Quantifizierung der Zytotoxizität von Staphyloccus aureus gegen humane polymorphonukleare Leukozyten

Staphylococcus aureus ist ein gram-positives Bakterium, das eine breite Palette von Virulenzfaktoren produziert, die die Pathogenese fördern. Dazu gehören Zweikomponenten-Leukotoxine, die die Membranintegrität polymorphonuklearer Leukozyten, auch PMNs oder Neutrophile genannt, stören. Dieses Video zeigt die Isolierung von PMNs aus menschlichem Vollblut und zwei unterschiedlichen Assays zur Quantifizierung der S.aureus-Zytotoxizität gegen diese wichtigen angeborenen Immunzellen.

Diese Assays können alle mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden und sind leicht anpassungsfähig, um andere Aspekte der Wirtspathogen-Interaktion zu untersuchen. Diese Experimente werden Vollblut von menschlichen Spendern verwenden und erfordern die Zustimmung des zuständigen institutionellen Ausschusses oder Desatorausschusses sowie eine Erklärung, dass die informierte Zustimmung von allen Teilnehmern eingeholt wurde. Der erste Schritt dieses Verfahrens ist die Isolierung von Neutrophilen durch den Einsatz von Zentrifugation und Dichtegradienten.

Erstens, bringen Sie 50 Milliliter 3%dextran 0,9%Natriumchlorid, 35 Milliliter 0,9% Natriumchlorid, 20 Milliliter 1,8% Natriumchlorid, 12 Milliliter 1,077 Gramm pro Milliliter Ficolllösung und 20 Milliliter Wasser auf Raumtemperatur. 25 Milliliter frisch gezogenes heparinisiertes Vollmenschliches Blut in zwei konische Zentrifugenröhrchen übertragen. Kombinieren Sie 25 Milliliter frisch gezogenes heparinisiertes Vollblut mit 25 Milliliter n.A. Äquivalentvolumen der Raumtemperatur, 3%dextran, 0,9% Natriumchlorid im Eins-zu-Eins-Verhältnis.

Mischen Sie durch sanftes Schaukeln jedes 50 Milliliter konische Rohr und dann bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen lassen. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur werden zwei separate Schichten angezeigt. Übertragen Sie die oberste Schicht jeder Dextran-Blutmischung in neue 50 Milliliter konische Schläuche.

Zentrifuge bei 450 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit niedrigen oder gar keinen Pausen. Sorgsam beide Überstande ansaugen und entsorgen, ohne die Zellpellets zu stören. Jedes Zellpellet vorsichtig in zwei Millilitern 0,9% Natriumchlorid wieder aufsetzen.

Kombinieren Sie die resuspendierten Pellets in einem einzigen, 50 Milliliter konischen dann fügen Sie die restlichen 0,9%Natriumchlorid zu einem Endvolumen von 35 Milliliter. Unterlegen Sie 10 Milliliter 1,077 Gramm pro Milliliter Ficoll-Lösung unter der Zellsuspension mit einer Handpipette. Nach dem Spinnen bei 450 g für 30 Minuten bei Raumtemperatur, mit niedrigen oder gar keinen Pausen, den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Zellpellet zu stören, wie zuvor gezeigt.

Lyse die roten Blutkörperchen durch Wiederaufsetzen der Zelle Pellet in 20 Milliliter Raumtemperatur Wasser. Mischen Sie sanft durch Schaukeln für 30 Sekunden. Sofort 20 Milliliter Natriumchlorid und Zentrifugenprobe bei 450 g 10 Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen.

Sorgfältig aspirieren Überstand wie zuvor gezeigt. Das Zellpellet vorsichtig in zwei Milliliter Raumtemperatur RPMI wieder aufhängen und auf Eis legen. Zählen Sie Zellen mit einem Hemacytometer.

Reinigene PMNs mit einer Konzentration von einem mal 10 bis 7. Milliliter mit eiskaltem RPMI wieder aussetzen und auf Eis halten. Kombinieren Sie 100 Mikroliter gereinigte PMNs mit 300 Mikroliter DPBS, die einen Mikroliter Propidiumjodid-Färbung in zwei replizierten Durchflusszytometrieröhrchen enthalten. Für eine positive Kontrolle 40 Mikroliter 0,5%Triton X-100 Lösung in eine der Durchflusszytometrieröhren geben und gründlich mischen.

Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Vorwärtsstreuung, die Seitenstreuung und die Propidiumjodidfärbung zu messen, um die Reinheit und Integrität isolierter PMNs zu bestimmen. Es sollten nur PMN-Präparate verwendet werden, die über 98% rein und über 95% Propidiumjodid negativ sind. Für das Protokoll, das die Isolierung des normalen menschlichen Serums umreißt, beziehen Sie sich auf das vollständige Manuskript.

