Name: Screening und Identifizierung von RNA-Silencing Suppressoren von sezernierten Effektoren von Pflanzenpathogenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Erfahren Sie eine modifizierte Screening-Methode zur schnellen Identifizierung von RNA-Silencing-Suppressoren in Pflanzenpathogenen mit Nicotiana bethamiana. Diese Technik ermöglicht effiziente und genaue Assays für die Pflanzenpathologie.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien des "Shuguang Program" der Shanghai Education Development Foundation und der Shanghai Municipal Education Commission, des National Key Research and Development Program of China National Key R&D Program of China ( 2018YFD0201500), die National Natural Science Foundation of China (Nr. 31571696 und 31660510), das Thousand Talents Program for Young Professionals of China und die Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).

HINWEIS: Alle Schritte des Verfahrens sollten bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden.
VORSICHT: Legen Sie alle Medien, die pathogene Mikroben enthalten, sowie die pflanzen- und pflanzengewebe, die im Test verwendet werden, in die entsprechenden Abfallbehälter und Autoklaven ein, bevor Sie sie entsorgen.
1. Herstellung von Plasmidkonstrukten, die vermeintliche Effektoren enthalten
<ol><li>Wählen Sie vermeintlich eftare resezernierte Effektoren, die während der Infektion stark exprimiert werden, wie durch RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und weiter durch quantitative Echtzeit-PCR-Technik (qRT-PCR) bestimmt.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Signalpeptidspaltungsstelle jedes Effektors mit einem Software-Tool wie SignalP18.</li>
	<li>Entwerfen Sie Primer und führen Sie PCR durch, um das Gen zu verstärken, das den Effektor von Interesse mit High-Fidelity-DNA-Polymerase kodiert. Führen Sie agarose Gelelektrophorese durch, um das PCR-Produkt zu überprüfen, klonen Sie dann das Amplikon in den Gateway-Eintragsvektor pQBV3 mit dem ligationsfreien Klonen-Kit(Materialtabelle) und anschließend in den Zielexpressionsvektor pEG100 mit der LR-Rekombinationsreaktion19.</li>
	<li>Transformieren Sie 3-5 l LR-Reaktionsgemisch in 100 l kompetente E. coli-Zellen (z.B. TOP10, DH5), verbreiten Sie die transformierten Bakterienzellen auf dem Agarmedium Luria-Bertani (LB), ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin, und inkubieren Sie bei 37 °C für 16 -20 h. HINWEIS: Positive Transformationsmittel können durch Kolonie PCR20 identifiziert und durch Plasmid-Miniprep und Sequenzierung weiter analysiert werden.</li>
	<li>50 bis 100 ng rekombinante Plasmide, die Effektorprotein etatmitteltragen, in 100 l chemisch kompetente A. tumefaciens-Zellen (z. B. GV3101 oder C58C1) einführen, sanft mischen und dann 1 min in flüssigem Stickstoff einfrieren. Die Zellen in einem 37 °C-Wasserbad 5 min auftauen.</li>
	<li>Fügen Sie 500 l LB-Brühe hinzu und brüten bei 30 °C für 4 x 6 h mit sanftem Schütteln, und übertragen und verteilen Sie dann alle Agrobakterienzellen auf LB-Agar-Medium, ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin und 50 g/ml Rifampicin bei 30 °C für 2 Tage. HINWEIS: Positive Klone können durch Kolonie PCR überprüft werden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine einzige transformierte Kolonie für Agro-Infiltrationsexperimente, sofern nicht anders bestimmt. HINWEIS: In der vorliegenden Forschung enthielt keines der getesteten Effektorgene vorhergesagte Introns; jedes der Gene wurde direkt aus der genomischen DNA eines Phytophthora-Soja-Isolats verstärkt. Es wird ein Gateway-Pflanzenausdrucksvektor ohne Tag empfohlen, ist jedoch nicht erforderlich.</li>
</ol>2. Herstellung von N. benthamiana 16c Pflanzen
<ol><li>Bereiten Sie Topfbodenmischungen vor, die aus (Volumen) 50% Torfmoos, 30% Perlit und 20% Vermiculit und Autoklaven bei 120 °C für 20 min bestehen.</li>
	<li>Autoklaven-Bodenmischungen mit Pflanzendüngerlösung (1 g/L) einweichen und in kleinere Töpfe (80 mm x 80 mm x 75 mm) in einem größeren Fach (540 mm x 285 mm x 60 mm) unterpacken.</li>
	<li>Säen Sie ein oder zwei Samen von N. benthamiana 16c auf die Bodenoberfläche jedes Topfes. Bedecken Sie das Tablett mit einer Kunststoffkuppel und lassen Sie Samen keimen.</li>
