Universelles und effizientes Elektroporationsprotokoll für die Gentechnik von gastrointestinalen Organoiden
February 18th, 2020
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Elektroporationsmethode zur Transfektion von vier verschiedenen gastrointestinalen organoiden Entitäten mit größeren Plasmiden (bis zu 10 kB). Es kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden und benötigt keine umfangreiche Vorbereitung oder spezielle, kostenintensive Elektroporationspuffer.
Diese Methode ermöglicht eine effiziente Transfektion von 3D-Zellkulturen wie Organoiden. Verschiedene Anwendungen der Gentechnik können erleichtert werden. Das Protokoll ist universell und kann innerhalb eines Tages ausgeführt werden.
Es bedarf keiner umfangreichen Vorbereitung oder speziellen, kostenintensiven Elektroporationspuffer. Diese Transfektionsmethode wurde bei Tumoren und gesunden Organoiden demonstriert, kann aber auch an Sphäroide und 2D-Zellkultur angepasst werden. Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal durchführen, ist es wichtig, die Organoide wegen ihrer individuellen Proliferation und Reaktion auf Dissoziation mit Vorsicht zu behandeln.
Überwachen Sie sie während des gesamten Eingriffs mikroskopisch. Beginnen Sie mit der Vorwärmung von 48-Well-Platten bei 37 Grad Celsius für die Post-Elektroporation-Aussaat, dann bereiten Sie basal- und organoide kulturspezifische Medien nach Manuskriptanweisungen vor. Kultivieren Sie fünf Brunnen von Organoiden pro Elektroporationsprobe in einer 48-Well-Platte, bereiten Sie 230 Mikroliter Dissoziationsreagenz mit 10-Mikromolar Y-27632 pro Brunnen vor.
Überwachen Sie die Organoide unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Brunnen und dissoziieren Sie die Organoide mechanisch in der vorbereiteten Dissoziationsmischung. Fünf Brunnen pro Elektroporationsprobe in einem 15-Milliliter-Rohr bündeln.
Mischen Sie den Inhalt des Rohres durch Wirbeln und inkubieren Sie es für fünf bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, bis Cluster von 10 bis 15 Zellen auftreten, wobei die Dissoziation mit einem Mikroskop überprüft wird. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie bis zu 10 Milliliter Basalmedium ohne Antibiotika hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Rohr fünf Minuten lang mit 450 mal g, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit vier Milliliterelektroporationspuffer.
Zentrifugieren und entsorgen Sie den Überstand nach jeder Wäsche. Nach den Waschungen, setzen Sie das Organoidpellet in 100 Mikroliter Elektroporationspuffer mit 30 Mikrogramm Plasmid-DNA. Geben Sie die komplette DNA-Organoid-Mischung in eine Elektroporationsküvette.
Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Stellen Sie die Elektroporationsparameter ein, wie im Textmanuskript beschrieben, und tippen Sie mit einem Finger auf die Küvette, um die Zellen sanft zu mischen. Legen Sie die Küvette in die Küvettenkammer und drücken Sie die Impedanztaste am Elektroporator, um den Impedanzwert zu notieren.
Drücken Sie die Starttaste, um das Elektroporationsprogramm zu initiieren und die Werte der angezeigten Ströme, Spannungen und Energien zu steuern. Nach der Elektroporation sofort 500 Mikroliter Kulturmedium ohne Antibiotika in die Zellen geben und durch Pipetieren nach oben und unten mischen. Übertragen Sie die Probe in ein neues 15-Milliliter-Rohr und spülen Sie die Küvette mit Basalmedium, um die verbleibenden Zellen zu sammeln, und inkubieren Sie die Zellen dann 40 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 mal g für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 100 Mikroliter Kellermatrix und Samen 20-Mikroliter Tropfen in einer vorgewärmten 48-Well-Platte wieder aufhängen. Inkubieren Sie die Platte für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius für die Polymerisation und fügen Sie 250 Mikroliter Kulturmedium mit Y-27632 und CHIR99021 pro Brunnen ergänzt.
Um die Transfektionseffizienz zu bestimmen, überprüfen Sie die Fluoreszenz in der Transfektionskontrolle unter dem Mikroskop nach 24 bis 48 Stunden. Für die FACS-Analyse ernten Sie die Zellen wie zuvor beschrieben und verdauen Sie 10 bis 20 Minuten, bis einzelne Zellen vorhanden sind. Addieren Sie bis zu 10 Milliliter PBS und zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 mal g für fünf Minuten, dann aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
Um lebende Zellen zu unterscheiden, setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS wieder aus und fügen Sie einen geeigneten Antikörper oder Propidiumjodid hinzu. Mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie tippen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen mit 10 MilliliterPBS waschen, dann zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
Setzen Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter PBS wieder auf und filtern Sie die Suspension durch ein 100-Mikrometer-Sieb in ein FACS-Rohr. Analysieren Sie die Zellen mit einer FACS-Maschine mit der entsprechenden Gating-Strategie und bestimmen Sie die Transfektionseffizienz. Organoide von vier verschiedenen Krebsentitäten wurden mindestens dreimal mit 30 Mikrogramm eines kleinen Plasmids oder eines großen Plasmids elektropoiert.
