Name: Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Untersuchung des bakteriellen Transports in porösen Medien mit Mikrofluidik, Mikroskopie und Durchflusszytometrie. Diese Techniken ermöglichen die Analyse von Transportphänomenen über verschiedene räumliche Skalen hinweg.

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Wir würdigen die Hilfe von Antoine Wiedmer beim Aufbau des Roboterspenders und der dispenser.py Skript.

1. Bakterielle Kulturbedingungen
<ol><li>Verwenden Sie unter einer laminaren Durchflusshaube 100 l eines Glyzerinbestands von Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 ml-1, bei -80 °C gelagert), um 5 ml Luria-Bertani (LB) Medium zu impfen. Bei 30 °C inkubieren und über Nacht bei 250 Umdrehungen schütteln.</li>
	<li>Am nächsten Tag 100 l der Übernachtungskultur in 5 ml LB-Medium wieder aufheben und unter den gleichen Bedingungen für 5h (exponentielle Phase) inkubieren. Ein 1 ml Aliquot in ein 2 ml Rohr eintauchen, auf Raumtemperatur abkühlen lassen (ca. 15 min) und Zentrifuge (2300 x g für 5 min).</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie dem Pellet 1 ml Motilitätspuffer hinzu. Wirbel kurz, um die Probe zu homogenisieren. Verdünnen, um die gewünschte Zellkonzentration zu erreichen, z.B. 5 x 105 ml-1.</li>
	<li>Für Experimente mit natürlichen Gemeinschaften, wie sie aus Bächen gewonnen werden, wird ein nicht selektives Anbaumedium vorbereitet. Verwenden Sie beispielsweise sterilgefiltertes und autoklaviertes Bachwasser oder ein künstliches Strömungswassermedium, das mit einer komplexen Kohlenstoffquelle (LB-Medium) geändert wurde.</li>
</ol>2. Herstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung in Polydimethylsiloxan (PDMS)
<ol><li>Entwerfen Sie die gewünschte poröse Geometrie mittels computergestützter Entwurfssoftware(CAD) 18, die aus einer Matrix von Kreisen besteht (d. h. dem undurchlässigen Strömungshindernis), beschrieben durch Radiusgröße und Mittelkoordinaten. HINWEIS: Ein Beispiel für eine poröse Geometrie mit randomisierten Korn- und Porengrößen ist in Abbildung 1Adargestellt. Ein Beobachtungskanal ohne Hindernisse in der Nähe des Auslasses erleichtert den Erwerb von BTCs.</li>
	<li>Basierend auf der gewählten Geometrie, bereiten Sie eine Form mit Standard SU-8-Photolithographie18. HINWEIS: Alternativ können Formen auch in einer speziellen Mikrofabrikation bestellt werden. Um einen heterogenen Flüssigkeitsfluss in der horizontalen Ebene zu erhalten, ist es wichtig, die Dicke der mikrofluidischen Kammer in der gleichen Größenordnung wie die durchschnittliche Porenkehlgröße zu entwerfen. Stellen Sie jedoch sicher, dass die Abmessungen des mikrofluidischen Geräts für die Beobachtung unter dem Mikroskop geeignet sind (z. B. Arbeiten an Mikroskopschlitten).</li>
	<li>Bereiten Sie 50 g PDMS vor, indem Sie 10 % des Querverdrahters (Dimethyl, Methylhydrogensiloxan-Copolymer) zu 90 GHT elastomer gewichten, indem Sie eine Spritze ohne Nadel verwenden. Arbeiten Sie unter sauberen Bedingungen und vermeiden Sie Staub so weit wie möglich. Mischen Sie die beiden Reagenzien in einem sauberen Einwegbehälter und tragen Sie Vakuum (100 mbar) für 30 min auf, um gelöste Luft und Blasen aus dem viskosen PDMS zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie die Form in eine Petrischale (100 mm Durchmesser, 15 mm hoch). Gießen Sie das PDMS auf die gewünschte Höhe (z. B. 2-5 mm). Die Petrischale abdecken und bei 60 °C für 4 h (über Nacht für dickere Schichten) zum Aushärten aufbewahren. HINWEIS: Zur Visualisierung sollte Licht in der Lage sein, das PDMS zu passieren, daher ist eine dünne Schicht zwischen 2 mm und 5 mm wünschenswert. Dickere Schichten (&gt;5 mm) reduzieren die Gerätetransparenz und dünnere werden während der Anwendung Verformungen ausgesetzt.</li>
	<li>Entfernen Sie die Form aus dem Ofen und lassen Sie das mikrofluidische Gerät auf Raumtemperatur abkühlen. Sobald es abgekühlt ist, entfernen Sie vorsichtig den gewünschten Teil von PDMS mit einem Skalpell. HINWEIS: Starker Druck auf die Form führt zu Schimmelbrüchen. Berühren Sie das PDMS nicht mit bloßen Händen, da Fingerabdrücke die optische Transparenz beeinträchtigen.</li>
	<li>Versiegeln Sie vorübergehend den Boden des PDMS-Kanals (wo die gewünschte Geometrie eingraviert wurde) mit Klebeband. Mit einem Biopsie-Stanzer mit einem Durchmesser von 0,5 mm durchbohren Sie den mikrofluidischen Kanal, um einen Einlass und einen Auslass zu erzeugen, der die 0,5 mm (Innendurchmesser) Rohre anpasst. HINWEIS: Die weiche Natur von PDMS sorgt für Dichtheit, sobald der Schlauch eingesetzt wird. Ein- und Auslasskanäle können nicht mehr hergestellt werden, nachdem das PDMS an das Glas versiegelt wurde.</li>
	<li>Versiegeln Sie den mikrofluidischen Kanal über Sauerstoffplasmabindung mit dem Hochfrequenzgenerator (Plasmabonder, Materialtabelle). Dazu einen Silikatglasschlitten (25 mm x 75 mm) mit Ethanol reinigen und trocknen lassen. Entfernen Sie das Band aus dem PDMS-Kanal und platzieren Sie den Kanal mit der porösen Seite nach oben. Behandeln Sie die Silikatglasrutsche und PDMS-Oberflächen mit Plasma für ca. 45 s bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Den PDMS-Kanal auf den Silikatglasschlitten legen und 30 min auf einer Kochplatte bei 100 °C erhitzen.</li>
	<li>Entfernen Sie das mikrofluidische Gerät von der Kochplatte und kühlen Sie es auf Raumtemperatur. Schließen Sie den PDMS-Kanaleinlass mit Schläuchen an. Vakuum für 30 min auftragen, um Luft aus PDMS zu entfernen, die fast undurchlässig für Flüssigkeiten, aber gasdurchlässig ist.</li>
	<li>100 ml Motilitätspuffer (10 mM Kaliumphosphat, 0,1 mM EDTA, ergänzt mit 1% w/v Glukose, pH 7,0) vorbereiten und 1 ml davon mit einer Spritzenpumpe, die bei 10 l min-1betrieben wird, in das mikrofluidische Gerät injizieren. HINWEIS: Da das PDMS mit Gas untergesättigt ist (aufgrund des vorherigen Vakuumschritts), verschwinden Blasen innerhalb von 30 min.</li>
</ol>3. Herstellung einer Fluidvorrichtung in Poly (Methylmethacrylat)
<ol><li>Entwerfen Sie die gewünschte Geometrie mit der CAD-Software. Stellen Sie ggf. sicher, dass die Abmessungen für die Beobachtung unter dem Mikroskop geeignet sind (z. B. Abmessungen einer Standard 96-Wellplatte in Kombination mit einem geeigneten Halter). Die Fluidvorrichtung besteht aus einer Basis (127 × 127 × 12 mm) und einem Deckel (127 × 127 × 12 mm) PMMA. HINWEIS: Expertise mit CAD-Software wird empfohlen. Eine technische Beispielzeichnung ist in Abbildung 1Aenthalten.</li>
	<li>Um das Porenfach mittels hochpräziser Mikrofräsen (WF31SA, Mikron) herzustellen, 0,5 mm von der unteren PMMA-Schicht zu entfernen und eine Nut (1,1 × 1,1 mm) für einen Gummi-O-Ring zu fräsen. Bohren Sie 12 Gewindebohrungen (M5). Dies dient als Basis des Fluidgeräts. HINWEIS: Die Abmessungen des Fluidgeräts müssen an die Mikroskopstufe und den Brennweitenabstand angepasst werden. Eine technische Zeichnung ist in Abbildung S1enthalten.</li>