	<li>Legen Sie das Tablett unter licht- und temperaturgeregelte Wachstumskammern mit einer Temperatur von 23 bis 25 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 bis 60 % und einer langen Photoperiode (14 h hell/10 h dunkel, mit einer Beleuchtung bei 130 x 150,2s-1).</li>
	<li>Nehmen Sie die Kunststoffkuppel ab, nachdem die Samen keimen (3-4 Tage) und lassen Sie die Sämlinge unter den gleichen Bedingungen wachsen, die für den Keimschritt verwendet werden.</li>
	<li>Fügen Sie eine angemessene Menge an Wasser, halten Boden feucht, aber nicht einweichen, alle 2 bis 3 Tage; Dünger alle 10 Tage hinzufügen, um weiteres Wachstum zu fördern. Halten Sie N. benthamiana 16c Pflanzen unter normalen Bedingungen, bis sie gebrauchsfertig sind; in diesem Stadium sollte die Pflanze mindestens fünf voll entwickelte echte Blätter und keine sichtbaren Achsel- oder Blütenknospen haben, und die Blätter sollten ein gesundes grünes Aussehen haben).</li>
	<li>Verwenden Sie 3-4 Wochen alte Blätter von N. benthamiana 16c für lokale RNA-Silencing-Assays und junge N. benthamiana 16c-Pflanzen (10-14 Tage alt) für systemische RNA-Silencing-Assays. ANMERKUNG: Die Bedingungen und Anlagen für den Pflanzenwachstum sind von Labor zu Laboratorien unterschiedlich; sich für gesunde, gut entwickelte und vollständig erweiterte Blätter zur Infiltration zu entscheiden.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Agrobacterium-Kultur zur Infiltration
<ol><li>Wählen Sie eine positive Kolonie aus der LB-Platte und impfen Sie die Zellen in ein Glasrohr, das 5 ml LB-Medium enthält, das mit 50 g/ml Kanamycin und 50 g/ml Rifampicin ergänzt wird. Wachsen Sie die Zellen bei 30 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute für 24 bis 48 h.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 l Kultur in 5 ml LB-Medium, ergänzt mit gleichen Antibiotika, 10 mM 2-(N-Morpholino)-Ethanulfonsäure (MES; pH 5,6) und 20 m Acetosyringon (AS). Wachsen Sie Bakterien bei 30 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen von 16 bis 20 h.</li>
	<li>Zentrifugenzellen bei 4.000 x g für 10 min. Gießen Sie den Überstand ab und setzen Sie das Pellet in 2 ml 10 mM MgCl2 Puffer wieder auf.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.3, um die vollständige Entfernung von Antibiotika zu gewährleisten.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Dichte der Agrobacterium-Kultur, indem Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) messen. Stellen Sie sich auf einen OD600 von 1,5 x 2,0 mit 10 mM MgCl2 Puffer ein.</li>
	<li>Fügen Sie 10 mM MES (pH 5,6) und 150 M AS zu den endgültigen Suspensionskulturen hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei RT für mindestens 3 h ohne Schütteln. HINWEIS: Lassen Sie die endgültigen Suspensionskulturen nicht über Nacht.</li>
</ol>4. Mitinfiltration N. benthamiana Blätter
<ol><li>Mischen Sie gleiche Volumina einer Agrobacterium-Kultur, die 35S-GFP enthält, mit einer Agrobacterium-Kultur, die 35S-Gurken-Mosaikvirus-Suppressor 2b (CMV2b), vermeintlichen Effektor oder leeren Vektor (EV) enthält.</li>
	<li>Die gemischten Agrobacteriumsuspensionen an den abaxialen Seiten von N. benthamiana 16c Blättern mit einer 1 ml nadellosen Spritze vorsichtig und langsam infiltrieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die verbleibende bakterielle Suspension von den Blättern mit Weichteilwischer und kreisen Sie die Ränder der infiltrierten Pflaster mit einem Maker-Stift.</li>
	<li>Lassen Sie die infiltrierten Pflanzen in der Wachstumskammer unter den gleichen Wachstumsbedingungen. HINWEIS: Aus Sicherheits- und Gesundheitsgründen sollten Schutzbrillen und eine Maske während der Infiltration getragen werden. Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, sollten Handschuhe zwischen den Infiltrationen mit Ethanol gewechselt oder sterilisiert werden. Normalerweise werden für die Infiltration mindestens 1 ml Agrobacteriumsuspensionen pro Blatt benötigt. Für die systemische Silencing, mindestens zwei Blätter werden für die Infiltration erforderlich sein.</li>
</ol>5. GFP-Bildgebungsanalyse
<ol><li>Visuell detektieren GFP Fluoreszenz in neu gewachsenen Blättern von ganzen Pflanzen 2 Wochen nach der Infiltration (für systemische RNA-Silencing) oder infiltrierte Flecken von Blättern 3-4 dpi mit einer langwelligen ultravioletten (UV) Lampe ohne Blättersammlung.</li>
