Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg

Die Untersuchung des Transports von Bakterien in porösen Systemen ist im Hinblick auf Kontamination, Ausbreitung von Krankheiten und Biosanierung wichtig. Für diese Experimente in mathematischen Modellen, die an der Einzelzelle arbeiten, sind die Population und die mikrobielle Gemeinschaftsebene erforderlich. Hier stellen wir Werkzeuge zur Untersuchung des bakteriellen Transports mit mikrofluidischen Geräten und Mikroskopie sowie größerer Geräte in Kombination mit Durchflusszytometrie vor.

Die Kombination von mikrofluidischen Geräten mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie bietet eine Reihe von Möglichkeiten, bakterielle Transportphänomene in verschiedenen räumlichen Maßstäben zu untersuchen. Um dieses Protokoll vollständig zu erkunden, wird empfohlen, bereits Erfahrungen in der Mikroskopie, der grundlegenden Bildverarbeitung, dem Entwerfen mikrofluidischer Geräte und der Mastering-Flow-Zytometrie zu haben. Dieses Video beschreibt zwei Methoden, um den bakteriellen Transport in verschiedenen räumlichen Maßstäben zu untersuchen.

Die erste Methode, die auf mikrofluidischen Geräten basiert, beruht auf der Mikroskopie, um einzelne Zellen zu zählen. Dieses System kann verwendet werden, um den bakteriellen Transport über mehrere räumliche Skalen von der Pore bis zur gesamten porösen Systemskala zu untersuchen. Die zweite Methode, mit größeren Fluidien, die an einen automatisierten Spender gekoppelt sind, und durchFlusszytometrie, kann verwendet werden, um bakterielle Transportphänomene in der Größenordnung ganzer poröser Systeme zu untersuchen.

Solche Methoden können auch in Kolonstudien im Labormaßstab sowie in Kleinfelduntersuchungen eingesetzt werden. Entwerfen Sie zunächst die gewünschte poröse Geometrie, die aus einer Matrix von Kreisen besteht. Basierend auf der gewählten Geometrie, bereiten Sie eine Form mit Standard SU-8 Photolithographie.

Bereiten Sie 50 Gramm PDMS vor, indem Sie 90 % Elastomer zu 10 % des Härtungsmittels zu 90 % des Elastomers in einem sauberen Einwegbehälter hinzufügen und die beiden Reagenzien mit einem sauberen Werkzeug vermischen. Tragen Sie ein Vakuum von 100 Millibar für 30 Minuten auf, um gelöste Luft und Blasen zu entfernen. Legen Sie die Form in eine Petrischale und gießen Sie das PDMS auf die gewünschte Höhe zwischen zwei und fünf Millimetern.

Bedecken Sie die Petrischale mit einem Deckel und halten Sie sie mindestens vier Stunden bei 60 Grad Celsius. Danach lassen Sie das mikrofluidische Gerät auf Raumtemperatur abkühlen. Sobald es abgekühlt ist, entfernen Sie vorsichtig den gewünschten Teil von PDMS mit einem Skalpell.

Versiegeln Sie vorübergehend den Boden des PDMS-Kanals mit Klebeband. Mit einem Stanzer mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern können Sie Kanäle durchbohren, um einen Einlass und einen Auslass zu erzeugen. Entfernen Sie das Band aus dem PDMS-Kanal und platzieren Sie den Kanal mit der porösen Seite nach oben.

Behandeln Sie die Glasrutsche und PDMS-Oberflächen mit Plasma für jeweils ca. 45 Sekunden bei Raumtemperatur. Legen Sie den vorbehandelten PDMS-Kanal auf den vorbehandelten Glasschlitten und erhitzen Sie 30 Minuten lang bei 100 Grad Celsius auf einer Kochplatte, entfernen Sie dann das mikrofluidische Gerät von der Kochplatte und kühlen Sie es auf Raumtemperatur. Vakuum für 30 Minuten auftragen, um Luft von PDMS zu entfernen.

Um die Basis zu erzeugen, die das Porenfach enthält, verwenden Sie hochpräzise Smicrofräsen, um 0,5 Millimeter von der Basis-PMMA-Schicht zu entfernen und eine Nut in der Größe von 1,1 mal 1,1 Millimetern für einen Gummi-O-Ring zu fräsen. Bohren Sie zwei Gewindebohrungen für einen Ein- und Auslass in den oberen Teil der Fluidvorrichtung und 12 Löcher für Schrauben. Dies dient als Deckel des Fluidgeräts.

