Universelles und effizientes Elektroporationsprotokoll für die Gentechnik von gastrointestinalen Organoiden

Diese Methode ermöglicht eine effiziente Transfektion von 3D-Zellkulturen wie Organoiden. Verschiedene Anwendungen der Gentechnik können erleichtert werden. Das Protokoll ist universell und kann innerhalb eines Tages ausgeführt werden.

Es bedarf keiner umfangreichen Vorbereitung oder speziellen, kostenintensiven Elektroporationspuffer. Diese Transfektionsmethode wurde bei Tumoren und gesunden Organoiden demonstriert, kann aber auch an Sphäroide und 2D-Zellkultur angepasst werden. Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal durchführen, ist es wichtig, die Organoide wegen ihrer individuellen Proliferation und Reaktion auf Dissoziation mit Vorsicht zu behandeln.

Überwachen Sie sie während des gesamten Eingriffs mikroskopisch. Beginnen Sie mit der Vorwärmung von 48-Well-Platten bei 37 Grad Celsius für die Post-Elektroporation-Aussaat, dann bereiten Sie basal- und organoide kulturspezifische Medien nach Manuskriptanweisungen vor. Kultivieren Sie fünf Brunnen von Organoiden pro Elektroporationsprobe in einer 48-Well-Platte, bereiten Sie 230 Mikroliter Dissoziationsreagenz mit 10-Mikromolar Y-27632 pro Brunnen vor.

Überwachen Sie die Organoide unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Brunnen und dissoziieren Sie die Organoide mechanisch in der vorbereiteten Dissoziationsmischung. Fünf Brunnen pro Elektroporationsprobe in einem 15-Milliliter-Rohr bündeln.

Mischen Sie den Inhalt des Rohres durch Wirbeln und inkubieren Sie es für fünf bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, bis Cluster von 10 bis 15 Zellen auftreten, wobei die Dissoziation mit einem Mikroskop überprüft wird. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie bis zu 10 Milliliter Basalmedium ohne Antibiotika hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Rohr fünf Minuten lang mit 450 mal g, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit vier Milliliterelektroporationspuffer.

Zentrifugieren und entsorgen Sie den Überstand nach jeder Wäsche. Nach den Waschungen, setzen Sie das Organoidpellet in 100 Mikroliter Elektroporationspuffer mit 30 Mikrogramm Plasmid-DNA. Geben Sie die komplette DNA-Organoid-Mischung in eine Elektroporationsküvette.

Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Stellen Sie die Elektroporationsparameter ein, wie im Textmanuskript beschrieben, und tippen Sie mit einem Finger auf die Küvette, um die Zellen sanft zu mischen. Legen Sie die Küvette in die Küvettenkammer und drücken Sie die Impedanztaste am Elektroporator, um den Impedanzwert zu notieren.

Drücken Sie die Starttaste, um das Elektroporationsprogramm zu initiieren und die Werte der angezeigten Ströme, Spannungen und Energien zu steuern. Nach der Elektroporation sofort 500 Mikroliter Kulturmedium ohne Antibiotika in die Zellen geben und durch Pipetieren nach oben und unten mischen. Übertragen Sie die Probe in ein neues 15-Milliliter-Rohr und spülen Sie die Küvette mit Basalmedium, um die verbleibenden Zellen zu sammeln, und inkubieren Sie die Zellen dann 40 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 mal g für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 100 Mikroliter Kellermatrix und Samen 20-Mikroliter Tropfen in einer vorgewärmten 48-Well-Platte wieder aufhängen. Inkubieren Sie die Platte für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius für die Polymerisation und fügen Sie 250 Mikroliter Kulturmedium mit Y-27632 und CHIR99021 pro Brunnen ergänzt.

Um die Transfektionseffizienz zu bestimmen, überprüfen Sie die Fluoreszenz in der Transfektionskontrolle unter dem Mikroskop nach 24 bis 48 Stunden. Für die FACS-Analyse ernten Sie die Zellen wie zuvor beschrieben und verdauen Sie 10 bis 20 Minuten, bis einzelne Zellen vorhanden sind. Addieren Sie bis zu 10 Milliliter PBS und zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 mal g für fünf Minuten, dann aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.

Um lebende Zellen zu unterscheiden, setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS wieder aus und fügen Sie einen geeigneten Antikörper oder Propidiumjodid hinzu. Mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie tippen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen mit 10 MilliliterPBS waschen, dann zentrifugieren und den Überstand entsorgen.

Setzen Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter PBS wieder auf und filtern Sie die Suspension durch ein 100-Mikrometer-Sieb in ein FACS-Rohr. Analysieren Sie die Zellen mit einer FACS-Maschine mit der entsprechenden Gating-Strategie und bestimmen Sie die Transfektionseffizienz. Organoide von vier verschiedenen Krebsentitäten wurden mindestens dreimal mit 30 Mikrogramm eines kleinen Plasmids oder eines großen Plasmids elektropoiert.

Sie wurden mit Durchflusszytometrie 48 Stunden nach der Elektroporation analysiert und für Zellform, Einzelzellen, lebende Zellen und eGFP-Expression abgegrenzt. In allen vier organoiden Entitäten wurde das kleine Plasmid mit einer höheren Effizienz transfiziert als das größere. Die effizienteste Transfektion des kleinen Plasmids wurde bei PDAC-Organoiden mit 92,1%GFP-positiven Zellen erreicht, in der Erwägung, dass das große Plasmid mit einem Wirkungsgrad von 46,7% transfiziert wurde Das größere Plasmid wurde effizienter in CRC-Organoide mit einer mittleren Effizienz von 53,4% transfiziert, während das kleine Plasmid mit einem mittleren Wirkungsgrad von 84,3% transfiziert wurde. , die die niedrigste Transfektionseffizienz für beide Plasmide zeigte.

Als Beweis des Konzepts wurden menschliche normale Magenorganoide mit einem Plasmid, das für Cas9, GFP und 2sgRNAs für TP53 kodiert, elektropoiert. Klone wurden von der Nutlin3-Administration ausgewählt und der TP53-Knockout wurde durch Sequenzierung der Allele bestätigt. Wie wir mit den menschlichen Magenorganoiden demonstriert haben, ermöglicht eine effiziente Elektroporation verschiedene CRISPR Cas9-Basismanipulationen von Organoidkulturen, wie Knockout oder Knockins, so dass verschiedene Krankheiten modelliert werden können.