	<li>Fotografieren Sie gesammelte Pflanzen und/oder freistehende Blätter mit einer Digitalkamera, die sowohl mit UV- als auch mit gelben Filtern ausgestattet ist. HINWEIS: Für Tests der lokalen Silencing-Unterdrückung, untersuchen sie infiltrierte Flecken von N. benthamiana 16c Blättern, während für systemische Silencing-Unterdrückungsaktivität neu gewachsene Blätter untersucht werden. Die Unterdrückungsaktivität der RNA-Silencing kann je nach Effektor variieren. Beobachten Sie daher die Pflaster oder Blätter über ein paar Tage ab 3 dpi. Verwenden Sie CMV2b und EV als positive bzw. negative Steuerelemente.</li>
</ol>6. Nördliche Blot-Analyse des GFP-mRNA-Spiegels in infiltrierten Blättern
<ol><li>Isolierung der gesamten RNA aus Blattgewebe mit dem RNA-Isolationsreagenz (Materialtabelle)<ol>
<li>Sammeln Sie Blattgewebe aus infiltrierten N. benthamiana 16c Pflasterbeizen bei 4-7 dpi, pulverisieren Sie in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver, und übertragen Sie das Pulver in ein steriles 2 ml Rohr.</li>
		<li>Fügen Sie das RNA-Isolationsreagenz (1 ml/100 mg Gewebe) sofort in das beprobte Röhrchen in einer Haube, schütteln Sie kräftig, um zu homogenisieren, und inkubieren Bei RT für 5 min.</li>
		<li>Chloroform (200 l/1 ml RNA-Isolationsreagenz) in jede Röhre in einer Haube geben, 15 s kräftig schütteln und bei RT 5 min inkubieren. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.</li>
		<li>Übertragen Sie den Überstand in ein neues RNase-freies Rohr und entsorgen Sie das Pellet. 0,7 Volumen Isopropanol in den Überstand geben, mehrmals sanft invertieren und die Mischung bei RT 10 min inkubieren.</li>
		<li>Das RNA-Pellet durch Zentrifugation bei 12.000 x g 15 min bei 4 °C ausfälten.</li>
		<li>Den Überstand entsorgen, das Pellet mit 70% Ethanol waschen und das Pellet in einer Haube lufttrocknen. Lösen Sie die RNA in diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser auf, indem Sie sie in einem 65 °C-Wasserbad für 10 bis 20 min inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nördliche Blot-Analyse des GFP-mRNA-Spiegels in den infiltrierten Blättern<ol>
<li>Bereiten Sie ein 1,2% Formaldehyd-denaturierendes Agarose-Gel in 1x MOPS Laufpuffer vor.</li>
		<li>RNA 1:1 mit RNA-Ladefarbstoff mischen und durch Inkubation bei 65 °C 10 min denaturieren, die denaturierten Proben sofort 1 min auf Eis abkühlen.</li>
		<li>Die Proben auf das Gel und Elektrophorese bei 100 V 50 min laden, bis die RNA gut getrennt ist.</li>
		<li>Spülen Sie das Gel in 20x Saline-Natriumcitrat-Puffer (SSC), um Formaldehyd zu entfernen und das Gel über Nacht in 20x SSC-Puffer auf die Nylonmembran zu übertragen. Die Membran in 2x SSC einweichen und die RNA an der Membran fixieren, indem Sie die nasse Membran UV-Kreuzverknüpfungen aussetzen.</li>
		<li>Fügen Sie die entsprechende Menge an Hybridisierungspuffer (10 ml pro 100 cm2 Membran; Materialtabelle) in einem Hybridisierungsrohr und bei 60 °C im Hybridisierungsofen aufregnen.</li>
		<li>Die Membran in das Hybridisierungsrohr geben und 60 min bei 60 °C inkubieren. Verdünnen Sie eine 5'DIG-markierte DNA-Sonde (Endkonzentration, 50 ng/ml) in die Hybridisierungslösung, die einen vorgewärmten Hybridisierungspuffer enthält.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Prehybridisierungspuffer und ersetzen Sie ihn sofort durch eine vorgewärmte Hybridisierungslösung, die die DIG-markierte Sonde enthält. Inkubieren Sie den Blot mit Sonde bei 60 °C über Nacht, mit sanfter Rührung.</li>
		<li>Waschen Sie die Membran nach der Hybridisierung zweimal in Puffern mit erhöhter Stringenz bei 60 °C für jeweils 20 min. Wischen Sie die Membran vorsichtig ab, um zusätzlichen Waschpuffer zu entfernen und Reagenzien hinzuzufügen, wie im chemilumineszierenden Hybridisierungs- und Detektionskit (Tabelle der Materialien) vorgeschlagen.</li>
		<li>Erkennen Sie hybridisierte Signale durch chemilumineszierende Reaktion in Kombination mit dem Bildgebungssystem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SignalP+4.0%3A+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li>
<li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

