte zum Halten von experimentellen Proben</td></tr><tr><td>OMICRON Spritzenfilter</td><td>Omicron Scientific</td><td>SFPV13R</td><td>Zur Filtration von Überständen</td></tr><tr><td>Propidium Idid</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific P3566</td><td>Membranundurchlässiger DNA-Farbstoff</td></tr><tr><td>PYREX Marke 4980 Erlenmeyerkolben</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-34503-24</td><td>Für die Züchtung von Zellkulturen</td></tr><tr><td>RPMI 1640, 1X ohne L-Glutamin, Phenolrot</td><td>Corning</td><td>17-105-CV</td><td>Wird zur Resuspendierung von Zellen verwendet</td></tr><tr><td>Steriles Wasser für die Bewässerung, USP</td><td>Baxter</td><td>2F7113</td><td>PMN-Reinigung</td></tr><tr><td>Die Pipettenpumpe</td><td>Bel-Art Products</td><td>F37898</td><td>Zum Ansaugen von Flüssigkeit</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Membranintegrität Positivkontrolle</td></tr></tbody></table>

quantifizierung der zytotoxizität von staphyloccus aureus gegen humane polymorphonukleare leukozyten

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus ist in der Lage, eine breite Palette von Leukoziden zu seften, die auf die Membranintegrität polymorphonukleanischer Leukozyten (PMNs oder Neutrophilen) abzielen und diese stören. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die Reinigung menschlicher PMNs als auch die Quantifizierung der S. aureus-Zytotoxizität gegen PMNs in drei verschiedenen Abschnitten. Abschnitt 1 beschreibt die Isolierung von PMNs und Serum aus menschlichem Blut mittels Dichtezentrifugation. Abschnitt 2 testet die Zytotoxizität von extrazellulären Proteinen, die von S. aureus produziert werden, gegen diese gereinigten menschlichen PMNs. Abschnitt 3 misst die Zytotoxizität gegen humane PMNs nach der Phagozytose des lebenden S. aureus. Diese Verfahren messen die Störung der PMN-Plasmamembranintegrität durch S. aureus Leukocidine mithilfe der Durchflusszytometrieanalyse von PMNs, die mit Propidiumiodid behandelt werden, einem DNA-bindenden Fluorophor, das zellmembrane undurchlässig ist. Zusammengenommen haben diese Methoden den Vorteil, dass S. aureus Cytotoxizität schnell gegen primäre humane PMNs getestet wird und können leicht angepasst werden, um andere Aspekte von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zu untersuchen.