	<li>Bohren Sie zwei Gewindebohrungen (Typ 1/4-28UNF) für Ein- und Auslass in den oberen Teil der Fluidvorrichtung und 12 Löcher (5,5 mm) für die Schrauben. Dies dient als Deckel des Fluidgeräts. HINWEIS: Expertise im Bereich Mikrofräsen ist ratsam; Die Autoren nutzen die Unterstützung eines spezialisierten Workshops.</li>
	<li>Um das Fluidgerät vor und nach jedem Gebrauch zu reinigen und zu sterilisieren, tränken Sie die Basis und den Deckel des Fluidgeräts in HCl 7% und spülen Sie dreimal mit entionisiertem Wasser ab.</li>
	<li>Schraube Boden und Deckel mit den 12 Gewindelöchern zusammen.</li>
</ol>4. Einrichtung eines automatisierten Spenders
HINWEIS: Kommerziell erhältliche Flüssigkeitsspender sind teuer und bieten oft nicht die Flexibilität, direkt aus dem Abfluss des Fluidgeräts zu verzichten. Daher wird die Montage eines kostengünstigen und flexiblen Roboterspendersystems aus einem XY Plotter Roboter (Materialtabelle) empfohlen.
<ol><li>Um den Abfluss aus der Fluidvorrichtung in 96 Bohrplatten zu verteilen, montieren Sie den Roboterspender auf eine PMMA-Platte und Fräshohlräume von 85,8 x 128 mm mit einer Tiefe von 1 mm, um mehrere 96 Bohrplatten zu halten.</li>
	<li>Befestigen Sie das Abflussrohr des Fluidgeräts am Roboterarm des Spenders.</li>
	<li>Um den Roboterspender zu betreiben, laden Sie bCNC von github herunter: https://github.com/vlachoudis/bCNC und befolgen Sie die Anweisungen, um das Programm zu installieren.</li>
	<li>Laden Sie dispenser.py aus dem Begleitmaterial dieses Artikels herunter. HINWEIS: Dieser Python-Code bietet ein Plugin für bCNC für ein einfaches Roboter-Dispenser-Layout.</li>
	<li>Schließen Sie den Roboterspender an den Computer mit bCNC an, und identifizieren Sie den richtigen COM-Port.</li>
	<li>Klicken Sie in bCNC auf die Home-Taste, um den Roboterspender in die Home-Position zurückzubekommen. HINWEIS: Homing gibt den Roboterspender in eine bekannte Position zurück (x=0, y=0) und verbessert somit die Genauigkeit des Spenders.</li>
	<li>Bereiten Sie vor dem Versuch eine ausreichende Anzahl von 96 Brunnenplatten vor, wobei Die Brunnen eine angemessene Menge an fixativem Gehalt enthalten (z. B. Endkonzentration 3,7 % Formaldehyd). HINWEIS: Zum Beispiel werden bei einer Durchflussrate von 0,2 ml min-1alle 30 s 100 l in jeden Brunnen abgegeben. Fügen Sie daher jedem Brunnen 10 l 37 % Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von Formaldehyd zwischen 2 und 4 % zu erreichen. Mit acht 96 Wellplatten kann das Experiment über 6 h mit insgesamt 768 Datenpunkten betrieben werden. Beachten Sie außerdem, dass GFP-markierte Zellen ihr fluoreszierendes Signal nach der Fixierung mit Formaldehyd verlieren können.</li>
</ol>5. Analysieren Sie den bakteriellen Transport mit mikrofluidischen PDMS-Geräten
<ol><li>Stellen Sie das zuvor mit dem Motilitätspuffer gesättigte PDMS-Mikrofluidgerät auf die Mikroskopstufe. Verwenden Sie Klebeband, um die Schläuche zu fixieren, um Die Störung des Durchflusses während der Bühnenbewegung zu minimieren.</li>
	<li>Bewegen Sie die Mikroskopstufe in den Beobachtungskanal in der Nähe des Auslasses. Mit Der Hellenfeldmikroskopie oder dem Phasenkontrast konzentrieren Sie sich auf die Mitte des Beobachtungskanals und passen Sie die Vergrößerung an, um einzelne Bakterienzellen zu visualisieren.</li>
	<li>Schalten Sie die Lichtpfadeinstellungen auf die Fluoreszenzmikroskopie um und passen Sie die Belichtungszeit der Kamera an, um einzelne Bakterienzellen (z. B. 100 ms) aufzulösen, oder so, dass Fluoreszenzsignale von Zellen mindestens 3x stärker sind als Hintergrundgeräusche.</li>
	<li>Als nächstes legen Sie den Einlassschlauch in ein 2 ml-Rohr ein, das die bakterielle Suspension enthält. Umkehren Sie die Pumpenrichtung und beginnen Sie mit dem Zurückziehen der Suspension bei einer Durchflussrate von 1 l min-1.</li>
	<li>Scannen Sie den Querschnitt des gesamten Beobachtungskanals, der alle 2 Minuten über die gesamte Dauer des Experiments ein zusammengesetztes Bild aufzeichnet.</li>
</ol>6. Grundlegende Bildverarbeitung
HINWEIS: Das Ziel dieser grundlegenden Bildverarbeitungsroutinen ist es, die Anzahl der Bakterien in den aufgezeichneten Bildern zu zählen. Optimale Verarbeitungsverfahren hängen von den technischen Spezifikationen des Mikroskops und der Kamera sowie von den Fluoreszenzeigenschaften des im Experiment verwendeten Bakterienstamms ab und müssen daher angepasst werden.
<ol><li>Exportieren Sie zuerst Bilder im .tiff Format.</li>
	<li>Importieren Sie Bilder auf eine gewünschte Softwareplattform (z. B. MATLAB, ImageJ, R oder Python).</li>
	<li>Entfernen Sie Kamerarauschen, das eine zufällige Variation der Pixelintensität in Bildern darstellt und für optische Aberrationen korrigiert wird. Dies kann durch Anwenden eines Gaußschen Filters auf jedes Bild erfolgen: Die Größe des Filters hängt von der Qualität des Kamerasensors ab (z. B. CCD oder CMOS). Die optische Aberration kann entfernt werden, indem jedes Bild durch ein Referenzbild normalisiert wird, das in Abwesenheit der Probe mit der gleichen optischen Konfiguration gesammelt wurde.</li>
	<li>Schneiden Sie die Bilder in eine Region von Interesse.</li>
	<li>Identifizieren Sie einen Schwellenwert (Pixelintensität), sodass Werte oberhalb des Schwellenwerts Bakterielle Zellen enthalten. HINWEIS: Wenn Bilder ungleichmäßig beleuchtet sind (aufgrund optischer Aberration oder Rauschen), kann es sinnvoll sein, einen adaptiven Schwellenwert anzuwenden, der einen Schwellenwert basierend auf lokalen mittleren Intensitäten wählt.</li>
	<li>Subtrahieren Sie von jedem Bild den oben definierten Schwellenwert.</li>
	<li>Binarisieren Sie das resultierende Bild, so dass Bakterienzellen einen Wert von 1 annehmen, während Hintergrund einen Wert von 0 hat.</li>
	<li>Entfernen Sie Cluster mit einer Fläche, die kleiner als die kleinste bakterielle Zellengröße ist.</li>
	<li>Summieren Sie das binarisierte Bild, um die Gesamtzahl der Pixel der verbleibenden Cluster abzuerhalten. Dividieren Sie die Anzahl der Pixel durch die durchschnittliche Größe (in Pixel) einer Bakterienzelle: Dies liefert eine Schätzung der Gesamtzahl der Zellen.</li>
	<li>Wissend Tiefe der Sicht und Untersuchungsbereich, transformieren Zählt in Konzentration (Teilchen mL-1).</li>
	<li>Es ist von grundlegender Bedeutung, die Konzentration der injizierten BakterienSuspension zu identifizieren. Dazu mit einer Spritze 1 ml Bakterienkultursuspension in den Beobachtungskanal eines sauberen mikrofluidischen Geräts injizieren. Zeichnen Sie das Bild auf und berechnen Sie die zusätzlich beschriebene in fluent bakterielle Konzentration (C0) (6.1 bis 6.10).</li>
	<li>Analysieren Sie BTCs durch Normalisierung der bakteriellen Konzentration (C) mit einer wohlhabenden Bakterienkonzentration (C0) und der Darstellung C/C0 im Vergleich zur Zeit.</li>
</ol>7. Analysieren Sie den bakteriellen Transport auf der Porenskala