RNA-Silencing ist ein wichtiger Abwehrmechanismus, der von Pflanzen eingesetzt wird, um virale, bakterielle, Oomycete- und Pilzkrankheitserreger zu bekämpfen. Im Gegenzug haben diese Mikroben Silencing-Suppressor-Proteine entwickelt, um antiviralen Silencing entgegenzuwirken, und diese RSS stören verschiedene Schritte des RNA-Silencing-Signalwegs22,23. Zur Identifizierung von RSSs10wurden mehrere Screening-Assays entwickelt.
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In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Beschleunigung der Genomsequenzierung von Mikroorganismen, die Pflanzenkrankheiten verursachen, zu einer immer größeren Wissenslücke zwischen Sequenzinformationen und den biologischen Funktionen kodierter Proteinegeführt 1. Unter den Molekülen, die durch Sequenzierungsprojekte enthüllt werden, sind Effektormoleküle, die angeborene Immunität unterdrücken und die Wirtskolonisierung erleichtern; diese Faktoren werden durch zerstörerische Pflanzenpathogene, einschließlich Bakterien, Nematoden und fadenförmige Mikroben, abgesondert. Um auf diese Bedrohungen zu reagieren, haben Wirtspflanzen neuartige Rezeptoren entwickelt, die diese Effektoren erkennen und die Wiederherstellung der Immunantwort ermöglichen. Daher unterliegen Effektoren verschiedenen selektiven Drücken, was zu einer Diversifizierung des Effektorrepertoires zwischen pathogenen Linien2führt. In den letzten Jahren haben vermeintliche Effektoren von Pflanzenpathogenen gezeigt, dass sie die angeborene Pflanzenimmunität stören, indem sie die zellulären Wirtsprozesse behindern, um den Mikroben auf verschiedene Weise zu nützen, einschließlich Dysregulation von Signalwegen, Transkription, intrazellulärer Transport, Zytoskelettstabilität, Vesikelhandel und RNA-Silencing3,4,5. Die überwiegende Mehrheit der Pathogen-Effektoren, insbesondere solche von fadenförmigen Krankheitserregern, sind jedoch rätselhaft geblieben.
RNA-Silencing ist eine homologievermittelte Geninaktivierungsmaschinerie, die unter Eukaryoten konserviert wird. Der Prozess wird durch lange doppelsträngige RNA (dsRNA) ausgelöst und zielt sequenzspezifisch auf die homologe einsträngige RNA (ssRNA) ab und manipuliert eine Vielzahl biologischer Prozesse, einschließlich antiviraler Abwehr6. Um angeborene Immunantworten des Wirts zu überwinden, haben sich einige Viren entwickelt, um das RNA-Silencing auszugleichen, einschließlich der Fähigkeit, sich innerhalb intrazellulärer Kompartimente zu replizieren oder dem reorganisierten Signal des Stummschaltungs zu entkommen. Die allgemeinste Strategie, mit der Viren ihre Genome vor dem RNA-Silencing-abhängigen Verlust der Genfunktion schützen, besteht jedoch darin, bestimmte Proteine zu kodieren, die die RNA-Silencing7,8unterdrücken. Es wurden mehrere mechanistisch unterschiedliche Ansätze zur Abschirmung und Charakterisierung viraler Suppressoren von RNA-Silencing (VSRs) etabliert, einschließlich der Ko-Infiltration von Agrobacterium-Tumefaciens-Kulturen, transgenen Pflanzen, die vermeintliche Unterdrücker ausdrücken, Pfropfen und Zellkultur9,10,11,12,13.
Jeder dieser Assays hat Vor- und Nachteile und identifiziert VSRs auf seine eigene Weise. Einer der häufigsten Ansätze basiert auf der Ko-Infiltration einzelner A. tmuefaciens-Kulturen, die das potentielle virale Protein und ein Reportergen (typisch grünes fluoreszierendes Protein [GFP]) auf den Nicotiana benthamiana 16c-Pflanzen beherbergen, die GFP unter der Kontrolle des Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotors konstitutiv ausdrücken. In Ermangelung eines aktiven viralen Silencing Suppressors wird GFP von den Wirtszellen als exogen identifiziert und innerhalb von 3 Tagen nach der Infiltration (dpi) zum Schweigen gebracht. Im Gegensatz dazu, wenn das virale Protein Unterdrückungsaktivität besitzt, bleibt der Expressionsgrad von GFP stabil über 3-9 dpi9. Dieser Co-Infiltrationstest ist einfach und schnell; es ist jedoch weder sehr stabil noch empfindlich. Nichtsdestotrotz hat der Assay zahlreiche VSRs mit unterschiedlichen Proteinsequenzen und Strukturen in vielen RNA-Virenidentifiziert 7,8.
Kürzlich wurden mehrere Effektorproteine, die die zelluläre RNA-Silencing-Aktivität hemmen können, durch bakterielle, Oomycete und Pilzpflanzenpathogene14,15,16charakterisiert. Diese Ergebnisse implizieren, dass RNA-Silencing-Unterdrückung eine gemeinsame Strategie zur Erleichterung der Infektion ist, die von Krankheitserregern in den meisten Königreichen verwendet wird. Theoretisch könnten viele, wenn nicht alle Der Effektoren RNA-Silencing Suppressoren (RSS) kodieren; Bisher wurden jedoch nur wenige identifiziert, was vor allem auf den Mangel an zuverlässiger und allgemeiner Screening-Strategie zurückzuführen ist. Darüber hinaus wurden die Unterdrücker von RNA-Silencing bei der überwiegenden Mehrheit der Pflanzenpathogene17nicht untersucht.
In diesem Bericht stellen wir ein optimiertes und allgemeines Protokoll zur Identifizierung von Pflanzenpathogeneffektoren vor, die lokale und systemische RNA-Silencing mittels agroinfiltrations-Assay unterdrücken können. Das oberste Ziel dieser Studie war es, die wichtigsten Aspekte des Protokolls hervorzuheben und die Schritte detailliert zu beschreiben, wodurch ein Screening-Test durchgeführt wird, der für fast alle Effektoren von Pflanzenpathogenen geeignet ist.

