Ein neues Toolkit zur Bewertung von Genfunktionen mit bedingter Cas9-Stabilisierung

Diese Methode ermöglicht eine schnelle, temperaturgesteuerte CRISPR-Cas9-Genbearbeitung unter einem kleinen Molekül, Shield-1. Es bietet auch weniger Off-Target-Effekte, eine geringere Zelltoxizität und auch eine höhere intern kontrollierte Genbearbeitung, wenn man es mit der konstitutiven Aktivierung von Cas9 vergleicht. Der Hauptvorteil dieses Partikels besteht darin, dass es zur Charakterisierung essentieller Gene sowie tumorüberlebender Gene verwendet werden kann.

Die Destabilisierung von DD-Cas9 ist unabhängig von seiner Expression, und dies ermöglicht es, das interessierende Gen unter demselben Promotor co-exprimiert zu werden. Diese Methode kann leicht auf In-vivo- und In-vitro-Studien angewendet werden. Shield-1 kann auch durch die Blut-Hirn-Schranke eindringen, was es auch einfach macht, Gene zu untersuchen, die an der Gehirnentwicklung beteiligt sind.

Säen Sie gesunde HEK293T-Zellen gleichmäßig mit einer Dichte von ein bis zwei Millionen Zellen pro 10-Zentimeter-Gewebekulturplatte aus, indem Sie 10 Milliliter Glukose-DMEM mit 10% gefiltertem FBS verwenden. Inkubieren Sie die Zellen im Gewebekultur-Inkubator bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius für 20 Stunden. Bestätigen Sie am nächsten Tag, dass die Zellen durch Hellfeldmikroskopie eine Konfluenz von 70% erreicht haben und gleichmäßig über die Platte verteilt sind.

Wechseln Sie die Medien eine Stunde vor der Transfektion mit einem Endvolumen von 10 Millilitern. Bereiten Sie zwei Röhrchen mit 500 Mikrolitern warmer Medien vor. Fügen Sie 25 Mikroliter Transfektionsreagenz in die einse Röhre hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Zu der anderen Tube eine Mischung aus Plasmiden hinzufügen. Mischen Sie Rohr eins mit Rohr zwei, um eine Transfektionsmischung zu bilden, und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Fügen Sie die Transfektionsmischung tropfenweise zu den HEK293T-Zellen hinzu und inkubieren Sie die Platte im Gewebekulturinkubator.

Wechseln Sie das Medium nach 18 Stunden vorsichtig in 10 Milliliter frisches DMEM mit 10% FBS, um das Transfektionsreagenz zu entfernen. Inkubieren Sie die Zellen für die nächsten 48 Stunden. Nach 48 Stunden den Überstand mit einer 10-Milliliter-Spritze sammeln und durch einen 0,45-Mikrometer-Filter leiten.

Aliquot den Virusüberstand und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius. Zur Bestimmung des Virustiters säen Sie 5 Millionen HEK293T-Zellen pro Vertiefung in zwei Sechs-Well-Platten. Inkubieren Sie beide Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid über Nacht, um 50 bis 60% Konfluenz zu erreichen.

Verwenden Sie am nächsten Tag eine der Sechs-Well-Platten, um die Zellen in den sechs Wells zu zählen. Tauen Sie das Virus-Aliquot auf, das zur Durchführung der seriellen Verdünnung verwendet wird, und fügen Sie acht Mikrogramm pro Milliliter Polybrenagenz hinzu, bereiten Sie DMEM mit 10% FBS für die serielle Verdünnung des Virus vor und fügen Sie das Polybren-Reagenz hinzu. Zwei Milliliter zehnfacher serieller Verdünnungen des Lentivirus von 0,1 bis 0,0001 in Polybren enthaltenden Medien vorbereiten.

Entfernen Sie medien von der Sechs-Well-Platte und fügen Sie den Wells einen Milliliter virale Verdünnungen hinzu, wobei eine Vertiefung mit Medien allein als Negativkontrolle und eine Vertiefung mit 100% Virus übrig bleibt. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden. Entfernen Sie am nächsten Tag das Medium mit dem Virus von den Sechs-Well-Platten und wechseln Sie es in zwei Milliliter frisches DMEM mit 10% FBS.