Nach der Reinigung des Fluidgeräts die Basis und den Deckel mit den 12 Gewindelöchern zusammenschrauben. Entfernen Sie das Mikrofluidaus vakuumfern und stellen Sie es auf die Mikroskopstufe. Verwenden Sie die Spritzenpumpe, um sie mit Motilitätspuffer zu sättigen.

Passen Sie mit Brightfield-Mikroskopie oder Phasenkontrast die Vergrößerung an, um einzelne Bakterienzellen zu visualisieren und sich auf die Mitte des Beobachtungskanals zu konzentrieren. Schalten Sie die Lichtpfadeinstellungen auf Fluoreszenzmikroskopie um. Passen Sie den Fokus durch einen Offset und die Belichtungszeit der Kamera an, um einzelne Bakterienzellen aufzulösen.

In diesem Fall 100 Millisekunden. Als nächstes legen Sie den Einlassschlauch in ein Zwei-Milliliter-Rohr ein, das die bakterielle Suspension enthält. Umkehren Sie die Pumpenrichtung und beginnen Sie mit dem Zurückziehen der Suspension mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Minute.

Scannen Sie den Querschnitt des gesamten Beobachtungskanals und zeichnen Sie jede Minute ein Bild auf. Importieren Sie Bilder auf eine gewünschte Softwareplattform. Zeichnen Sie den Hintergrund als Durchschnitt der ersten Bilder auf, wenn keine Partikel aufgezeichnet wurden.

Subtrahieren Sie den Hintergrund von jedem Bild, um Kamerageräusche und optische Aberrationzuentfernen. Schneiden Sie die Bilder in eine Region von Interesse. Identifizieren Sie einen Schwellenwert, der der Zellfluoreszenzpixelintensität entspricht, sodass Werte, die größer als der Schwellenwert sind, bakterielle Zellen enthalten.

Verwenden Sie die Bildverarbeitung, um den Schwellenwert von jedem Bild zu subtrahieren. Binarisieren Sie das resultierende Bild so, dass Bakterienzellen einen Wert von eins annehmen, während der Hintergrund den Wert Null annimmt. Entfernen Sie Pixelcluster mit einer Fläche, die kleiner als die kleinste bakterielle Zellengröße in Pixeln ist.

Summieren Sie das binarisierte Bild, um die Gesamtzahl der Pixel der verbleibenden Cluster abzuerhalten. Teilen Sie die Anzahl der Pixel durch die durchschnittliche Größe einer Bakterienzelle in Pixel, um eine Schätzung der Anzahl der Zellen zu erhalten. Verwandeln Sie die Zählungen in Partikel pro Milliliter in Konzentration.

Um die Konzentration der injizierten bakteriellen Suspension zu identifizieren, injizieren Sie die bakterielle Suspension mit einer Spritze in den Beobachtungskanal einer sauberen mikrofluidischen Vorrichtung. Zeichnen Sie das Bild auf und berechnen Sie die in fluent bakterielle Konzentration, wie zuvor gezeigt. Visualisieren Sie Durchbruchskurven, indem Sie die bakterielle Konzentration C mit der zufließenden bakteriellen Konzentration C0 normalisieren und C über C0 im Vergleich zur Zeit zeichnen.

Um die lokalen Geschwindigkeiten und Flugbahnen von Bakterien zu analysieren, die durch die poröse Matrix transportiert werden, bewegen Sie die Mikroskopstufe in einen Bereich von Interesse und passen Sie den Fokus an die Mitte des mikrofluidischen Geräts an. Stellen Sie die optische Konfiguration auf Phasenkontrast- oder Fluoreszenzmikroskopie ein. Zeichnen Sie Zeitrafferbilder und eine Belichtungszeit auf, die kurz genug ist, um bakterielle Verschiebungen zu erfassen.

In diesem Fall 50 Millisekunden. Zeichnen Sie Bilder über einen ausreichenden Zeitraum auf, z. B. drei Minuten. Um Rauschen von jedem Bild zu entfernen, subtrahieren Sie den Hintergrund, der der Durchschnitt der Summe aller aufgezeichneten Bilder ist.