Wir haben gezeigt, wie die oben beschriebenen Verfahren verwendet werden können, um die Zytotoxizität von S. aureus gegen humane PMNs mit MRSA PFGE-Typ USA300 und einer isogenen Deletionsmutante von saeR/S in diesem Stamm (USA300saeR/S) in früheren Studien6zu quantifizieren. PMNs, die mit den in Abschnitt 1 beschriebenen Verfahren isoliert wurden, wurden mit Propidiumjodid befleckt und mit Flusszytometrie untersucht. Vorwärts- und Seitenstreuungsdiagramme wurden verwendet, um die Kontamination gereinigter PMNs durch Monozyten oder Lymphozyten zu veranschaulichen (Abbildung 1A,B) und die PMN-Integrität wurde mittels Propidiumjodidfärbung bestimmt (Abbildung 1C). Die beschriebene Methode der humanen PMN-Reinigung kann konsistent 0,5 x 107 bis 1 x 108 PMNs ergeben, die &gt;98% rein sind und &gt;95% Propidiumjodid negativ sind.
Die Zytotoxizität von extrazellulären Proteinen, die von USA300 und USA300saeR/S produziert wurden, wurde anhand der in Abschnitt 2 dieses Protokolls beschriebenen Verfahren gegen gereinigte PMNs getestet (Abbildung 2). Diese Experimente zeigen eine konzentrationsabhängige Zunahme der Propidiumjodidfärbung von gereinigten PMNs nach 30 min Intoxikation mit extrazellulären Proteinen, die von USA300 produziert wurden (Abbildung 2B). Frühere Studien haben gezeigt, dass das SaeR/S Zweikomponentensystem wichtig für die Expression zahlreicher Zweikomponenten-Leukocidine ist, die auf humane PMNs6,10,11,16abzielen. In Übereinstimmung mit diesen bisherigen Befunden wurden nur sehr wenige propidiumiodid-positive PMNs nach der Exposition gegenüber extrazellulären Proteinen nachgewiesen, die von USA300-SaeR/S produziert wurden (Abbildung 2B). Weitere Experimente zeigten einen stetigen Anstieg des Anteils der lysierten PMNs nach einer Vergiftung durch USA300 extrazelluläre Proteine, die nach etwa 30 min plateauierten(Abbildung 2C). Eine minimale Lyse menschlicher PMNs wurde zu allen Zeitpunkten nach der Exposition gegenüber extrazellulären Proteinen festgestellt, die von USA300saeR/Sproduziert wurden. Diese Ergebnisse veranschaulichen den Nutzen dieses Assays für die relative Quantifizierung der Zytotoxizität durch extrazelluläre S. aureus-Proteine gegen humane PMNs.
Wir haben USA300 und USA300saeR/S mit dem S. aureus Cytotoxizitätstest gegen humane PMNs nach Phagozytose getestet, die in Abschnitt 3 dieses Protokolls beschrieben wird (Abbildung 3). Ein konzentrationsabhängiger Anstieg des Anteils der Propidiumiodid-positiven PMNs wurde 90 min nach der Phagozytose von USA300 beobachtet (Abbildung 3A). Ein signifikanter Rückgang des Anteils der PMNs, die nach der Phagozytose von USA300-SaeR/S(Abbildung 3A) propidium iodid positiv waren, wurde beobachtet, was andere Ergebnisse stützt, die darauf hindeuten, dass das SaeR/S-Zweikomponentensystem für die Zytotoxizität von S. aureus gegenüber