<table><tbody><tr><td>2-Morpholinethansulfonsäure (MES)</td><td>Biofroxx</td><td>1086GR500</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>2xTaq Master Mix</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P112-AA</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3-(N-Morpholino) Propansulfonsäure (MOPS)</td><td>Amresco</td><td>0264C507-1KG</td><td>MOPS Puffer</td></tr><tr><td>Acetosyringon (AS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Induktion von Agrobacterium-Agar</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td>LB medium</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biofroxx</td><td>1110GR100</td><td>Elektrophorese</td></tr><tr><td>Amersham Hybond -N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303 B</td><td>Nothern Blot</td></tr><tr><td>Amersham Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>Amersham Imager 600</td><td>Image</td></tr><tr><td>Bacto Trypton</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>LB medium</td></tr><tr><td>Bacto Hefe Extraktion</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td>LB Medium</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Nikon</td><td>D5100</td><td>Fotografie</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemilumineszenz-Detektionsmodul Bestandteil der Dafa-Kits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td>Lumineszenzdetektion</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td><td>Vazyme Biotech</td><td>C112-01</td><td>Ligation</td></tr><tr><td>DIG Easy Hyb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11603558001</td><td>Hybridisierungspuffer</td></tr><tr><td>Easypure Plasmid Miniprep Kit TransGen</td><td>Biotech</td><td>EM101-02</td><td>Plasmid-Extraktion</td></tr><tr><td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td><td>TransGen Biotech</td><td>EG101-02</td><td>Gel-Extraktion</td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat</td><td>Amresco/VWR</td><td>0105-1KG</td><td>MOPS</td></tr><tr><td>Pufferelektrophorese Netzteil</td><td>LiuYi</td><td>DYY6D</td><td>Nukleinsäureelektrophorese.</td></tr><tr><td>FastDigest EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0304</td><td>Vektoraufschluss</td></tr><tr><td>Gel Image System</td><td>Tanon</td><td>Tanon3500</td><td>Image</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Amresco</td><td>0304-5G</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1914</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>LR Clonase II Enzym</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>LR Reaktion</td></tr><tr><td>Nitrozellulose-Blotting-Membran 0,45 μm</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td>10600002</td><td>Northern</td></tr><tr><td>NORTH2south Biotin Random Prime DNA-Markierungskit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075</td><td>Biotin-Markierung</td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Torfmoos</td><td>PINDSTRUP</td><td>Dunkles Gold + Ton</td><td>Pflanzen</td></tr><tr><td>Peters Wasserlöslicher Dünger</td><td>ICE</td><td>Peter Professioneller 20-20-20</td><td>Dünger</td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P505-d1</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>MP Biomedizinische</td><td>219549005</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Farbstoff (2X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>RNA Gel Loading Farbstoff</td></tr><tr><td>Natriumacetat Hydrat</td><td>Amresco/VWR</td><td>0530-1KG</td><td>MOPS Puffer</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Amresco</td><td>0241-10KG</td><td>LB Medium</td></tr><tr><td>Tri-Natriumcitrat</td><td>Amresco</td><td>0101-1KG</td><td>SSC Puffer</td></tr><tr><td>Trizol Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>RNA Isolierung Reagenz</td></tr><tr><td>UV-Lampe</td><td>Analytik</td><td>Jena UVP B-100AP</td><td>Beobachtung</td></tr><tr><td>UVP Hybrilinker Ofen</td><td>Analytik Jena</td><td>OV2000</td><td>Nord</td></tr></tbody></table>

