Vollverarbeitetes rekombinantes KRAS4b: Isoliert und charakterisieren das farnesylierte und methylierte Protein
16. Januar 2020
Prenylierung ist eine wichtige Modifikation an peripheren Membranbindungsproteinen. Insektenzellen können manipuliert werden, um farnesylierte und carboxymethylierte KRAS4b in Mengen zu produzieren, die biophysikalische Messungen von Protein-Protein- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen ermöglichen
Unser Protokoll ermöglicht die Isolierung und Trennung von ordnungsgemäß verarbeitetem KRAS bei hoher Ausbeute. Die Herstellung von authentisch farnesylierten und carboxymethylierten KRAS ermöglicht Experimente, die KRAS in ihrer Membran haben, genau wie in Säugetierzellen. Die hohe Ausbeute des Protokolls hebt es von früheren Arbeiten ab.
Wir reinigen in der Regel drei bis fünf Milligramm Protein pro Liter Expressionsmaterial. Dies ermöglicht es uns, eine Vielzahl von biophysikalischen und strukturbiologischen Experimenten durchzuführen. KRAS ist bei 20% der Krebsarten und 90% bei Bauchspeicheldrüsenkrebs mutiert.
Ein Protokoll zur Herstellung von authentisch verarbeitetem Protein ist also sehr nützlich für die Entwicklung von Medikamenten-Screens, so dass Sie das eigentliche Protein wie auf der Membran von Krebszellen studieren können. Dieses Protokoll ist auch sehr nützlich für die Untersuchung anderer Proteine, die in den Zellen farnesyliert und vollständig verarbeitet sind. Und als solches, alles, was Sie tun müssen, ist das KRAS mit dem Protein von Interesse tauschen und setzen Sie es in das Baculovirus.
Die entscheidenden Schritte sind die rund um die Kationenaustauschchromatographie. Die Verwendung der richtigen Säule und die Begrenzung der Zeit, in der sich das Protein in einem niedrigen Salzpuffer befindet, sind für den Erfolg unerlässlich. Zu verstehen, dass der Niederschlag kein Ereignis vom Typ der Schneekugel ist, hilft, die Neuen zum Protokoll zu führen.
Dies wird durch die Notwendigkeit verstärkt, die Ladung der Kationenaustauschsäule in mehrere kleinere Lasten aufzuteilen. Nach dem Lysing von Zellen, der Klärung des Lysats und der Reinigung des Zielproteins durch IMAC, analysieren Sie die Proteinfraktionen mit SDS-Seite und Coomassie-Färbung. Die Spitzenfraktionen bündeln und das Becken über Nacht gegen zwei Liter Puffer D bei vier Grad Celsius dialysieren.
Am nächsten Tag die Probe von der Dialyse entfernen und bei 4.000 mal g für 10 Minuten zentrifugieren, um jeglichen Niederschlag zu entfernen. Die endgültige dialyzierte und geklärte Probe ist oft noch trübe, kann aber ohne weitere Verarbeitung auf die CEX-Säule aufgetragen werden. Vorbereiten Sie 20 Milliliter Kationenaustauschsäule, indem Sie sie mit drei Spaltenvolumen Puffer G waschen, dann mit drei Spaltenvolumen Puffer F.Next 20 Milliliter der Dialyseprobe auf eine endgültige Natriumchloridkonzentration von 100 Millimolar verdünnen, indem Sie 20 Milliliter Puffer E hinzufügen und die Probe auf die Austauschsäule auftragen.
Es ist wichtig, die kleine Menge der Probe auf einmal zu verdünnen und die verdünnten Proben sollten unmittelbar nach der Verdünnung auf die Säule aufgetragen werden, um die Ausfällung des Proteins zu begrenzen. Fahren Sie mit der Ladung der Säule mit frisch verdünnter Probe fort, da sich die vorherige Verdünnung dem Ende der Last nähert. Waschen Sie dann die Spalte auf Basisabsorption 280 mit Puffer F, die in der Regel drei Spaltenvolumen erfordern.