Bereiten Sie eine 96-Well-Platte für PMN-Zytotoxizitätstests vor, indem Sie 100 Mikroliter 20% isoliertes menschliches Serum, das mit DPBS verdünnt wird, zu einzelnen Brunnen hinzufügen, die in diesem Test verwendet werden. Achten Sie darauf, mindestens eine negative Kontrollgut, die nur Medien und mindestens eine positive Kontrolle gut, die 0.05%Triton X.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten erhalten. Nach der Inkubation die codierten Brunnen zweimal mit 100 Mikrolitereeis DPBS waschen und Platte auf Eis legen.

Entfernen Sie alle verbleibenden DPBS aus Plattenbrunnen und fügen Sie vorsichtig 100 Mikroliter gereinigter menschlicher PMNs zu einem Mal 10 bis zu den 7. Zellen pro Milliliter zu jedem codierten Brunnen hinzu. Lassen Sie plattierte Neutrophilen sich absetzen, indem Sie sie vor der Anwendung in den folgenden Zytotoxizitätstests mindestens fünf Minuten auf Eis lassen. Dieser Abschnitt beschreibt einen Test, der die Zytotoxizität von extrazellulären Proteinen quantifiziert, die von Staph aureus gegen menschliche PMNs produziert werden.

Culture S.aureus über Nacht in geeigneten Medien mit einem Schüttel-Inkubator auf 37 Grad Celsius am Tag vor dem Experiment eingestellt. Subkultur S.aureus durch eine ein bis 100 Verdünnung von über Nacht Bakterienkulturen mit frischen Medien. Bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bebrüten, bis die Bakterien eine frühe stationäre Wachstumsphase erreichen.

Nach fünf Stunden Wachstum einen Milliliter Subkultur S.aureus in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und Zentrifuge bei 5.000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur übertragen. Nach der Zentrifugation, Aspirieren Überstand. Übergeben Sie angesaugte Überstandmittel durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und legen Sie es auf Eis.

Führen Sie serielle Verdünnungen von Überwachungen mit eiskalten Medien, die verwendet werden, um Staph aureus zu kulturen. Fügen Sie vorsichtig überwassertante Proben oder Medien, die für negative und positive Kontrollen ausgeliehen sind, zu einzelnen Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu, die PMNs auf Eis enthält, wie zuvor beschrieben. Sanft Gesteinsplatte, um Überstand in Brunnen zu verteilen und bei 37 Grad Celsius zu brüten.

Zu den gewünschten Zeiten die Platte aus dem Inkubator entfernen und auf Eis legen. Fügen Sie 300 Mikroliter eiskalte DPBS mit einem Mikroliter Propidiumjodid zu jedem Durchflusszytometrierohr hinzu. Übertragen Sie die Proben, um Zytometrierohre auf Eis zu fließen.

Für den Positivkontrollbrunnen 20 Mikroliter 10% Triton X in die Probe geben, bevor sie in ein Durchflusszytometrierohr übertragen werden. Analysieren Sie die Propidiumjodidfärbung von berauschten PMNs mithilfe der Durchflusszytometrie. Dieser Abschnitt beschreibt einen Test, der die Zytotoxizität von S.aureus nach Phagozytose durch menschliche PMNs quantifiziert.

Wachstumskurven, die durch die optische Dichte von 600 Nanometern und die Konzentration von Bakterien definiert sind, müssen für die relevanten Staph aureus-Stämme vor der Verwendung in diesem Test bestimmt werden. Beginnen Sie über Nacht Kulturen von S.aureus-Stämmen und Subkulturbakterien, wie zuvor beschrieben. Sobald subkultivierter Staph aureus ein mittelexponentielles Wachstum erreicht hat, übertragen Sie einen Milliliter Kulturbakterien auf 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 5 000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Waschen Sie S.aureus, indem Sie seinen Überstand anaspirieren, ohne das Pellet zu stören, und setzen Sie die pelletierten Bakterien mit einem Milliliter DPBS wieder aus. Wirbeln Sie die Proben für 30 Sekunden. Zentrifugieren Sie die Proben bei 5.000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Um Staph aureus zu oxenisieren, setzen Sie zuerst das bakterielle Pellet in einem Milliliter von 20% menschlichem Serum wieder aus. Dann inkubieren Proben bei 37 Grad Celsius mit Aufregung für 15 Minuten. Waschen Sie oxenisierte Staph aureus nach Zentrifugation, wie zuvor gezeigt.

Verdünnte oxenisierte Staph aureus-Stämme auf ein mal 10 bis zu den 8. koloniebildenden Einheiten, KBE pro Milliliter, mit eiskaltem RPMI. Wirbeln Sie die Probe für 30 Sekunden und legen Sie auf Eis. Bestätigen Sie die Konzentrationen von Staph aureus, die für diese Tests verwendet werden, indem Sie ein bis zehn serielle Verdünnungen von Bakterien auf Agar plattieren.