screening und identifizierung von rna-silencing suppressoren von sezernierten effektoren von pflanzenpathogenen

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

RNA-Silencing ist ein evolutionär konservierter, sequenzspezifischer Genregulationsmechanismus in Eukaryoten. Mehrere Pflanzenpathogene haben Proteine entwickelt, die die Fähigkeit hemmen können, den RNA-Silencing-Signalweg der Wirtspflanze zu hemmen. Im Gegensatz zu Viruseffektorproteinen haben nur mehrere abgesonderte Effektorproteine die Fähigkeit gezeigt, DAS RNA-Silencing bei bakteriellen, Oomyceten- und Pilzpathogenen zu unterdrücken, und die molekularen Funktionen der meisten Effektoren bleiben weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir detailliert eine leicht modifizierte Version des Co-Infiltrations-Assays, die als allgemeine Methode zur Beobachtung des RNA-Silencings und zur Charakterisierung von Effektorproteinen dienen könnte, die durch Pflanzenpathogene abgesondert werden. Die wichtigsten Schritte des Ansatzes sind die Wahl der gesunden und voll entwickelten Blätter, die Anpassung der Bakterienkultur an die entsprechende optische Dichte (OD) bei 600 nm und die Beobachtung der Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP) zur optimalen Zeit auf der infiltrierten um das Auslassen von Effektoren mit schwacher Unterdrückungsaktivität zu vermeiden. Dieses verbesserte Protokoll wird zu einem schnellen, genauen und umfassenden Screening von RNA-Silencing-Suppressoren beitragen und als hervorragender Ausgangspunkt für die Untersuchung der molekularen Funktionen dieser Proteine dienen.

Oben beschreiben wir das Schritt-für-Schritt-Verfahren für einen verbesserten Screening-Assay zur Beurteilung der RSS-Aktivität von P. sojae RxLR-Effektoren. Insgesamt dauert das Experiment 5 bis 6 Wochen. Anschließend können die durch den Assay identifizierten RSS weiter in Funktion und molekularem Mechanismus charakterisiert werden. Als Beispiel für unseren Ansatz verwendeten wir den P. sojae RxLR effecto Phytophthora Suppressor der RNA-Silencing 1 (PSR1), der während ...

Hier stellen wir ein modifiziertes Screening-Verfahren vor, das ausgiebig eingesetzt werden kann, um RNA-Silencing-Suppressoren bei Pflanzenpathogenen schnell zu überprüfen.

Screening und Identifizierung von RNA-Silencing Suppressoren von sezernierten Effektoren von Pflanzenpathogenen