menschlichen PMNs wichtig ist (Abbildung 2)7,11. Wie bereits erwähnt und in Abbildung 3Anachgewiesen, haben Unterschiede in der S. aureus-Konzentration einen ausgeprägten Einfluss auf die PMN-Lyse nach Phagozytose. Die Aufzählung des in jeder dieser Experimente verwendeten Inokulums USA300 und USA300saeR/S zeigte, dass der Kontrast in der Zytotoxizität zwischen diesen Stämmen nicht auf Unterschiede in der Konzentration der verwendeten Bakterien zurückzuführen war (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse zeigen, wie der S. aureus Cytotoxizitätstest gegen humane PMNs nach Phagozytose verwendet werden kann, um die Fähigkeit verschiedener S. aureus-Stämme zu bewerten, die Integrität der menschlichen PMN-Plasmamembran zu beeinträchtigen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> Abbildung 1: Durchflusszytometrieanalyse von gereinigten PMNs. Repräsentative Durchflusszytometrie Dot Plots von (A) gereinigten menschlichen PMNs und (B) PMNs, die absichtlich mit peripheren mononukleären Blutzellen kontaminiert wurden. (C) Repräsentatives Durchflusszytometrie-Histogramm mit minimaler Propidiumjodidfärbung (&lt;1%) von gereinigten PMNs (schattiert grau) im Vergleich zu PMNs, die mit 0,05% Triton X-100 (schattiert rot) behandelt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> Abbildung 2: Durchflusszytometrie-Analyse von PMNs, die mit extrazellulären Proteinen von S. aureusberauscht sind. (A) Repräsentatives Durchflusszytometriehistogramm von PMNs, die nach 30 min Inkubation mit Mediensteuerung (blau schattiert), gefilterter USA300 Überstand in einer Endkonzentration von 1:110 (schattiert grau) oder 0,05% Triton X-100 (schattiert rot) mit Propidiumiodid befleckt sind. (B) Der Anteil der Propidiumjodid-positiven PMNs nach 30 min Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen von USA300 oder USA300-SaeR/S-Überwachungsmitteln. (C) Der Anteil der Propidiumjodid-positiven PMNs im Laufe der Zeit nach der Inkubation mit USA300 oder USA300-SaeR/S-Überstand bei einer Endkonzentration von 1:110. Die Daten werden als Mittelwert von mindestens 3 separaten Experimenten mit * p 0,05 und ** p bis 0,005 dargestellt, wie durch zweibländigen t-Test bestimmt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> Abbildung 3: Durchflusszytometrie-Analyse von PMNs nach Phagozytose von S. aureus. (A) Der Anteil der Propidiumjodid-positiven PMNs 90 min nach der Phagozytose verschiedener Konzentrationen von USA300 oder USA300saeR/S. (B) Konzentration von opsonisierten S. aureus-Stämmen, die für die in Panel A gezeigten Experimente verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Reinigung polymorphonuklearer Leukozyten aus ganzem menschlichen Blut und zwei verschiedene Assays, die die Zytotoxizität von Staphylococcus aureus gegen diese wichtigen angeborenen Immunzellen quantifizieren.