<ol><li>Um lokale Geschwindigkeiten und Flugbahnen von Bakterien zu analysieren, die durch die poröse Matrix transportiert werden, bewegen Sie die Mikroskopstufe in den Bereich des Interesses und passen Sie den Fokus auf das Zentrum des mikrofluidischen Geräts an.</li>
	<li>Stellen Sie das Mikroskop auf einen hellen Feld- oder Phasenkontrast ein. HINWEIS: Dies nur, wenn das Fluoreszenzsignal der Bakterienzelle die Aufnahme von Bildern bei expositionskürzerer Zeit als die durchschnittliche bakterielle Zeit nicht zulässt, verwenden Sie ansonsten fluoreszenzmikroskopische Mikroskopie.</li>
	<li>Zeichnen Sie Zeitrafferbilder auf, die bei der Belichtungszeit die Verschiebung von Bakterien erfassen (kürzer als die durchschnittliche Verschiebung über eine Anzahl von Pixeln kleiner als die Objektgröße), und die die Erkennung bakterieller Zellen optimiert (z. B. Belichtung von 20 ms und Alle 50 ms aufgezeichnete Bilder). Zeichnen Sie Bilder über einen ausreichenden Zeitraum auf, um genügend (statistisch repräsentativ) der langsamsten Flugbahnen (z.B. 3 min) aufzuzeichnen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Computer über genügend Speicherplatz verfügt.</li>
	<li>Um Hintergrundgeräusche zu entfernen, subtrahieren Sie von jedem Bild den Durchschnitt aller aufgezeichneten Bilder. Erstellen Sie dazu eine Matrix, deren Ergebnis die Summe der Intensität aller Bilder für jedes Pixel ist, und dividieren Sie sie durch die Anzahl der Bilder.</li>
	<li>Bestimmen Sie aus dem verarbeiteten Bild (Im) den Modul des numerischen Farbverlaufs <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60701/60701eq1v2.jpg" style="opacity: 0.9;"> und normalisieren Sie ihn durch seinen Maximalwert (max), wie unten definiert. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60701/60701eq2v2.jpg">  <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60701/60701eq3v2.jpg">
</li>
	<li>Binarisieren Sie die Matrix B über Intensitätsschwellen, siehe Schritte 6.7-6.8.</li>
	<li>Zeichnen Sie für jeden Zeitpunkt Bakterienkoordinaten (x, y in Pixel oder mm) und die Zeit der Bildaufnahme in einer dreispaltigen Datei auf.</li>
	<li>Wenden Sie schließlich ein Partikelverfolgungsskript an, um die aufgezeichneten Daten zu verarbeiten und die Flugbahnen der Bakterien zu berechnen. Verwenden Sie beispielsweise das etablierte Protokoll19und den frei verfügbaren Matlab Particle Tracking Code: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).</li>
</ol>8. Bakterielle Filtration mittels Abscheidungsprofilen untersuchen
<ol><li>Um Abscheidungsprofile von GFP-markierten P. putida KT2440-Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie zu erhalten, zeichnen Sie ein zusammengesetztes Bild des gesamten porösen Kanals vor, d. h. dem Hintergrund, und nach der Injektion der bakteriellen Suspension durch das mikrofluidische Gerät auf. Verwenden Sie eine Belichtungszeit, die die Erfassung bakteriellen Fluoreszenzsignals (z. B. 100 ms) ermöglicht, ohne das Signal zu bleichen.</li>
	<li>Exportieren Sie Bilder und importieren Sie in die gewünschte Softwareplattform (siehe 6.1-6.2).</li>
	<li>Entfernen Sie den Hintergrund aus den Bildern, die nach der bakteriellen Injektion aufgenommen wurden.</li>
	<li>Integrieren Sie das gesamte Fluoreszenzsignal von zurückgehaltenen Bakterien entlang transversaler Abschnitte des porösen Kanals.</li>
	<li>Um das Ablagerungsprofil zu berechnen, zeichnen Sie das integrierte Blütensignal im Vergleich zur porösen Kanallänge.</li>
</ol>9. Analysieren Sie den bakteriellen Transport mit PMMA-Fluidgeräten und Durchflusszytometrie
<ol><li>Verbinden Sie peristaltische Pumpe mit dem Einlass mit 50 cm (1 mm Innendurchmesser) Schläuche, und der Abfluss mit dem automatisierten Spender mit dem gleichen Schlauch (50 cm, siehe Abschnitt 4). HINWEIS: Verwenden Sie die Pumpe, um Kultivierungsmedien zu verteilen und Bakterienzellen zu injizieren. Verwenden Sie Luer-Lock-Steckverbinder und Dreiwegeventile, um während der Freisetzung mit konstanter Geschwindigkeit zwischen mittlerer und bakterieller Suspension zu wechseln.</li>
	<li>Pumpenanbaumedium im Fluidgerät. Beachten Sie die Ankunft des Mediums an den auslaufgebundenen Schläuchen, die am Roboterspender befestigt sind.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Injektion der bakteriellen Suspension durch das PMMA-Fluidgerät bei einer Durchflussrate von 0,2 ml min-1,</li>
	<li>Wenn Bakterien den Fluidgeräte-Einlass erreichen, schalten Sie den automatisierten Spender ein.</li>
	<li>Um eine Pulsinjektion zu machen, injizieren Sie bakterielle Suspension für einige Porenvolumina (z.B. 30), und schalten Sie dann die Injektion auf Kultivierungsmedien bis zum Ende des Experiments um. HINWEIS: Das Porenvolumen der Fluidvorrichtung beträgt ca. 0,2 ml, so dass bei der prosed durchgeströmten Durchflussrate jede Minute ein ganzes Porenvolumen ausgetauscht wird.</li>
	<li>Sobald eine 96-Wellplatte fertig ist, bedecken Sie die Platte, um die Verdunstung zu reduzieren, und lagern Sie sie bei 4 °C.</li>
	<li>Analysieren Sie die bakterielle Fülle über die Durchflusszytometrie nach den etablierten Protokollen20. ANMERKUNG: Fügen Sie z. B. jedem Brunnen 25 L des grünfluoreszierenden Nukleinsäureflecks (Materialtabelle) bei 0,025 mM (in Reinstwasser) hinzu. Es färbt bakterielle DNA, so dass durch Strömung zytometrie die bakterielle Fülle zu quantifizieren. Inkubieren Sie Proben für 15 min im Dunkeln und analysieren Sie dann mit einem Durchflusszytometer, der mit einem 488 nm Laser und Detektoren bei 515 nm ausgestattet ist.</li>
	<li>Berücksichtigen Sie vor der BTC-Analyse die Verdünnung der Probe aufgrund der Zugabe von Fixativ und Fleck. Korrigieren Sie die bakterielle Fülle um den Faktor 1,35, um fixative und Flecken zu berücksichtigen.</li>
</ol>