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wie man die RNA-Silencing-Suppressoren, die von Pflanzenpathogenen sezerniert werden, abschirmt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, einen schnellen, genauen und umfangreichen Screening-Test zur Identifizierung von RNA-Silencing-Suppressoren bereitzustellen. Bereiten Sie Topfbodenmischungen vor, die aus 50% Torfmoos, 30% Perlit und 20% Vermiculit und Autoklaven bei 120 Grad Celsius für 20 Minuten bestehen.Die autoklavierten Bodenmischungen mit Pflanzendüngerlösung mit einem Gramm pro Liter einweichen und in kleinere Töpfe, die in einem größeren Tablett gelagert sind, unterpacken. Säen Sie ein oder zwei Samen von Nicotiana bethamiana 16c auf die Bodenoberfläche jedes Topfes. Bedecken Sie das Tablett mit einer Kunststoffkuppel und lassen Sie die Samen keimen.Platzieren Sie das Tablett unter licht- und temperaturgeregelten Wachstumskammern mit einer Temperatur von 23 bis 25 Grad Celsius, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer langen Tag-Photoperiode. Nach drei bis vier Tagen keimen die Samen. Nehmen Sie die Kunststoffkuppel ab und lassen Sie die Sämlinge unter den gleichen Bedingungen wachsen, die für den Keimschritt verwendet werden.Alle zwei bis drei Tage eine angemessene Menge Wasser hinzufügen, die den Boden feucht, aber nicht einweichen. Alle 10 Tage Dünger hinzufügen, um weiteres Wachstum zu fördern. Bewahren Sie Nicotiana bethamiana 16c Pflanzen unter normalen Bedingungen, bis die Pflanzen mindestens fünf voll entwickelte echte Blätter ohne sichtbare Achsel- oder Blütenknospen haben und die Blätter ein gesundes grünes Aussehen haben.Verwenden Sie 10 bis 14 Tage alte Nicotiana bethamiana 16c Pflanzen für systemische RNA-Silencing-Assays und drei bis vier Wochen alte Blätter von Nicotiana bethamiana 16c für lokale RNA-Silencing-Assays. Verwenden Sie eine Spitze, um eine positive Kolonie aus der LB-Platte zu pflücken und die Zellen in ein Glasrohr mit fünf Millilitern LB-Medium zu impfen, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und 50 Mikrogramm pro Milliliter Rifampicin. Wachsen Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 RPM für 24 bis 48 Stunden.Übertragen Sie 100 Mikroliter der Kultur in fünf Milliliter LB-Medium, ergänzt mit den gleichen Antibiotika, 10 Millimolar MES bei pH 5,6 und 20 Mikromolar AS. Wachsen Sie die Bakterien bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 RPM für 16 bis 20 Stunden. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 4.000 mal g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in zwei Millilitern 10 Millimolar Magnesiumchloridpuffer wieder auf.Wiederholen Sie die Wäsche, um die vollständige Entfernung von Antibiotika zu gewährleisten. Bestimmen Sie die Dichte der Agrobacterium-Kultur, indem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern messen. Stellen Sie die Zellkultur mit 10 Millimolaren Magnesiumchloridpuffer auf eine OD 600 von 1,5 bis 2,0 ein.Fügen Sie 10 Millimolar MES bei pH 5,6 und 150 Mikromolar AS in die endgültige Suspensionskultur ein und inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für mindestens drei Stunden ohne Schütteln. Mischen Sie gleiche Volumina einer Agrobacterium-Kultur, die 35S grünes fluoreszierendes Protein enthält, mit einer Agrobacterium-Kultur, die 35S Gurkenmosaikvirus-Suppressor 2b, vermeintlichen Effektor oder leeren Vektor enthält. Mit einer ein Milliliter nadellosen Spritze die gemischten Agrobacterium Suspensionen an den abaxialen Seiten der Nicotiana bethamiana 16c Blätter vorsichtig und langsam infiltrieren.Entfernen Sie die verbleibende bakterielle Suspension von den Blättern mit Weichteiltüchern und kreisen Sie die Ränder der infiltrierten Pflaster mit einem Markerstift. Drei bis vier Tage nach der Infiltration, verwenden Sie eine langwellige ULTRAviolette Lampe, um die GFP-Fluoreszenz in den infiltrierten Blättern visuell zu erkennen. Zwei Wochen nach der Infiltration, verwenden Sie die Lampe, um neu gewachsene Blätter der gesamten Pflanze für systemische RNA-Silencing zu erkennen.Um die gesamte RNA nach der Infiltration vier bis sieben Tage lang aus dem Blattgewebe zu isolieren, sammeln Sie das Blattgewebe aus den infiltrierten Nicotiana bethamiana 16c-Pflastern in einen Mörtel. Flüssigstickstoff in den Mörtel geben und das Gewebe mit einer Schleifstange in ein feines Pulver schleifen und in ein steriles Zwei-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie das RNA-Isolationsreagenz mit einem Volumen von einem Milliliter pro 100 Milligramm Gewebe sofort in das Probenröhrchen in einer Haube ein, wirbeln Sie kräftig, um zu homogenisieren, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten.Chloroform mit einem Volumen von 200 Mikrolitern pro Milliliter RNA-Isolationsreagenz in jedes Rohr in der Haube geben, 15 Sekunden lang kräftig schütteln und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 12.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand in ein neues RNase-freies Rohr und entsorgen Sie das Pellet.0,7 Volumen Isopropanol in den Überstand geben, mehrmals sanft invertieren und die Mischung bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren. Niederschlagen Sie das RNA-Pellet durch Zentrifugation bei 12.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand.Waschen Sie das Pellet mit 70% Ethanol und trocknen Sie das Pellet in einer Haube. Lösen Sie die RNA in mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser auf, indem Sie sie 10 bis 20 Minuten in einem 65 Grad Celsius Wasserbad inkubieren. Um die Northern Blot-Analyse der GFP-Boten-RNA-Spiegel durchzuführen, bereiten Sie ein 1,2%formaldehyd-denaturierendes Agarose-Gel in 1X MOPS Laufpuffer vor.Mischen Sie die RNA eins zu eins mit RNA-Ladefarbstoff und denaturieren Sie die RNA durch Inkubation bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Die denaturierten Proben sofort eine Minute auf Eis abkühlen lassen. Mit einer Pipette die Proben 50 Minuten lang in die Brunnen des Gels und der Elektrophorese laden, bis die RNA gut getrennt ist.Spülen Sie das Gel in 20X Saline-Natriumcitratpuffer, um das Formaldehyd zu entfernen. Führen Sie kapillare Übertragung über Nacht durch Die Einrichtung 20X Kochsamen-Natrium-Citrat-Puffer, eine Schicht Papiertuch, zwei Schichten nassen Whatman-Papier, eine Schicht Gel, eine Schicht Nylon-Membran, zwei Schichten nassen Whatman-Papier, zwei Schichten trockenes Whatman-Papier, eine Glasplatte und ein Gewicht. Am Morgen wird die RNA im Gel auf die Nylonmembran übertragen.Die Membran in 2X-Saline-Natriumcitrat einweichen und die RNA an der Membran fixieren, indem Sie die nasse Membran UV-Vernetzung aussetzen. Gehen Sie nach dem Manuskript. Voll entwickelte Blätter von drei bis vier Wochen alten Nicotiana bethamiana 16c Pflanzen wurden in Pflastern mit Agrobacterium-Mischungen mit 35S GFP mitinfiltriert.Vier Tage nach der Infiltration wurde die GFP-Fluoreszenz des infiltrierten Bereichs unter natürlichem Licht und langwelligem UV-Licht abgebildet. Northern Blot zeigte, dass GFP-Boten-RNA sich höher in den Blättern angesammelt emittierte, die 35S GFP plus 35S CMV2b oder 35S GFP plus 35S PSR1 ausdrückten, als in den Blättern, die 35S GFP plus EV exdrückten. Agroinfiltrationstest wurde durchgeführt, um die Ausbreitung des Schalldämpfersignals in den Blättern der zwei Wochen alten Nicotiana bethamiana 16c Sämlinge zu bewerten. Nach 14 Tagen nach der Infiltration zeigten mehr als 98% des EV keine offensichtliche GFP-Signalisierung in systemischen Blättern.Während sowohl CMV2b als auch PSR1 die systemische Ausbreitung des Silencing-Signals effizient verhinderten. Die GFP-Fluoreszenz wurde bei etwa 80 % der mitinfiltrierten Pflanzen beobachtet und in den verbleibenden 20 % der infiltrierten Pflanzen mit nur wenigen roten Adern in neu entstehenden Blättern. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, neuartige RNA-Silencing-Suppressoren zu identifizieren, die von vielen Pflanzenpathogenen sezerniert werden.Die Kombination von Pflanzen und der richtigen OD ist das Wichtigste, was man sich beim Versuch dieses Verfahrens merken sollte. Nach diesem Verfahren kann die funktionelle Charakterisierung des RNA-Silencing-Suppressors durchgeführt werden, um den Mechanismus zu untersuchen, wie diese Unterdrücker die Wirts-RNA-Silencing drücken und was der Output ist. Bitte tragen Sie die Schutzbrille, wenn Sie Pflanzen infiltrieren und tragen Sie auch die Latexhandschuhe während aller Experimentierschritte.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Beschreibung eines Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-Methode für knock-down der Genexpression...