Elute das Protein aus der Säule mit einem 400 Milliliter Gradienten von Puffer F zu 65%Puffer G, sammeln das Eluent in sechs Milliliter Fraktionen. Sobald der Farbverlauf abgeschlossen ist, waschen Sie die Spalte weiter für ein zusätzliches 1,5-Säulen-Volumen von 65%Puffer G.Wählen Sie die positiven Brüche basierend auf SDS-Seite und Coomassie Blue Fleckenanalyse sowie Inspektion der UV-Spur des Chromatogramms. Dann bündeln Sie das Protein und verdauen Sie es mit His6 TEV Protease nach Manuskriptanweisungen.
Nach Verdauung und Dialyse das Protein auf eine 20-Milliliter-IMAC-Säule laden, die mit Puffer A mit drei Millilitern pro Minute ausgeglichen wird. Sammeln Sie während dieser Chromatographie sieben Milliliter-Fraktionen und waschen Sie die Säule mit insgesamt drei Spaltenvolumen des Puffers A oder bis die Basisabsorption erreicht ist. Elute das Zielprotein mit fünf Spalten Volumengradient von Puffer C von 0% bis 10% und sammeln sieben Milliliter-Fraktionen.
Identifizieren Sie dann die positiven Brüche mit der SDS-Seite. Bei der Analyse mit der SDS-Seite sollte das geklärte Lysat ein dunkles Band enthalten, das auf etwa 65 Kilodalton emigriert, was dem Fusionsprotein His6-MBP-tev-KRAS4b entspricht. Der mitausgedrückte FNTAb wandert auf 48 Kilodalton.
Der CEX-Schritt innerhalb der Reinigung ist entscheidend, da er das Ausmaß der Proteolyse reduziert und das vollständig verarbeitete Protein bereichert, aber der komplizierteste Teil des Protokolls ist. Ein typisches Ergebnis dieses Schritts hat mit dem KRAS4b-FMe einen prominenten Spitzenwert von drei, aber die Elutionsprofile können variabel sein. Intakte Massenanalysen mit ESIMS bestätigen die genaue Molekularmasse der Proteine und damit den relativen Anteil der Farnesylierung oder Carboxymethylierung.
Während typische Endlose einige nachweisbare KRAS4b-FARN enthielten, betrug dieser Anteil in Bezug auf die Spitzenhöhe dieser Analyse weniger als 15%. Native Massenanalyse wurde verwendet, um die Masse des KRAS4b an das BIP gebunden zu bestimmen. Das Probenlösungsmittel wurde gegen Ammoniumacetat ausgetauscht, um eine weichere Ionisation zu gewährleisten, die es dem nativen Komplex ermöglicht, intakt zu bleiben.
Die Wechselwirkung von KRAS4b-FMe und Liposomen wurde mit Oberflächen-Plasmonresonanz gemessen, um die Farnesylierung zu validieren und Carboxymethylierung erforderlich sind, damit KRAS4b-FMe an Membranen binden kann. Wie erwartet, KRAS4b-FMe gebunden an die Liposomen, während unverarbeitet KRAS4b nicht. Die Minimierung der Zeit, in der das Protein salzarmen Salz ausgesetzt ist, ist der kritischste Aspekt des Protokolls, der die Ausbeute beeinflusst.
Das Protein ist nur kurz bei dieser niedrigen Salzkonzentration nach der Verdünnung in Puffer E.Das Protein kann für eine Vielzahl von biophysikalischen Experimenten verwendet werden, die Membranmimetik wie Liposomen oder Nanoscheiben verwenden, um zu untersuchen, mit welchen Lipiden KRAS interagiert. Anhand dieser Daten können wir damit beginnen, zu extrapolieren, wie KRAS mit der Plasmamembran der Zelle interagiert. Mit gereinigtem KRAS-FMe konnten unsere Kollegen die Röntgenkristallstruktur von KRAS in Komplex mit einem Chaperon lösen, das spezifisch für die farnesylierte und methylierte Form dieses Proteins ist.
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Überblick
Diese Studie präsentiert ein Protokoll für die Hochausbeuteproduktion von farnesyliertem und carboxymethyliertem KRAS, das biophysikalische Messungen von Proteininteraktionen ermöglicht. Die Methode ermöglicht die Isolierung von korrekt verarbeitetem KRAS und erleichtert Experimente, die Säugerzellbedingungen nachahmen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biochemie
- Strukturbiologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- KRAS ist ein kritisches Protein, das an der Zellsignalübertragung beteiligt ist.