Sie wurden mit Durchflusszytometrie 48 Stunden nach der Elektroporation analysiert und für Zellform, Einzelzellen, lebende Zellen und eGFP-Expression abgegrenzt. In allen vier organoiden Entitäten wurde das kleine Plasmid mit einer höheren Effizienz transfiziert als das größere. Die effizienteste Transfektion des kleinen Plasmids wurde bei PDAC-Organoiden mit 92,1%GFP-positiven Zellen erreicht, in der Erwägung, dass das große Plasmid mit einem Wirkungsgrad von 46,7% transfiziert wurde Das größere Plasmid wurde effizienter in CRC-Organoide mit einer mittleren Effizienz von 53,4% transfiziert, während das kleine Plasmid mit einem mittleren Wirkungsgrad von 84,3% transfiziert wurde. , die die niedrigste Transfektionseffizienz für beide Plasmide zeigte.
Als Beweis des Konzepts wurden menschliche normale Magenorganoide mit einem Plasmid, das für Cas9, GFP und 2sgRNAs für TP53 kodiert, elektropoiert. Klone wurden von der Nutlin3-Administration ausgewählt und der TP53-Knockout wurde durch Sequenzierung der Allele bestätigt. Wie wir mit den menschlichen Magenorganoiden demonstriert haben, ermöglicht eine effiziente Elektroporation verschiedene CRISPR Cas9-Basismanipulationen von Organoidkulturen, wie Knockout oder Knockins, so dass verschiedene Krankheiten modelliert werden können.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Elektroporationsmethode zur Transfektion von gastrointestinalen Organoiden mit größeren Plasmiden. Die Methode ist schnell und erfordert keine umfangreiche Vorbereitung oder kostspielige Puffer.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Gentechnik
Hintergrund
- Die Transfektion von 3D-Zellkulturen wie Organoiden ist herausfordernd.
- Effiziente Methoden werden für die genetische Manipulation benötigt.
- Dieses Protokoll ist auf verschiedene Organoid-Typen anwendbar.
- Sorgfältige Handhabung von Organoiden ist während des Verfahrens entscheidend.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Elektroporationsmethode für Organoide.
- Erleichterung der Gentechnik-Anwendungen in Organoid-Kulturen.
- Beurteilung der Transfektionseffizienz über verschiedene Organoid-Typen hinweg.
Verwendete Methoden
- Organoid-Dissoziation und Vorbereitung von Elektroporationsmischungen.
- Elektroporation mit spezifischen Parametern für Plasmid-DNA.
- Überwachung der Transfektionseffizienz mittels Fluoreszenz- und FACS-Analyse.
- Anwendung von CRISPR-Cas9 für Genbearbeitung in Organoiden.
Hauptergebnisse
- Höhere Transfektionseffizienz bei kleineren Plasmiden beobachtet.
- PDAC-Organoide zeigten die höchste Effizienz für kleine Plasmide.
- Gastrische Krebs-Organoide hatten die niedrigsten Transfektionsraten.
- Erfolgreiche Genbearbeitung wurde in normalen Magen-Organoiden demonstriert.
Schlussfolgerungen
- Die Elektroporationsmethode ist effektiv für verschiedene Organoid-Typen.
- Sie ermöglicht eine effiziente genetische Manipulation für Krankheitsmodellierung.
- Zukünftige Anwendungen können umfassendere CRISPR-basierte Techniken umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Efficient genetic engineering of gastrointestinal organoids is critical for target validation and preclinical modeling in oncology and gastroenterology pipelines. This electroporation protocol enables rapid, scalable transfection across multiple cancer organoid types without specialized buffers or extensive preparation, supporting lead identification and mechanistic de-risking. By delivering quantitative transfection efficiency data via FACS, the method enhances predictive confidence in organoid-based disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through efficient plasmid delivery in human colorectal, pancreatic, hepatic, and gastric cancer organoids.
- Operational Value: Supports functional target validation with high-efficiency transfection, demonstrated by up to 92.1% GFP-positive cells in PDAC organoids using small plasmids.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by allowing consistent genetic manipulation across organoid entities for pathway clarification and target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitatively measurable outputs via FACS analysis of eGFP expression, enabling reliable comparison of transfection conditions.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and reproducible across organoid types, supporting medium- to high-throughput screening workflows.
- Reagent Efficiency: Eliminates need for costly, specialized electroporation buffers, reducing operational complexity and cost per assay.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Enables CRISPR-Cas9-mediated knockout and knockin applications, as demonstrated by TP53 editing in normal stomach organoids, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Provides a reproducible method for generating genetically engineered organoids used in downstream validation and drug response studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by enabling efficient target modulation in disease-relevant systems prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, enabling iterative genetic engineering in organoid models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via efficient delivery of genetic constructs in primary-derived organoids.
- Screening: Enables assay standardization and quantitative readouts for evaluating genetic manipulation efficiency across conditions.
- Analytics: Delivers FACS-based transfection efficiency measurements that allow objective comparison of plasmid size, organoid type, and electroporation parameters.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical workflows by enabling stable genetic modifications for disease modeling and target validation.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform capability applicable across multiple organoid types and genetic engineering projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by enabling efficient, reproducible genetic engineering in gastrointestinal organoids.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through a one-day protocol requiring no special buffers or extensive cell preparation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing technical failure rates in organoid transfection and accelerating timelines for genetic model generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing reliable organoid-based systems for target modulation and pathway analysis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, dissociation, and handling to maintain viability during electroporation.
- Depends on access to electroporation cuvettes, a programmable electroporator, and FACS or fluorescence microscopy for efficiency readouts.
- Necessitates standardization of dissociation timing and plasmid concentration across organoid types to ensure consistent results.
- Adaptation may be needed for non-gastrointestinal organoids or spheroid systems based on varying dissociation sensitivity.
- Practical limitations include variability in transfection efficiency across organoid entities, with gastric cancer models showing lower efficiency for both small and large plasmids.