Bestimmen Sie den Modul des numerischen Farbverlaufs und normalisieren Sie ihn anhand seines Maximalwerts. Suchen und aufzeichnen Sie bakterielle Koordinaten und den Zeitpunkt der Bildaufnahme in einer dreispaltigen Datei. Führen Sie partikelverfolgungsanalysen durch, um die aufgezeichneten Daten zu verarbeiten und die Flugbahnen zu berechnen.

Um Ablagerungsprofile zu erhalten, zeichnen Sie ein zusammengesetztes Bild des gesamten porösen Kanals vor, d. h. den Hintergrund, und nach der Injektion der bakteriellen Suspension durch das mikrofluidische Gerät auf. Entfernen Sie den Hintergrund aus den Bildern, die nach der bakteriellen Injektion aufgenommen wurden. Berechnen Sie das Abscheidungsprofil D als Summe des bakteriellen Fluoreszenzsignals entlang transversaler Abschnitte der Länge x des porösen Kanals.

Visualisieren Sie das Abscheidungsprofil als lokales Fluoreszenzsignal im Vergleich zur porösen Kanallänge. Um den automatisierten Spender einzurichten, stellen Sie den Roboterspender in der Nähe des Fluidgeräts auf. Schließen Sie den Roboterspender an den Computer mit BCNC an, und identifizieren Sie den richtigen Com-Port.

Klicken Sie in BCNC auf die Home-Taste, um den Roboterspender in die Home-Position zurückzubekommen. Verbinden Sie die Peristaltikpumpe mit dem Einlass mit 50 Zentimeter langen Schläuchen mit einem Millimeter Innendurchmesser und den Abfluss mit dem automatisierten Spender mit dem gleichen Schlauch. Pumpenanbaumedium durch das Fluidgerät.

Beachten Sie die Ankunft des Mediums an den am Roboterspender befestigten Auslassschläuchen und legen Sie eine 96-Well-Platte, die den Abfluss sammelt. Gleichzeitig aktivieren Sie den Roboterspender und injizieren Sie die bakterielle Suspension durch das PMMA Fluidgerät mit einer Durchflussrate von 0,2 Milliliter pro Minute. Injektion bakterielle Suspension entsprechend mehreren Porenvolumen.

Zum Beispiel das 30-fache des Volumens des Fluidgeräts. Wechseln Sie nach der Injektion auf steriles Anbaumedium bis zum Ende des Experiments. Sobald eine 96-Well-Platte fertig ist, bedecken Sie die Platte und lagern Sie bei vier Grad Celsius bis zur Strömungszytometrie-Analyse.

Analysieren Sie Proben mit Durchflusszytometrie und visualisieren Sie Durchbruchkurven, indem Sie die bakterielle Konzentration C mit der influenten bakteriellen Konzentration C0 normalisieren und C über C0 im Vergleich zur Zeit zeichnen. In dieser Studie wurden sowohl mit motilen als auch mit nicht-motilen Pseudomonas putida KT2440 sequentielle Experimente an mikrofluidischen PDMS-Geräten mit einer zufälligen Reihe von Säulen durchgeführt. Hier werden Durchbruchkurven, die auf die Konzentration der injizierten Zellen normalisiert wurden, sowie bakterielle Bahnen im Porenmaßstab gezeigt.

Experimente mit großflächigen Fluidgeräten, die aus PMMA gefräst wurden, wurden ebenfalls durchgeführt. Motile und nicht-motile Pseudomonas putida KT2440 wurden in eine regelmäßig verteilte poröse Matrix injiziert. Auffallend ist, dass in einer porösen Umgebung ohne Biofilm motile und nicht-motile Pseudomonas putida KT2440 ein deutlich anderes Transportverhalten auf der Grundlage von Durchbruchkurven zeigte.

In einer porösen Matrix, die 48 Stunden lang mit einer komplexen Flussbiofilmgemeinschaft kolonisiert wurde, verschwanden diese Unterschiede in den Durchbruchskurven zwischen motiler und nicht-motiler Pseudomonas putida KT2440. Wir verwenden dieses System, um bakterielle Transport in den Strömen zu untersuchen, aber diese Werkzeuge können leicht angepasst werden, um bakterielle Transportphänomene in anderen technischen und Umweltsystemen zu studieren. Bakterielle Transport durch hydratisierte poröse Medien verkapseln Prozesse über mehrere räumliche Skalen.

Die hier vorgestellte Methodik ermöglicht es, die lokale Verdrängung von Bakterien auf der Porenskala mit dem mikroskopischen Transport am gesamten porösen Medium zu verknüpfen.