Quantifizierung der Zytotoxizität von Staphyloccus aureus gegen humane polymorphonukleare Leukozyten

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Staphylococcus aureus ist ein gram-positives Bakterium, das eine breite Palette von Virulenzfaktoren produziert, die die Pathogenese fördern. Dazu gehören Zweikomponenten-Leukotoxine, die die Membranintegrität polymorphonuklearer Leukozyten, auch PMNs oder Neutrophile genannt, stören. Dieses Video zeigt die Isolierung von PMNs aus menschlichem Vollblut und zwei unterschiedlichen Assays zur Quantifizierung der S.aureus-Zytotoxizität gegen diese wichtigen angeborenen Immunzellen.Diese Assays können alle mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden und sind leicht anpassungsfähig, um andere Aspekte der Wirtspathogen-Interaktion zu untersuchen. Diese Experimente werden Vollblut von menschlichen Spendern verwenden und erfordern die Zustimmung des zuständigen institutionellen Ausschusses oder Desatorausschusses sowie eine Erklärung, dass die informierte Zustimmung von allen Teilnehmern eingeholt wurde. Der erste Schritt dieses Verfahrens ist die Isolierung von Neutrophilen durch den Einsatz von Zentrifugation und Dichtegradienten.Erstens, bringen Sie 50 Milliliter 3%dextran 0,9%Natriumchlorid, 35 Milliliter 0,9% Natriumchlorid, 20 Milliliter 1,8% Natriumchlorid, 12 Milliliter 1,077 Gramm pro Milliliter Ficolllösung und 20 Milliliter Wasser auf Raumtemperatur. 25 Milliliter frisch gezogenes heparinisiertes Vollmenschliches Blut in zwei konische Zentrifugenröhrchen übertragen. Kombinieren Sie 25 Milliliter frisch gezogenes heparinisiertes Vollblut mit 25 Milliliter n.A. Äquivalentvolumen der Raumtemperatur, 3%dextran, 0,9% Natriumchlorid im Eins-zu-Eins-Verhältnis.Mischen Sie durch sanftes Schaukeln jedes 50 Milliliter konische Rohr und dann bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen lassen. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur werden zwei separate Schichten angezeigt. Übertragen Sie die oberste Schicht jeder Dextran-Blutmischung in neue 50 Milliliter konische Schläuche.Zentrifuge bei 450 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit niedrigen oder gar keinen Pausen. Sorgsam beide Überstande ansaugen und entsorgen, ohne die Zellpellets zu stören. Jedes Zellpellet vorsichtig in zwei Millilitern 0,9% Natriumchlorid wieder aufsetzen.Kombinieren Sie die resuspendierten Pellets in einem einzigen, 50 Milliliter konischen dann fügen Sie die restlichen 0,9%Natriumchlorid zu einem Endvolumen von 35 Milliliter. Unterlegen Sie 10 Milliliter 1,077 Gramm pro Milliliter Ficoll-Lösung unter der Zellsuspension mit einer Handpipette. Nach dem Spinnen bei 450 g für 30 Minuten bei Raumtemperatur, mit niedrigen oder gar keinen Pausen, den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Zellpellet zu stören, wie zuvor gezeigt.Lyse die roten Blutkörperchen durch Wiederaufsetzen der Zelle Pellet in 20 Milliliter Raumtemperatur Wasser. Mischen Sie sanft durch Schaukeln für 30 Sekunden. Sofort 20 Milliliter Natriumchlorid und Zentrifugenprobe bei 450 g 10 Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen.Sorgfältig aspirieren Überstand wie zuvor gezeigt. Das Zellpellet vorsichtig in zwei Milliliter Raumtemperatur RPMI wieder aufhängen und auf Eis legen. Zählen Sie Zellen mit einem Hemacytometer.Reinigene PMNs mit einer Konzentration von einem mal 10 bis 7. Milliliter mit eiskaltem RPMI wieder aussetzen und auf Eis halten. Kombinieren Sie 100 Mikroliter gereinigte PMNs mit 300 Mikroliter DPBS, die einen Mikroliter Propidiumjodid-Färbung in zwei replizierten Durchflusszytometrieröhrchen enthalten. Für eine positive Kontrolle 40 Mikroliter 0,5%Triton X-100 Lösung in eine der Durchflusszytometrieröhren geben und gründlich mischen.Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Vorwärtsstreuung, die Seitenstreuung und die Propidiumjodidfärbung zu messen, um die Reinheit und Integrität isolierter PMNs zu bestimmen. Es sollten nur PMN-Präparate verwendet werden, die über 98% rein und über 95% Propidiumjodid negativ sind. Für das Protokoll, das die Isolierung des normalen menschlichen Serums umreißt, beziehen Sie sich auf das vollständige Manuskript.Bereiten Sie eine 96-Well-Platte für PMN-Zytotoxizitätstests vor, indem Sie 100 Mikroliter 20% isoliertes menschliches Serum, das mit DPBS verdünnt wird, zu einzelnen Brunnen hinzufügen, die in diesem Test verwendet werden. Achten Sie darauf, mindestens eine negative Kontrollgut, die nur Medien und mindestens eine positive Kontrolle gut, die 0.05%Triton X.