- Mutationen in KRAS sind bei verschiedenen Krebsarten weit verbreitet, insbesondere bei Bauchspeicheldrüsenkrebs.
- Farnesylierung ist für die membranständige Lokalisierung und Funktion von KRAS essentiell.
- Bestehende Methoden zur KRAS-Produktion haben Einschränkungen in Ausbeute und Authentizität.
Zweck der Studie
- Ein Protokoll zur Herstellung hoher Ausbeuten von farnesyliertem und carboxymethyliertem KRAS zu entwickeln.
- Biophysikalische und strukturbiologische Experimente mit KRAS in einer membranähnlichen Umgebung zu ermöglichen.
- Verbesserung der bisherigen Methoden der KRAS-Produktion.
Verwendete Methoden
- Isolierung und Reinigung von KRAS aus Insektenzellen.
- Charakterisierung von Proteinmodifikationen.
- Quantitative Messung der Proteinausbeute.
- Biophysikalische Assays zur Untersuchung von Proteininteraktionen.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll liefert drei bis fünf Milligramm KRAS pro Liter Expressionsmaterial.
- Erfolgreiche Produktion von authentisch modifiziertem KRAS, das für Experimente geeignet ist.
- Nachgewiesene Fähigkeit, eine Vielzahl von biophysikalischen Experimenten durchzuführen.
- Hervorhebung der Bedeutung von KRAS in der Krebsforschung.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Herstellung von KRAS.
- Hohe Ausbeuten ermöglichen umfangreiche experimentelle Anwendungen.
- Diese Arbeit trägt zum Verständnis der Rolle von KRAS in der Krebsbiologie bei.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Producing authentically processed KRAS4b enables physiologically relevant studies of oncogenic signaling and membrane interactions. High-yield purification supports scalable biophysical and structural assays for target validation. This approach de-risks downstream drug discovery by providing a disease-relevant system that mimics native KRAS membrane localization and function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of KRAS4b membrane association and effector binding in a fully processed state.
- Operational Value: Provides homogeneous protein for consistent biophysical readouts in target engagement studies.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by validating farnesylation and carboxymethylation as prerequisites for plasma membrane localization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated KRAS4b-FMe for liposome-based binding assays using surface plasmon resonance.
- Operational Value: Delivers milligram-scale yields suitable for high-throughput screening campaign inputs.
- Scientific Value: Enables preparation of membrane mimetics to study lipid specificity and compound effects on KRAS-membrane interactions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates structural biology efforts, such as X-ray crystallography of KRAS4b in complex with farnesylation-specific chaperones.
- Operational Value: Yields nucleotide-bound KRAS4b-GDP complexes confirmed by native mass spectrometry for mechanistic studies.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by linking post-translational processing to oncogenic signaling competence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by supplying authentic KRAS4b for hypothesis testing, assay development, and structural validation.
- Discovery Biology: Supports functional validation of KRAS4b effectors and GTPase cycling in a membrane-competent format.
- Screening: Enables liposome-based SPR assays to measure compound-induced changes in KRAS-membrane affinity.
- Analytics: Uses intact and native mass spectrometry to confirm farnesylation, carboxymethylation, and nucleotide binding status.
- Translational Research: Connects post-translational processing to membrane localization, a key determinant of KRAS signaling output.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other CAAX-box proteins via baculovirus swap, enabling platform-wide application across prenylated target families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target behavior through physiologically accurate post-translational modification.
- Operational Value: High-yield purification (3–5 mg/L) reduces material bottlenecks for extensive experimental campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false negatives in membrane-dependent assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of KRAS-targeted modalities based on authentic target engagement data.
Implementation Considerations
- Expertise in baculovirus expression and insect cell culture is required for recombinant protein production.
- Cation exchange chromatography demands precise buffer gradients and split-loading to prevent precipitation and proteolysis.
- Standardization across teams relies on consistent dialysis, clarification, and fraction analysis via SDS-PAGE and UV tracing.
- Adaptation to other prenylated proteins requires optimization of IMAC and CEX conditions based on protein-specific properties.
- Practical limitations include sensitivity to low-salt exposure during purification, which impacts yield and necessitates rapid processing.