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<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
<li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

Hier schlagen wir zwei Mittel vor, um den Transport von Mikroben durch poröse Systeme auf Einzelzell- und Populationsebene zu untersuchen. Während die Untersuchung von Transportphänomenen mit Hilfe von BTC-Modellierung wertvolle Erkenntnisse über die Ausbreitung von Krankheitserregern oder Kontaminanten auf den Ökosystemskalen lieferte, gibt es nach wie vor Schwierigkeiten, von Laborexperimenten bis hin zu Feldbedingungen zu skalieren. Die hier beschriebenen Werkzeuge ermöglichen es den Forschern, die räumlichen und zeit...

Studien, die darauf abzielen, den Transport von Mikroben durch poröse Medien zu verstehen, wurden hauptsächlich durch Bedenken der Kontamination1, der Übertragung von Krankheit2 und der Biosanierung3 getrieben. In dieser Hinsicht wurden Bakterien in den Transportmodellen4 meist als Partikel behandelt und Prozesse wie Filtration, Belastung, Gravitationsabsetzen oder Remobilisierung aus Biofilmen wurden als Treiber der Retention oder des Transports von Mikroben identifiziert5. Die Untersuchung des Transports von Bakterien durch poröse Landschaften kann uns jedoch auch über die ökologischen Strategien informieren, die ihren Erfolg in diesen komplexen Umgebungen untermauern. Dies erfordert jedoch neuartige Experimente und mathematische Modelle, die auf der Ebene der Einzelzellen, der Population oder der mikrobiellen Gemeinschaft funktionieren.
Natürliche poröse Umgebungen, wie sie in der hyporhoischen Zone von Bächen und Flüssen gefunden werden, werden von verschiedenen Gemeinschaften von biofilmbildenden Mikroben dicht besiedelt6. Biofilme bilden Strukturen, die den Fluss und damit den Transport und die Dispersion von Bakterien in der flüssigen Phase7,8verändern. Der Transport von Bakterien im Porenmaßstab hängt von der begrenzten Raumverfügbarkeit in der porösen Matrix ab und die mit Dermotilität zusammenhängende Dispersion kann ein effektiver Weg sein, um die individuelle Fitness durch einen geringeren Wettbewerb um Ressourcen in weniger dicht besiedelten Gebieten zu erhöhen. Auf der anderen Seite können motile Bakterien auch mehr isolierte Regionen der porösen Matrix erreichen und die erweiterte Erforschung solcher Gebiete kann ökologische Möglichkeiten für motile Populationen bieten10. Bei größeren räumlichen Maßstäben lenkt das Biofilmwachstum die Strömungswege um, was auch zu (teilweiser) Verstopfung der Poren und damit zur Etablierung noch kanalisierterer und heterogener Strömungsbedingungen11führt. Dies hat Folgen für die Nährstoffversorgung und Diedispersionskapazität, Frequenz und Entfernung. Bevorzugter Fluss kann beispielsweise sogenannte "Fast-Tracks" erzeugen und motile Bakterien können noch höhere Geschwindigkeiten erreichen als der lokale Fluss entlang dieser Bahnen12. Dies ist ein effektiver Weg, um die Erforschung neuer Lebensräume zu erhöhen.
Eine Vielzahl von Werkzeugen nutzen sich für die Untersuchung des Transports von motilen und nicht-motilen Bakterien (und Partikeln) in porösen Medien. Numerische Modelle haben große Vorhersagekapazitäten, die für Anwendungen wichtig sind, werden jedoch oft durch inhärente Annahmen eingeschränkt4. Laborexperimente13,14 kombiniert mit der Modellierung von Bahnbrechenden Kurven (BTC) haben wichtige Erkenntnisse über die Bedeutung bakterieller Zelloberflächeneigenschaften für die Hafteffizienz15geliefert. Typischerweise werden BTCs (d. h. Malreihen der Partikelkonzentration an einem festen Ort) durch konstante Freisetzungen und Messung der Zellzahlen am Abfluss des Versuchsgeräts erhalten. In diesem Zusammenhang spiegeln BTCs die Advektions-Dispersionsdynamik von Bakterien in der porösen Matrix wider und können durch einen Senketerm erweitert werden, der die Anhaftung berücksichtigt. Die Modellierung von BTCs allein löst jedoch nicht die Rolle der räumlichen Organisation des porösen Substrats oder Biofilms für Transportprozesse auf. Andere makroskopische Beobachtungswerte wie Dispergivität oder Ablagerungsprofile liefern nachweislich wichtige Informationen über die räumliche Verteilung oder die zurückgehaltenen Teilchen oder wachsenden Gemeinschaften. Mikrofluidik ist eine Technologie, die das Studium des Transports in porösen Medien durch Mikroskopie Untersuchung9,12,16ermöglicht, und außer einer kürzlichen Arbeit10, experimentelle Systeme sind in der Regel auf eine einzelne Längenskala der Auflösung beschränkt, das heißt, die Porenskala oder die gesamte Fluidgeräteskala.
Hier stellen wir eine Reihe kombinierter Methoden vor, um den Transport von motilen und nicht-motilen Bakterien in porösen Landschaften in verschiedenen Maßstäben zu untersuchen. Wir kombinieren Beobachtungen des bakteriellen Transports auf der Porenskala mit Informationen in größerem Maßstab, mittels BTC-Analysen. Mikrofluidische Geräte aus weicher Lithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS) sind biokompatibel, resistent gegen eine Reihe von Chemikalien, ermöglichen Einereproduzierlichkeit zu niedrigen Kosten und bieten eine hervorragende optische Transparenz sowie eine geringe Autofluoreszenz, die für die mikroskopische Beobachtung entscheidend ist. Mikrofluidik auf Basis von PDMS wurde bisher verwendet, um den Transport von Mikroben in einfachen Kanälen17 oder in komplexeren Geometrien12zu untersuchen. Typischerweise konzentrieren sich Mikrofluidik-Experimente jedoch auf kurzfristige Horizonte, und die mikroskopische Beobachtung lebender Zellen durch Epifluoreszenz ist häufig auf genetisch veränderte Stämme (z. B. GFP-markierte Stämme) beschränkt. Hier stellen wir Werkzeuge zur Untersuchung des bakteriellen Transports mit MIKROfluidischen PDMS-basierten Geräten in Kombination mit Mikroskopie und größeren Geräten aus Poly (Methylmethacrylat) (PMMA, auch Plexiglas genannt) in Kombination mit Durchflusszytometrie vor. PDMS und PMMA unterscheiden sich in der Gasdurchlässigkeit und Oberflächeneigenschaften und bieten so ergänzende Möglichkeiten, den bakteriellen Transport zu untersuchen. Während das mikrofluidische Gerät eine kontrolliertere Umgebung bietet, ermöglicht das größere Gerät Experimente über einen längeren Zeitraum oder die Verwendung natürlicher Bakteriengemeinschaften. Die Mikroskopiezählung mit hoher zeitlicher Auflösung in einem speziellen Bereich wird verwendet, um BTC im PDMS-basierten mikrofluidischen Gerät zu erhalten. Um die Anzahl der Zellen für die BTC-Modellierung vom PMMA-basierten Gerät zu erhalten, führen wir einen selbstkonstruierten automatisierten Flüssigkeitsspender in Kombination mit Durchflusszytometrie ein. Bei diesem Setup passieren die Zellen das Fluidgerät und werden nacheinander in 96 Brunnenplatten abgegeben. Die zeitliche Auflösung wird durch das minimale Volumen, das genau abgegeben werden kann, und damit die mittlere Durchflussrate durch das Fluidgerät eingeschränkt. Fixativ in den Brunnen verhindert Wachstum und erleichtert DIE DNA-Färbung für die nachgeschaltete strömungszytometrische Enumeration. Um das Bakterienwachstum bei Transportexperimenten zu verhindern, verwenden wir einen minimalen mittelmäßigen Motilitätspuffer.
Da Protokolle zur Herstellung von Fluidgeräten in verschiedenen Maßstäben leicht verfügbar sind, führen wir nur kurz die Techniken zur Herstellung solcher Geräte ein und konzentrieren uns vielmehr auf die experimentellen Verfahren zur Aufzeichnung von BTCs. In ähnlicher Weise gibt es verschiedene Routinen für die zytometrische Aufzählung von Mikroben durch die Durchfluss- und Benutzer benötigen Expertenwissen, um die ergebnisse zu interpretieren, die durch die Durchflusszytometrie erzielt werden. Wir berichten über den neuartigen Einsatz von mikrofluidischen Geräten in Kombination mit mikroskopischer Bildgebung, um BTCs von fluoreszierend markierten Zellen aufzuzeichnen. Auf der Porenskala werden lokale Geschwindigkeiten und Flugbahnen mittels Bildverarbeitung ermittelt. Darüber hinaus zeigen wir den Einsatz eines PMMA-basierten Fluidgeräts in Kombination mit strömungszytometrischer Zählung, um den bakteriellen Transport von motilen und nicht-motilen Zellen in porösen Umgebungen zu beobachten, die durch einen nativen Strombiofilm besiedelt sind.

<table><tbody><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastomer Sylgard 184</td><td>Dowsil</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer NovoCyte</td><td>Acea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td></td><td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flüssigkeitsspender, XY Plotter Roboter Kit</td><td>Makeblock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Axio Imager</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop AxioZoom v16</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger, 75 mm &fach 25 mm</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 Peristaltikpumpe</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma Bonder Corona SB</td><td>BlackHole Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe New Era NE 4000</td><td>New Era</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syto 13 Grün fluoreszierende Nukleinsäure-Färbung</td><td>Molekulare Sonden, Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon Schläuche</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WF31SA Universal-Fräsmaschine</td><td>Mikron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kombination von fluidic devices mit mikroskopie und durchflusszytometrie zur untersuchung des mikrobiellen transports in porösen medien über räumliche skalen hinweg