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten erhalten. Nach der Inkubation die codierten Brunnen zweimal mit 100 Mikrolitereeis DPBS waschen und Platte auf Eis legen.Entfernen Sie alle verbleibenden DPBS aus Plattenbrunnen und fügen Sie vorsichtig 100 Mikroliter gereinigter menschlicher PMNs zu einem Mal 10 bis zu den 7. Zellen pro Milliliter zu jedem codierten Brunnen hinzu. Lassen Sie plattierte Neutrophilen sich absetzen, indem Sie sie vor der Anwendung in den folgenden Zytotoxizitätstests mindestens fünf Minuten auf Eis lassen. Dieser Abschnitt beschreibt einen Test, der die Zytotoxizität von extrazellulären Proteinen quantifiziert, die von Staph aureus gegen menschliche PMNs produziert werden.Culture S.aureus über Nacht in geeigneten Medien mit einem Schüttel-Inkubator auf 37 Grad Celsius am Tag vor dem Experiment eingestellt. Subkultur S.aureus durch eine ein bis 100 Verdünnung von über Nacht Bakterienkulturen mit frischen Medien. Bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bebrüten, bis die Bakterien eine frühe stationäre Wachstumsphase erreichen.Nach fünf Stunden Wachstum einen Milliliter Subkultur S.aureus in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und Zentrifuge bei 5.000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur übertragen. Nach der Zentrifugation, Aspirieren Überstand. Übergeben Sie angesaugte Überstandmittel durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und legen Sie es auf Eis.Führen Sie serielle Verdünnungen von Überwachungen mit eiskalten Medien, die verwendet werden, um Staph aureus zu kulturen. Fügen Sie vorsichtig überwassertante Proben oder Medien, die für negative und positive Kontrollen ausgeliehen sind, zu einzelnen Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu, die PMNs auf Eis enthält, wie zuvor beschrieben. Sanft Gesteinsplatte, um Überstand in Brunnen zu verteilen und bei 37 Grad Celsius zu brüten.Zu den gewünschten Zeiten die Platte aus dem Inkubator entfernen und auf Eis legen. Fügen Sie 300 Mikroliter eiskalte DPBS mit einem Mikroliter Propidiumjodid zu jedem Durchflusszytometrierohr hinzu. Übertragen Sie die Proben, um Zytometrierohre auf Eis zu fließen.Für den Positivkontrollbrunnen 20 Mikroliter 10% Triton X in die Probe geben, bevor sie in ein Durchflusszytometrierohr übertragen werden. Analysieren Sie die Propidiumjodidfärbung von berauschten PMNs mithilfe der Durchflusszytometrie. Dieser Abschnitt beschreibt einen Test, der die Zytotoxizität von S.aureus nach Phagozytose durch menschliche PMNs quantifiziert.Wachstumskurven, die durch die optische Dichte von 600 Nanometern und die Konzentration von Bakterien definiert sind, müssen für die relevanten Staph aureus-Stämme vor der Verwendung in diesem Test bestimmt werden. Beginnen Sie über Nacht Kulturen von S.aureus-Stämmen und Subkulturbakterien, wie zuvor beschrieben. Sobald subkultivierter Staph aureus ein mittelexponentielles Wachstum erreicht hat, übertragen Sie einen Milliliter Kulturbakterien auf 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 5 000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Waschen Sie S.aureus, indem Sie seinen Überstand anaspirieren, ohne das Pellet zu stören, und setzen Sie die pelletierten Bakterien mit einem Milliliter DPBS wieder aus. Wirbeln Sie die Proben für 30 Sekunden. Zentrifugieren Sie die Proben bei 5.000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Um Staph aureus zu oxenisieren, setzen Sie zuerst das bakterielle Pellet in einem Milliliter von 20% menschlichem Serum wieder aus. Dann inkubieren Proben bei 37 Grad Celsius mit Aufregung für 15 Minuten. Waschen Sie oxenisierte Staph aureus nach Zentrifugation, wie zuvor gezeigt.Verdünnte oxenisierte Staph aureus-Stämme auf ein mal 10 bis zu den 8. koloniebildenden Einheiten, KBE pro Milliliter, mit eiskaltem RPMI. Wirbeln Sie die Probe für 30 Sekunden und legen Sie auf Eis. Bestätigen Sie die Konzentrationen von Staph aureus, die für diese Tests verwendet werden, indem Sie ein bis zehn