Inkubieren Sie die Zellen für 48 bis 72 Stunden und beobachten Sie GFP jeden Tag mit einem Fluoreszenzmikroskop. Nach 48 bis 72 Stunden die Zellen ablösen und in maximalem Puffer wieder aufbringen. Verwenden Sie ein Durchflusszytometer, um den Prozentsatz der GFP-Expression zu bestimmen und den Virustiter mit der im Textmanuskript angegebenen Formel zu berechnen.

Platten Sie die Zelllinie von Interesse in einer 10 Zentimeter großen Platte und inkubieren Sie über Nacht, um eine Konfluenz von 50 bis 60% zu erreichen Dann infizieren Sie die Zellen mit 500 bis 2.000 Mikrolitern Viruspartikeln in einem 10 Milliliter Gesamtvolumen des Kulturmediums. Inkubieren Sie die viralen Medien für 24 Stunden. Wechseln Sie am nächsten Tag die viralen Medien in Nährmedien und bestimmen Sie den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen mithilfe der Durchflusszytometrie.

Wählen Sie GFP-positive Zellen aus, indem Sie BD FACSAria II für die Zellsortierung verwenden. Erweitern Sie positiv ausgewählte Zellen und frieren Sie den Bestand ein. Platten Sie die positiv ausgewählten Zellen und nicht übertragenen Zellen in 12-Well-Platten separat, 24 Stunden nach der Infektion.

Warten Sie, bis sich die Zellen anlagern, und wechseln Sie das Medium in Zellkulturmedien mit 200 nanomolaren Shield-1. Ersetzen Sie die Medien in den Platten durch transduzierte und untransduzierte Zellen, so dass zwei Vertiefungen pro Platte mit regulären Medien als Negativkontrolle übrig bleiben. Inkubieren und extrahieren Sie Proteine aus jeder Vertiefung bei Null, zwei, sechs, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach Zugabe von Shield-1 zu den Vertiefungen.

Entfernen Sie dann das Medium mit Shield-1 aus den restlichen Vertiefungen und wechseln Sie es gegen normale Zellmedien. Sammeln Sie die Proteine aus diesen Vertiefungen zwei, sechs und 12 Stunden nach dem Medienwechsel. Die Induktion des Cas9-Proteins wurde dadurch bestätigt, dass seine Expressionsniveaus zwischen den transduzierten Zellen und dem Vehikel ähnlich waren, ungeachtet des Vorhandenseins oder Fehlens von Shield-1.

Zwei Stunden nach der Behandlung mit Shield-1 liegt eine ausreichende Induktion der Cas9-Expression in der transduzierten A549-Zelllinie vor, die innerhalb von sechs bis 12 Stunden nach Demtzug von Shield-1 vernachlässigbar wird. Shield-1-behandelte transduzierte A549-Zellen nahmen nach 48 Stunden an Zahl ab, ohne die Rinella-Probe zu beeinträchtigen, die durch Immunblotting mit einem Antikörper gegen das erschöpfte RPA3-Protein validiert wurde. Gen-Editing-Inversion oder Indel-Mutationen wurden mit Surveyor-Nuklease-Assays bestätigt.

Das entworfene Lentivirus-Vektorkonstrukt war ein bicistronisches System, das ein anderes Gen von Interesse unter demselben EF-1a-Promotor trug. Ein modifiziertes fluoreszierendes Protein, P2A, wurde hinzugefügt, um infizierte Zellen zu verfolgen. Die Expression des mVenus-Proteins wurde in den Vehikel- und A549-transduzierten Zellen beobachtet, unabhängig von der DD-Cas9-Expression und der Shield-1-Behandlung.

Die effiziente Transduktion der Zelllinie mit dem DD-Cas9-Vektor ist einer der geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte, um gesunde HEK293T-Zellen zu haben und ihre niedrige Durchgangszahl zu nutzen. Die Optimierung des Verhältnisses zwischen DD-Cas9 Plasmid, Verpackungsplasmid und Hüllplasmid ist sehr wichtig für eine optimale Transfektion. Aber daneben ist auch die Menge an Shield-1, die benötigt wird, um DD-Cas9-Zielzellen zu stabilisieren, etwas, auf das Sie achten müssen.

Das DD-Cas9 mit dem Cre-Plasmid ist ebenfalls erhältlich und kann verwendet werden, um die genetischen Interaktionen in In-vivo-Studien auf basis des Cre-lox-Systems zu untersuchen.