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Das Verständnis des Transports, der Dispersion und der Ablagerung von Mikroorganismen in porösen Medien ist eine komplexe wissenschaftliche Aufgabe, die so unterschiedliche Themen wie Hydrodynamik, Ökologie und Umwelttechnik umfasst. Die Modellierung des bakteriellen Transports in porösen Umgebungen in unterschiedlichen räumlichen Maßstäben ist entscheidend, um die Folgen des bakteriellen Transports besser vorherzusagen, doch aktuelle Modelle verfehlen es oft, von Labor zu Feldbedingungen zu skalieren. Hier stellen wir experimentelle Werkzeuge vor, um den bakteriellen Transport in porösen Medien in zwei räumlichen Maßstäben zu untersuchen. Ziel dieser Werkzeuge ist es, makroskopische Beobachtungen (wie Durchbruchkurven oder Abscheidungsprofile) von Bakterien zu erhalten, die in transparente poröse Matrizen injiziert werden. Im kleinen Maßstab (10-1000 m) werden mikrofluidische Geräte mit optischer Videomikroskopie und Bildverarbeitung kombiniert, um bahnbrechende Kurven zu erhalten und gleichzeitig einzelne Bakterienzellen im Porenmaßstab zu verfolgen. In größerem Maßstab wird die Durchflusszytometrie mit einem selbstgebauten Roboterspender kombiniert, um bahnbrechende Kurven zu erhalten. Wir veranschaulichen den Nutzen dieser Werkzeuge, um besser zu verstehen, wie Bakterien in komplexen porösen Medien wie der hyporhoischen Zone von Strömen transportiert werden. Da diese Werkzeuge simultane Messungen über Skalen hinweg ermöglichen, ebnen sie den Weg für mechanismusbasierte Modelle, die für die Hochskalierung von entscheidender Bedeutung sind. Die Anwendung dieser Werkzeuge kann nicht nur zur Entwicklung neuartiger Biosanierungsanwendungen beitragen, sondern auch ein neues Licht auf die ökologischen Strategien von Mikroorganismen werfen, die poröse Substrate besiedeln.

Um die Funktionalität des vorgestellten Workflows zu veranschaulichen, führten wir Experimente mit dem gentechnisch veränderten Pseudomonas putida KT2440 durch, einem gramnegativen motile Bakterium, das für die Biosanierung und Biotechnologie wichtig ist. Gentechnisch veränderte Versionen dieses Stammes, die die GFP-Produktion ausdrücken, sind im Handel erhältlich. Ein nicht-motiler Stamm von P. putida KT2440, dem die relevanten strukturellen und regulatorischen Gene für...

Durchbruchskurven (BTCs) sind effiziente Werkzeuge, um den Transport von Bakterien in porösen Medien zu untersuchen. Hier stellen wir Werkzeuge auf Basis von Fluidgeräten in Kombination mit Mikroskopie und Zytometrischer Durchflusszählung vor, um BTCs zu erhalten.

Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Die Untersuchung des Transports von Bakterien in porösen Systemen ist im Hinblick auf Kontamination, Ausbreitung von Krankheiten und Biosanierung wichtig. Für diese Experimente in mathematischen Modellen, die an der Einzelzelle arbeiten, sind die Population und die mikrobielle Gemeinschaftsebene erforderlich. Hier stellen wir Werkzeuge zur Untersuchung des bakteriellen Transports mit mikrofluidischen Geräten und Mikroskopie sowie größerer Geräte in Kombination mit Durchflusszytometrie vor.Die Kombination von mikrofluidischen Geräten mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie bietet eine Reihe von Möglichkeiten, bakterielle Transportphänomene in verschiedenen räumlichen Maßstäben zu untersuchen. Um dieses Protokoll vollständig zu erkunden, wird empfohlen, bereits Erfahrungen in der Mikroskopie, der grundlegenden Bildverarbeitung, dem Entwerfen mikrofluidischer Geräte und der Mastering-Flow-Zytometrie zu haben. Dieses Video beschreibt zwei Methoden, um den bakteriellen Transport in verschiedenen räumlichen Maßstäben zu untersuchen.Die erste Methode, die auf mikrofluidischen Geräten basiert, beruht auf der Mikroskopie, um einzelne Zellen zu zählen. Dieses System kann verwendet werden, um den bakteriellen Transport über mehrere räumliche Skalen von der Pore bis zur gesamten porösen Systemskala zu untersuchen. Die zweite Methode, mit größeren Fluidien, die an einen automatisierten Spender gekoppelt sind, und durchFlusszytometrie, kann verwendet werden, um bakterielle Transportphänomene in der Größenordnung ganzer poröser Systeme zu untersuchen.Solche Methoden können auch in Kolonstudien im Labormaßstab sowie in Kleinfelduntersuchungen eingesetzt werden. Entwerfen Sie zunächst die gewünschte poröse Geometrie, die aus einer Matrix von Kreisen besteht. Basierend auf der gewählten Geometrie, bereiten Sie eine Form mit Standard SU-8 Photolithographie.Bereiten Sie 50 Gramm PDMS vor, indem Sie 90 % Elastomer zu 10 % des Härtungsmittels zu 90 % des Elastomers in einem sauberen Einwegbehälter hinzufügen und die beiden Reagenzien mit einem sauberen Werkzeug vermischen. Tragen Sie ein Vakuum von 100 Millibar für 30 Minuten auf, um gelöste Luft und Blasen zu entfernen. Legen Sie die Form in eine Petrischale und gießen Sie das PDMS auf die gewünschte Höhe zwischen zwei und fünf Millimetern.Bedecken Sie die Petrischale mit einem Deckel und halten Sie sie mindestens vier Stunden bei 60 Grad Celsius. Danach lassen Sie das mikrofluidische Gerät auf Raumtemperatur abkühlen. Sobald es abgekühlt ist, entfernen Sie vorsichtig den gewünschten Teil von PDMS mit einem Skalpell.Versiegeln Sie vorübergehend den Boden des PDMS-Kanals mit Klebeband. Mit einem Stanzer mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern können Sie Kanäle durchbohren, um einen Einlass und einen Auslass zu erzeugen. Entfernen Sie das Band aus dem PDMS-Kanal und platzieren Sie den Kanal mit der porösen Seite nach oben.Behandeln Sie die Glasrutsche und PDMS-Oberflächen mit Plasma für jeweils ca. 45 Sekunden bei Raumtemperatur. Legen Sie den vorbehandelten PDMS-Kanal auf den vorbehandelten Glasschlitten und erhitzen Sie 30 Minuten lang bei 100 Grad Celsius auf einer Kochplatte, entfernen Sie dann das mikrofluidische Gerät von der Kochplatte und kühlen Sie es auf Raumtemperatur. Vakuum für 30 Minuten auftragen, um Luft von PDMS zu entfernen.Um die Basis zu erzeugen, die das Porenfach enthält, verwenden Sie hochpräzise Smicrofräsen, um 0,5 Millimeter von der Basis-PMMA-Schicht zu entfernen und eine Nut in der Größe von 1,1 mal 1,1 Millimetern für einen Gummi-O-Ring zu fräsen. Bohren Sie zwei Gewindebohrungen für einen Ein- und Auslass in den oberen Teil der Fluidvorrichtung und 12 Löcher für Schrauben. Dies dient als Deckel des Fluidgeräts.Nach der Reinigung des Fluidgeräts die Basis und den Deckel mit den 12 Gewindelöchern zusammenschrauben. Entfernen Sie das Mikrofluidaus vakuumfern und stellen Sie es auf die Mikroskopstufe. Verwenden Sie die Spritzenpumpe, um sie mit Motilitätspuffer zu sättigen.Passen Sie mit Brightfield-Mikroskopie oder Phasenkontrast die Vergrößerung an, um einzelne Bakterienzellen zu visualisieren und sich auf die Mitte des Beobachtungskanals zu konzentrieren. Schalten Sie die Lichtpfadeinstellungen auf Fluoreszenzmikroskopie um. Passen Sie den Fokus durch einen Offset und die Belichtungszeit der Kamera an, um einzelne Bakterienzellen aufzulösen.In diesem Fall 100 Millisekunden. Als nächstes legen Sie den Einlassschlauch in ein Zwei-Milliliter-Rohr ein, das die bakterielle Suspension enthält. Umkehren Sie die Pumpenrichtung und beginnen Sie mit dem Zurückziehen der Suspension mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Minute.Scannen Sie den Querschnitt des gesamten Beobachtungskanals und zeichnen Sie jede Minute ein Bild auf. Importieren Sie Bilder auf eine gewünschte Softwareplattform. Zeichnen Sie den Hintergrund als Durchschnitt der ersten Bilder auf, wenn keine Partikel aufgezeichnet wurden.Subtrahieren Sie den Hintergrund von jedem Bild, um Kamerageräusche und optische Aberrationzuentfernen. Schneiden Sie die Bilder in eine Region von Interesse. Identifizieren Sie einen Schwellenwert, der der Zellfluoreszenzpixelintensität entspricht, sodass Werte, die größer als der Schwellenwert sind, bakterielle Zellen enthalten.Verwenden Sie die Bildverarbeitung, um den Schwellenwert von jedem Bild zu subtrahieren. Binarisieren Sie das resultierende Bild so, dass Bakterienzellen einen Wert von eins annehmen, während der Hintergrund den Wert Null annimmt. Entfernen Sie Pixelcluster mit einer Fläche, die kleiner als die kleinste bakterielle Zellengröße in Pixeln ist.Summieren Sie das binarisierte Bild, um die Gesamtzahl der Pixel