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

Quelle: Shi, J. et al. Screening und Identifizierung von RNA-Silencing-Suppressoren aus sekretierten Effektoren pflanzlicher Krankheitserreger. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert einen Co-Infiltrationstest zur Identifizierung von Pathogen-Effektorproteinen, die die RNA-Silencing in Nicotiana benthamiana 16c unterdrücken. Ein fluoreszierender Reporter und ein Kandidat-Effektorgen werden über Agrobacterium in Pflanzenblätter abgegeben. Normalerweise degradiert RNA-Silencing die...

Co-Infiltrationstest zur Untersuchung von Erregereffektoren, die die Abschaltung von Pflanzen-RNA unterdrücken

Virus-induzierte Gen-Silencing ist ein nützliches Instrument zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz von Pflanzen beteiligt. Wir demonstrieren die Verwendung von bakteriellen Erregern exprimieren GFPuv identifizieren Gen stumm Pflanzen anfällig Nichtwirt Krankheitserreger. Dieser Ansatz ist einfach, schnell und erleichtert groß angelegte Screening und ähnliches Protokoll zu studieren verschiedene andere Pflanzen-Mikroben-Interaktionen angewendet werden kann.

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Hier beschreiben wir eine Methode, um eine gezielte siRNA "ubiquitome"-Bildschirm, um neue Ubiquitin und Ubiquitin-ähnliche Regulatoren des HIF1A-vermittelte zelluläre Antwort auf Hypoxie zu identifizieren durchzuführen. Dies kann zu jedem biologischen Weg, wo ein robuster Auslesen der Reporteraktivität ist angepasst werden.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Die Quantifizierung des Erregerwachstums ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung verschiedener Immunantworten von Arabidopsis thaliana (im Folgenden: Arabidopsis). Das hier beschriebene Verfahren stellt einen optimierten Spritzeninfiltrationsassay zur Quantifizierung der Pseudomonas syringae pv dar. Maculicola ES4326-Wachstum in adulten Arabidopsis-Blättern.

Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

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Eine Bioinformatik-Pipeline zur genauen und effizienten Analyse der MicroRNA-Transkriptome in Pflanzen

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