serielle Verdünnungen von Bakterien auf Agar plattieren.Fügen Sie 100 Mikroliter pro Brunnen jedes Staph aureus-Stamms oder RPMI für positive und negative Kontrollen vorsichtig zu PMNs in einer 96-Well-Platte auf Eis ab Schritt 1.14 hinzu. Sanft Rockplatte, um Staph aureus in Brunnen zu verteilen. Phagozytose durch Zentrifugieren platte bei 500 g für acht Minuten bei vier Grad Celsius synchronisieren und Brütplatte bei 37 Grad Celsius unmittelbar nach Zentrifugation als Zeit null.Zu den gewünschten Zeitpunkten die Platte auf Eis legen und 200 Mikroliter eiskalte DPBS mit einem Mikroliter Propidiumiodid in jedes Durchflusszytometrierohr geben und dann Proben in das entsprechende Rohr übertragen. Analysieren Sie Proben für Propidiumjodidfärbung mit Durchflusszytometrie, wie in 2.8 und 2.9 beschrieben. Die Transkription von Zweikomponenten-Leukotoxinen, die auf humane PMNs von Staph aureus abzielen, erfordert, dass das SA- oder S2-Komponentensystem den Nutzen der beschriebenen Assays zur Quantifizierung der Staph aureus-Zytotoxizität gegen humane PMNs demonstriert.Diese Experimente wurden mit einem klinisch relevanten Staph-Aureus-Isolat durchgeführt, das als USA300 in einem isologenischen Deletionsmutant von SA oder S in diesem Stamm identifiziert wurde. Die linke Seite zeigt gereinigte PMNs und das rechte Panel zeigt absichtlich kontaminierte Proben als Beispiel. PMNs, die mit den in Abschnitt 1 dieses Protokolls beschriebenen Verfahren isoliert wurden, wurden mit Propidiumjodid befleckt und mit Flusszytometrie untersucht.Vorwärts- und Seitenstreuungsdiagramme wurden verwendet, um die Kontamination von gereinigten PMNs durch Monozyten oder Lymphozyten über die Jahre 1A und 1B zu erkennen. Durch die Verwendung der beschriebenen Methode der humanen PMN-Reinigung können wir konsequent fünfmal 10 bis 7. bis einmal 10 bis 8. PMNs isolieren, die über 98% rein sind und über 95% Propidiumiodid negativ sind.Die Zytotoxizität von extrazellulären Proteinen, die von USA300 und dem AsaeR/S Mutant produziert wurden, wurde gegen gereinigte PMNs getestet. Diese Experimente zeigen eine konzentrationsabhängige Erhöhung der Propidiumjodidfärbung von gereinigten PMNs nach 30 Minuten Intoxikation mit extrazellulären Proteinen, die von USA300 produziert werden, jedoch nicht mit dem AsaeR/S Mutanten. Weitere Experimente zeigten einen stetigen Anstieg des Anteils an Propidiumiodid-positiven PMNs nach einer Vergiftung durch USA300 extrazelluläre Proteine, die nach etwa 30 Minuten auf dem Plateau lagen.Minimale Propidiumjodidfärbung menschlicher PMNs wurde zu allen Zeitpunkten nach der Exposition gegenüber extrazellulären Proteinen, die von der AsaeR/S-Mutante produziert wurden, festgestellt. Zuletzt wurde die Zytotoxizität von USA300 und AsaeR/S Mutant gegen PMNs nach synchronisierter Phagozytose getestet, eine konzentrationsabhängige Erhöhung des Anteils an Propidiumiodid-positiven PMNs wurde 90 Minuten nach der Phagozytose von USA300 beobachtet. Deutlich weniger PMNs waren propidium iodid positiv nach der Phagozytose des AsaeR/S Mutanten.Die Aufzählung des US300 und AsaeR/S mutierten Inokulums wurde in jedem dieser Experimente verwendet, um zu zeigen, dass der Kontrast in der Zytotoxizität zwischen diesen Stämmen nicht auf Unterschiede in der Konzentration der verwendeten Bakterien zurückzuführen war. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung von PMNs aus menschlichem Blut in zwei unterschiedlichen Techniken zur Quantifizierung der Zytotoxizität von S.aureus gegen diese angeborenen Immunzellen. Der Erfolg dieser Verfahren hängt von der Qualität der gereinigten PMNs und der geeigneten Herstellung von Staph aureus Bakterien oder Überräuern ab.Bitte konsultieren Sie das vollständige Manuskript für wichtige Punkte, die bei der Durchführung dieser Verfahren zu berücksichtigen sind. USA300 ist ein virulentes MRSA-Isolat und der Verlust von AsaeR/S reduziert die Transkription von Virulenzfaktoren, die auf menschliche PMNs abzielen, drastisch, was diese Stämme zu idealen Modellen für den Vergleich der Zytotoxizität mit den beschriebenen Assays macht. Bei Verwendung anderer Staph aureus-Stämme kann die Anpassung der Wachstumsbedingungen, der zugesetzten Überstände oder des Verhältnisses von Bakterien zu PMNerforderlich sein.