der verbleibenden Cluster abzuerhalten. Teilen Sie die Anzahl der Pixel durch die durchschnittliche Größe einer Bakterienzelle in Pixel, um eine Schätzung der Anzahl der Zellen zu erhalten. Verwandeln Sie die Zählungen in Partikel pro Milliliter in Konzentration.Um die Konzentration der injizierten bakteriellen Suspension zu identifizieren, injizieren Sie die bakterielle Suspension mit einer Spritze in den Beobachtungskanal einer sauberen mikrofluidischen Vorrichtung. Zeichnen Sie das Bild auf und berechnen Sie die in fluent bakterielle Konzentration, wie zuvor gezeigt. Visualisieren Sie Durchbruchskurven, indem Sie die bakterielle Konzentration C mit der zufließenden bakteriellen Konzentration C0 normalisieren und C über C0 im Vergleich zur Zeit zeichnen.Um die lokalen Geschwindigkeiten und Flugbahnen von Bakterien zu analysieren, die durch die poröse Matrix transportiert werden, bewegen Sie die Mikroskopstufe in einen Bereich von Interesse und passen Sie den Fokus an die Mitte des mikrofluidischen Geräts an. Stellen Sie die optische Konfiguration auf Phasenkontrast- oder Fluoreszenzmikroskopie ein. Zeichnen Sie Zeitrafferbilder und eine Belichtungszeit auf, die kurz genug ist, um bakterielle Verschiebungen zu erfassen.In diesem Fall 50 Millisekunden. Zeichnen Sie Bilder über einen ausreichenden Zeitraum auf, z. B. drei Minuten. Um Rauschen von jedem Bild zu entfernen, subtrahieren Sie den Hintergrund, der der Durchschnitt der Summe aller aufgezeichneten Bilder ist.Bestimmen Sie den Modul des numerischen Farbverlaufs und normalisieren Sie ihn anhand seines Maximalwerts. Suchen und aufzeichnen Sie bakterielle Koordinaten und den Zeitpunkt der Bildaufnahme in einer dreispaltigen Datei. Führen Sie partikelverfolgungsanalysen durch, um die aufgezeichneten Daten zu verarbeiten und die Flugbahnen zu berechnen.Um Ablagerungsprofile zu erhalten, zeichnen Sie ein zusammengesetztes Bild des gesamten porösen Kanals vor, d. h. den Hintergrund, und nach der Injektion der bakteriellen Suspension durch das mikrofluidische Gerät auf. Entfernen Sie den Hintergrund aus den Bildern, die nach der bakteriellen Injektion aufgenommen wurden. Berechnen Sie das Abscheidungsprofil D als Summe des bakteriellen Fluoreszenzsignals entlang transversaler Abschnitte der Länge x des porösen Kanals.Visualisieren Sie das Abscheidungsprofil als lokales Fluoreszenzsignal im Vergleich zur porösen Kanallänge. Um den automatisierten Spender einzurichten, stellen Sie den Roboterspender in der Nähe des Fluidgeräts auf. Schließen Sie den Roboterspender an den Computer mit BCNC an, und identifizieren Sie den richtigen Com-Port.Klicken Sie in BCNC auf die Home-Taste, um den Roboterspender in die Home-Position zurückzubekommen. Verbinden Sie die Peristaltikpumpe mit dem Einlass mit 50 Zentimeter langen Schläuchen mit einem Millimeter Innendurchmesser und den Abfluss mit dem automatisierten Spender mit dem gleichen Schlauch. Pumpenanbaumedium durch das Fluidgerät.Beachten Sie die Ankunft des Mediums an den am Roboterspender befestigten Auslassschläuchen und legen Sie eine 96-Well-Platte, die den Abfluss sammelt. Gleichzeitig aktivieren Sie den Roboterspender und injizieren Sie die bakterielle Suspension durch das PMMA Fluidgerät mit einer Durchflussrate von 0,2 Milliliter pro Minute. Injektion bakterielle Suspension entsprechend mehreren Porenvolumen.Zum Beispiel das 30-fache des Volumens des Fluidgeräts. Wechseln Sie nach der Injektion auf steriles Anbaumedium bis zum Ende des Experiments. Sobald eine 96-Well-Platte fertig ist, bedecken Sie die Platte und lagern Sie bei vier Grad Celsius bis zur Strömungszytometrie-Analyse.Analysieren Sie Proben mit Durchflusszytometrie und visualisieren Sie Durchbruchkurven, indem Sie die bakterielle Konzentration C mit der influenten bakteriellen Konzentration C0 normalisieren und C über C0 im Vergleich zur Zeit zeichnen. In dieser Studie wurden sowohl mit motilen als auch mit nicht-motilen Pseudomonas putida KT2440 sequentielle Experimente an mikrofluidischen PDMS-Geräten mit einer zufälligen Reihe von Säulen durchgeführt. Hier werden Durchbruchkurven, die auf die Konzentration der injizierten Zellen normalisiert wurden, sowie bakterielle Bahnen im Porenmaßstab gezeigt.Experimente mit großflächigen Fluidgeräten, die aus PMMA gefräst wurden, wurden ebenfalls durchgeführt. Motile und nicht-motile Pseudomonas putida KT2440 wurden in eine regelmäßig verteilte poröse Matrix injiziert. Auffallend ist, dass in einer porösen Umgebung ohne Biofilm motile und nicht-motile Pseudomonas putida KT2440 ein deutlich anderes Transportverhalten auf der Grundlage von Durchbruchkurven zeigte.In einer porösen Matrix, die 48 Stunden lang mit einer komplexen Flussbiofilmgemeinschaft kolonisiert wurde, verschwanden diese Unterschiede in den Durchbruchskurven zwischen motiler und nicht-motiler Pseudomonas putida KT2440. Wir verwenden dieses System, um bakterielle Transport in den Strömen zu untersuchen, aber diese Werkzeuge können leicht angepasst werden, um bakterielle Transportphänomene in anderen technischen und Umweltsystemen zu studieren. Bakterielle Transport durch hydratisierte poröse Medien verkapseln Prozesse über mehrere räumliche Skalen.Die hier vorgestellte Methodik ermöglicht es, die lokale Verdrängung von Bakterien auf der Porenskala mit dem mikroskopischen Transport am gesamten porösen Medium zu verknüpfen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Mikrofluidik-Geräte lassen sich komplexe natürliche Prozesse in Echtzeit und auf der entsprechenden physikalischen Maßstäben zu visualisieren. Wir haben ein einfaches Mikrofluidiksystem, dass wichtige Funktionen des natürlichen porösen Medien nachahmt für das Studium Wachstum und Transport von Bakterien im Untergrund entwickelt.

