Messung der natürlichen Killerzell-vermittelten Zytotoxizität und Migration im Kontext von leberassoziierten Tumorzellen

Wir werden heute zwei Protokolle demonstrieren, die zeigen, wie man die Funktion der NK-Zellen untersucht. Es gibt zwei Schlüsselaspekte der NK-Zellfunktion, die in der Lage ist, Tumorzellen auszurotten und es ist in der Lage, in Tumor-Mikro-Umgebung zu migrieren. Diese beiden Protokolle zeigen wir NK-Zell-Fähigkeit, Tumorzellen auszurotten und es ist auch in der Lage, in Tumor-Mikro-Umgebung zu migrieren.

Die beiden Protokolle, die wir heute demonstrieren werden, sind einfach, erfordern keine Verwendung von Radioaktivität und können in den meisten Laboren etabliert werden, die die Fähigkeit haben, Molekularbiologie und Zellkulturarbeit zu leisten. Suresh Bugide und Suresh Chava, zwei Postdoktoranden in meinem Labor, werden diese beiden Protokolle heute demonstrieren. Zwei bewerten NK-Zell vermittelte Zytotoxizität mit LDH, zuerst wachsen eine menschliche Leberkrebszelllinie zu 70-80%Konfluenz in einer 100-Millimeter-Zellkultur Petrischale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.

Waschen Sie am Tag des Experiments die Kultur mit fünf Millilitern PBS, bevor Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,25% Trypsin EDTA behandeln, bis sich die Zellen vom Plattenboden gelöst haben. Wenn eine Einzelzellsuspension erhalten wurde, fügen Sie den Zellen 10 Milliliter Zellkulturmedium hinzu und übertragen Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein 15 Milliliter konisches Rohr. Waschen Sie das Zellpellet mit fünf Millilitern PBS, bevor Sie die Zellen mit einem Mal 10 bis zu den 5. Zellen pro Milliliter frischer Kulturmediumkonzentration wieder aufhängen.

Als nächstes samen 100 Mikroliter der Ziel-Menschlichen Leberkrebszellen pro Brunnen in Dreifach-Pro-Behandlungsbedingung in einer 96-Well-Platte und fügen Sie ein mal 10 zu den 5. menschlichen NK-Zellen in 100 Mikroliter medium zu jeder Zielzelle gut hinzu. Dann legen Sie die Platte in der Zellkultur Inkubator für drei Stunden. Am Ende der Inkubation pellet die Zellen durch Zentrifugation und überträgt 100 Mikroliter Überstand aus jedem Brunnen in einzelne Brunnen einer neuen 96-Wellplatte.

Fügen Sie 50 Mikroliter LDH-Substrat zu jedem Brunnen mit gründlichem Mischen und inkubieren Sie die Platte für 20 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation die Reaktion mit 50 Mikrolitern Stopplösung stoppen und sofort die Absorption eines Plattenlesers bei 490 und 680 Nanometern messen. Verwenden Sie dann die Formel, um die prozentuale NK-Zellzytotoxizität zu berechnen.

Zur Beurteilung der nk-Zell-vermittelten Zytotoxizität mit Calcein AM nach dem Anbau menschlicher Leberkrebszelllinienzellen zu einer 70-80%-Konfluenz, wie gezeigt, suspendieren die Zellen in drei Milliliters serumfreiem DMEM erneut und kennzeichnen die Zellen mit 1,5 Mikrolitern 10 Millimolar Calcein AM-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und die Zellen zwei Mal mit fünf MilliliterPBS pro Waschgang waschen. Setzen Sie die Zellen bei einer zeitgemäßen 10 bis 5. Zelle pro Milliliter Kulturmediumkonzentration wieder aus und fügen Sie jedem Brunnen einer 96-Well-Platte in Dreifacharbeit pro Behandlungszustand 100 Mikroliter Zellen hinzu.

Als nächstes, einmal 10 bis 5. menschliche NK-Zellen in 100 Mikroliter Kulturmedium zu jedem Brunnen der Zielzellen und legen Sie die Platte in der Zellkultur Inkubator für vier Stunden. Erfassen Sie nach dem Ende der Inkubation mindestens 10 verschiedene Bildfelder der Calcein AM-positiven Zellen für jede Replikation jeder Behandlungsbedingung auf einem Fluoreszenzmikroskop bei einer 10-fachen Vergrößerung. Berechnen Sie dann die prozentuale Zytotoxizität mit der Formel.

Um die NK-Zellmigration als Reaktion auf chemotaktische Reize zu messen, sammeln menschliche NK-Zellen aus einer 70-80%-Konfluentkultur und setzen die Zellen mit einer 2,5-mal 10-fach entitobiszur 6. Zelle pro Milliliter serumfreier NK-Zellkultur mittlerer Konzentration wieder aus. Als nächstes fügen Sie 600 Mikroliter serumfreies Medium, das die NK-Zellchemo-Attraktion von Interesse pro Brunnen enthält, und legen Sie einen Kultureinsatz mit einem Durchmesser von 6,5 Millimetern mit fünf Mikrometer Poren in jeden Brunnen des Mediums. Dann fügen Sie 100 Mikroliter NK-Zellen in das obere Fach jedes Einsatzes und legen Sie die Platte in der Zellkultur Inkubator für vier Stunden.

Übertragen Sie am Ende der Inkubation das gesamte Volumen der nicht haftenden migrierten Zellen vom Boden jedes Bohrplatzes in einzelne fünf Milliliter FACS-Röhren und fügen 50 Mikroliter einer vorgegebenen Anzahl von Durchflusszytometrie-Zählperlen in jedes Rohr ein. Anschließend bewerten Sie mit einem Durchflusszytometer jede Zellprobe gemäß den standardmäßigen zytometrischen Analyseprotokollen des Durchflusses und berechnen Sie die absolute Anzahl der migrierten NK-Zellen mit der Formel. ATF4-Knockdown reduziert die MIT NK-Zell vermittelte Zytotoxizität signifikant im Vergleich zu NK-Zellen, die unspezifische kurze Haarnadel-RNA exdrücken.

Nach der Färbung mit Calcein AM nimmt die Anzahl der lebensfähigen menschlichen Leberkrebszellen nach der Kokultur mit menschlichen NK-Zellen im Vergleich zu menschlichen Leberkrebszellen ab, die ohne NK-Zellen kultiviert werden. Wie erwartet, ATF4 Knockdown über kurze Haarnadel-RNA reduziert NK zellvermittelte Tötung von menschlichen Leberkrebszellen, wie durch eine größere Anzahl von Calcein AM-positive Zellen in diesen Kulturen belegt. Darüber hinaus wird eine signifikant höhere Menge an NK-Zellmigration als Reaktion auf Chemokin-haltiges Medium im Vergleich zu NK-Zellen beobachtet, die einem Kontrollmedium ohne Chemokin ausgesetzt sind.

Für NK-Zellzytotoxizität bewerten ist es wichtig, unsere Anstrengung und Zielverhältnisse und Inkubationszeit für jede Krebszelllinie zu standardisieren. Sobald Standards identifiziert und validiert sind, werden in vitro-Evaluierungen durch In-vivo-Mäuseexperimente ergänzt, um ihre Rolle bei der Ausrottung von Tumorzellen weiter zu bewerten.