quantifying-cytotoxicity-staphylococcus-aureus-against-human

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir einen Lysostaphin-basierten In-vitro-Enzymschutz-Assay, um die Internalisierung von Staphylococcus aureus in A549-Zellen zu quantifizieren. Der Assay hilft bei qualitativen, quantitativen und charakterisierenden Studien der intrazellulären bakteriellen Last in den Wirtszellen.

Lysostaphin-basierter Enzymschutz-Assay: Eine In-vitro-Methode zur Quantifizierung der intrazellulären Staphylococcus aureus-Last durch enzymvermittelte selektive Abtötung extrazellulärer Bakterien

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung der Zytotoxizität von natürlichen Killerzellen gegen Krebszellen mit dem Calcein AM Farbstoff. Die reduzierte Anzahl fluoreszierender Krebszellen nach Co-Kultur mit natürlichen Killerzellen deutet auf eine natürliche Killerzell-vermittelte Zytotoxizität gegenüber Krebszellen hin.

Calcein-Acetoxymethyl-Färbung zur Bewertung der natürlichen Killerzell-vermittelten Zytotoxizität gegenüber Krebszellen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Zytotoxizität von Proteinen, die von Staphylococcus aureus, einem pathogenen Bakterium, auf isolierten humanen polymorphkernigen Leukozyten (PMNs) produziert werden. Die sezernierten zytotoxischen Proteine bilden Poren auf der PMN-Zellmembran und leiten so den Zelltod ein. Nach der Färbung der toten Zellen mit Propidiumiodid wird eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um die toten Zellen zu quantifizieren und die Zytotoxizität der Bakterien...

Ein Assay für bakterielle extrazelluläre Protein-vermittelte Zytotoxizität auf PMNs

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay zum Nachweis der Zytotoxizität von virulenten und weniger virulenten Staphylococcus aureus-Stämmen gegen humane Neutrophile nach Phagozytose mittels Durchflusszytometrie.

Zytotoxizitätstest von Staphylococcus aureus-Stämmen an Neutrophilen nach Phagozytose

Das Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) ist ein Zytotoxizitätstest durch Einbau Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie mit Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildverarbeitung entwickelt. Hier beschreiben wir, wie Lymphom-Zellen mit einem anti-CD20-Antikörper behandelt werden können, in Echtzeit in menschlichem Vollblut zur quantitativen Analyse bereitzustellen zelluläre Zytotoxizität untersucht werden.

Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut

Es wurde ein Echtzeit-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um gleichzeitig (1) eukaryotische zellpenetrierende antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren, die auf einen intrazellulären bakteriellen Krankheitserreger abzielen, und (2) die Zytotoxizität eukaryotischer Zellen zu bewerten. Eine Variation der gleichen Technologie wurde anschließend mit digitaler Dosiertechnologie kombiniert, um einfache, hochauflösende Dosis-Wirkungs-Studien sowie zwei- und dreidimensionale Synergiestudien zu...

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Das Protokoll beschreibt einen schnellen, hohen Durchsatz, zuverlässigen, kostengünstigen und unvoreingenommenen Test zur effizienten Bestimmung der Zelllebensfähigkeit. Dieser Test ist besonders nützlich, wenn die Mitochondrien der Zellen geschädigt wurden, was andere Assays stört. Der Test verwendet die automatisierte Zählung von Zellen, die mit zwei Kernfarbstoffen – Hoechst 33342 und Propidiumiodid – befleckt sind.

Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Bewertung der Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen auf einer primären und immortalisierten Zelllinie.

Bestimmung der Toxizität von UV-Strahlung und Chemikalien auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen

Dieses Protokoll zielt darauf ab, zu beschreiben, wie das Ausmaß der Internalisierung von Staphylococcus aureus und seine Überlebensfähigkeit in der menschlichen Wirtszelle sowie die intrazelluläre Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen untersucht werden können.

Verbesserter Enzymschutzassay zur Untersuchung der Internalisierung von Staphylococcus aureus und der intrazellulären Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen

Das vorliegende Protokoll bereitet die physikalischen Eigenschaften, die Immunantwort und die In-vivo-Schutzwirkung eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs vor und bewertet sie.

Evaluierung der Immunantwort eines adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffs gegen Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)-Infektion

Staphylococcus aureus (S. aureus) hat die Fähigkeit, sich im ganzen Körper zu verbreiten und anhaltende und wiederkehrende Infektionen zu verursachen. Um diese Prozesse besser zu verstehen, wird in dieser Studie ein intrazelluläres Infektionsmodell für S. aureus etabliert. Dieses Modell wird eine entscheidende Grundlage für die Untersuchung der Mechanismen hinter intrazellulären Infektionen liefern.

Entwicklung und Bewertung von intrazellulären Infektionsmodellen für Staphylococcus aureus

Erfahren Sie die Isolierung polymorphkerniger Leukozyten aus menschlichem Blut und zwei Assays zur Quantifizierung der Zytotoxizität von Staphylococcus aureus. Diese Methoden ermöglichen Untersuchungen zur Wirt-Pathogen-Interaktion.

Quantifizierung der Zytotoxizität von Staphyloccus aureus gegen humane polymorphonukleare Leukozyten

Weitere Videos entdecken