Fügen Sie 100 Mikroliter pro Brunnen jedes Staph aureus-Stamms oder RPMI für positive und negative Kontrollen vorsichtig zu PMNs in einer 96-Well-Platte auf Eis ab Schritt 1.14 hinzu. Sanft Rockplatte, um Staph aureus in Brunnen zu verteilen. Phagozytose durch Zentrifugieren platte bei 500 g für acht Minuten bei vier Grad Celsius synchronisieren und Brütplatte bei 37 Grad Celsius unmittelbar nach Zentrifugation als Zeit null.

Zu den gewünschten Zeitpunkten die Platte auf Eis legen und 200 Mikroliter eiskalte DPBS mit einem Mikroliter Propidiumiodid in jedes Durchflusszytometrierohr geben und dann Proben in das entsprechende Rohr übertragen. Analysieren Sie Proben für Propidiumjodidfärbung mit Durchflusszytometrie, wie in 2.8 und 2.9 beschrieben. Die Transkription von Zweikomponenten-Leukotoxinen, die auf humane PMNs von Staph aureus abzielen, erfordert, dass das SA- oder S2-Komponentensystem den Nutzen der beschriebenen Assays zur Quantifizierung der Staph aureus-Zytotoxizität gegen humane PMNs demonstriert.

Diese Experimente wurden mit einem klinisch relevanten Staph-Aureus-Isolat durchgeführt, das als USA300 in einem isologenischen Deletionsmutant von SA oder S in diesem Stamm identifiziert wurde. Die linke Seite zeigt gereinigte PMNs und das rechte Panel zeigt absichtlich kontaminierte Proben als Beispiel. PMNs, die mit den in Abschnitt 1 dieses Protokolls beschriebenen Verfahren isoliert wurden, wurden mit Propidiumjodid befleckt und mit Flusszytometrie untersucht.

Vorwärts- und Seitenstreuungsdiagramme wurden verwendet, um die Kontamination von gereinigten PMNs durch Monozyten oder Lymphozyten über die Jahre 1A und 1B zu erkennen. Durch die Verwendung der beschriebenen Methode der humanen PMN-Reinigung können wir konsequent fünfmal 10 bis 7. bis einmal 10 bis 8. PMNs isolieren, die über 98% rein sind und über 95% Propidiumiodid negativ sind.

Die Zytotoxizität von extrazellulären Proteinen, die von USA300 und dem AsaeR/S Mutant produziert wurden, wurde gegen gereinigte PMNs getestet. Diese Experimente zeigen eine konzentrationsabhängige Erhöhung der Propidiumjodidfärbung von gereinigten PMNs nach 30 Minuten Intoxikation mit extrazellulären Proteinen, die von USA300 produziert werden, jedoch nicht mit dem AsaeR/S Mutanten. Weitere Experimente zeigten einen stetigen Anstieg des Anteils an Propidiumiodid-positiven PMNs nach einer Vergiftung durch USA300 extrazelluläre Proteine, die nach etwa 30 Minuten auf dem Plateau lagen.

Minimale Propidiumjodidfärbung menschlicher PMNs wurde zu allen Zeitpunkten nach der Exposition gegenüber extrazellulären Proteinen, die von der AsaeR/S-Mutante produziert wurden, festgestellt. Zuletzt wurde die Zytotoxizität von USA300 und AsaeR/S Mutant gegen PMNs nach synchronisierter Phagozytose getestet, eine konzentrationsabhängige Erhöhung des Anteils an Propidiumiodid-positiven PMNs wurde 90 Minuten nach der Phagozytose von USA300 beobachtet. Deutlich weniger PMNs waren propidium iodid positiv nach der Phagozytose des AsaeR/S Mutanten.

Die Aufzählung des US300 und AsaeR/S mutierten Inokulums wurde in jedem dieser Experimente verwendet, um zu zeigen, dass der Kontrast in der Zytotoxizität zwischen diesen Stämmen nicht auf Unterschiede in der Konzentration der verwendeten Bakterien zurückzuführen war. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung von PMNs aus menschlichem Blut in zwei unterschiedlichen Techniken zur Quantifizierung der Zytotoxizität von S.aureus gegen diese angeborenen Immunzellen. Der Erfolg dieser Verfahren hängt von der Qualität der gereinigten PMNs und der geeigneten Herstellung von Staph aureus Bakterien oder Überräuern ab.

Bitte konsultieren Sie das vollständige Manuskript für wichtige Punkte, die bei der Durchführung dieser Verfahren zu berücksichtigen sind. USA300 ist ein virulentes MRSA-Isolat und der Verlust von AsaeR/S reduziert die Transkription von Virulenzfaktoren, die auf menschliche PMNs abzielen, drastisch, was diese Stämme zu idealen Modellen für den Vergleich der Zytotoxizität mit den beschriebenen Assays macht. Bei Verwendung anderer Staph aureus-Stämme kann die Anpassung der Wachstumsbedingungen, der zugesetzten Überstände oder des Verhältnisses von Bakterien zu PMNerforderlich sein.