Fenster an einem Microworld: Einfache mikrofluidische Systeme für Studium Mikrobielle Transport in porösen Medien

Quelle: Scheidweiler, D., et al. Die Kombination von fluidischen Geräten mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert den Einsatz eines mikrofluidischen Geräts zur Quantifizierung der bakteriellen Beweglichkeit durch eine poröse Matrix, die aus zufällig angeordneten Säulen besteht. Fluoreszierend markierte Bakterien werden in das Gerät eingeführt, mikroskopisch...

Beurteilung der bakteriellen Beweglichkeit mit einem mikrofluidischen Gerät

Quelle: Kurz, D. L., et al. Mikrofluidische Plattform zur Untersuchung von Bioverstopfungen in porösen Medien. J. Vis. Exp. (2022)Das Video demonstriert den Einsatz eines mikrofluidischen Geräts zur Untersuchung der Biofilmbildung. Eine bakterielle Suspension wird in den Mikrokanal eingeführt, gefolgt von einer Inkubation, um die Entwicklung von Biofilmen zu ermöglichen. Anschließend wird der Fluss wieder aufgenommen, und Drucküberwachung zusammen mit Bildgebung wird eingesetzt, um...

Ein mikrofluidisches Gerät für Echtzeitbildgebung und Druckverfolgung während der Biofilmbildung

Wir überprüfen unsere jüngsten Ergebnisse auf der Integration der Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Durchflusszytometrie Tools auf einem Mobiltelefon mit kompakten und kostengünstigen opto-fluidischen Anlagen. Diese Handy-Basis Mikro-Analyse-Geräte könnte für durchflusszytometrische Analyse nützlich, wie die Ausführung verschiedener Zellzählung Aufgaben sowie für High-Throughput-Screening von z. B. Wasserproben in beschränkten Ressourcen-Einstellungen.

Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und Fluoreszenz-Imaging Durchflusszytometrie auf einem Cell-phone

Biofilme haben komplexe Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung. Um Biofilm-Umwelt-Wechselwirkungen umfassend zu untersuchen, stellen wir hier eine Reihe von Methoden vor, um eine heterogene chemische Umgebung für die Biofilmentwicklung zu schaffen, die lokale Strömungsgeschwindigkeit zu quantifizieren und den Stofftransport in und um Biofilmkolonien zu analysieren.

Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

Wir zeigen, eine mikrofluidische Plattform mit einem Elektrodennetz integriert Oberfläche, die resistive Pulserfassungs kombiniert (RPS) mit Codemultiplex-Vielfachzugriff (CDMA), Auffinden und Ausmessen von Partikeln in mehrere mikrofluidische Kanäle zu multiplexen.

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Kollektive Zellmigration in Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung wird oft von den Gradienten von Wachstumsfaktoren oder Signalmolekülen geleitet. Hier wird ein experimentelles System beschrieben, das Traktionsmikroskopie mit einem mikrofluidischen System kombiniert und demonstriert, wie die Mechanik der kollektiven Migration unter biochemischen Gradienten quantifiziert werden kann.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Aufgrund der Opazität des Bodens können Wechselwirkungen zwischen seinen konstituierenden Mikroben nicht leicht mit zellulärer Auflösung sichtbar gemacht werden. Hier werden zwei mikrofluidische Werkzeuge vorgestellt, die neue Möglichkeiten bieten, pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Geräte sind vielseitig und einfach zu bedienen und ermöglichen eine hohe räumlich-zeitliche Kontrolle und hochauflösende Bildgebung auf zellulärer Ebene.

Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine mikrofluidische Plattform zur Untersuchung der Biofilmentwicklung in quasi-2D-porösen Medien durch die Kombination von hochauflösender Mikroskopie-Bildgebung mit gleichzeitigen Druckdifferenzmessungen. Die Plattform quantifiziert den Einfluss von Porengröße und Flüssigkeitsdurchflussraten in porösen Medien auf die Bioverstopfung.

Eine mikrofluidische Plattform zur Untersuchung von Bioverstopfung in porösen Medien

Dieses Protokoll beschreibt einen quantitativen Ansatz zur Messung der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie.

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

Dieses Protokoll beschreibt das Design und die Herstellung eines mikrofluidischen Geräts, das für die Untersuchung der Mikrotubuli-Polymermechanik geeignet ist. Die Synthese von Mikrofabrikation, automatisierter Flusskontrolle und computergestützten Modellierungstechniken ermöglicht ein flexibles System, das sich ideal für die Untersuchung des zellulären Zytoskeletts in vitro eignet.

Entwicklung eines mikrofluidikbasierten Ansatzes zur Untersuchung der Mikrotubuli-Polymermechanik

Erfahren Sie Methoden zur Untersuchung des bakteriellen Transports in porösen Medien mit Mikrofluidik, Mikroskopie und Durchflusszytometrie. Diese Techniken ermöglichen die Analyse von Transportphänomenen über verschiedene räumliche Skalen hinweg.

Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg (Video) | JoVE Journal

Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg

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