Name: Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Lernen Sie die retrograde Markierung motorischer Neuronen in Drosophila-Embryonen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse neuronaler Morphogenese und Konnektivität.

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Wir danken den Mitgliedern des Kamiyama Lab für die Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von einem NIH R01 NS107558 (nach M.I., K.B. und D.K.) unterstützt.

1. Ausrüstung und Zubehör
<ol><li>Materialien für das Sammeln von Embryonen und die Ausbildung von Erwachsenen zum Eierlegen<ol>
<li>Bereiten Sie das Filtergerät vor, indem Sie ein 50 ml-Rohr abtrennen und ein Loch in der Kappe öffnen, um einen Netzfilter mit Poren von 100 m (Materialtabelle) zwischen Rohr und Kappe zu setzen. HINWEIS: Alternativ können Zellsiebe mit Poren von 100 m (Materialtabelle) für den Filtrationsschritt der Embryoentnahme verwendet werden.</li>
		<li>Agarplatten mit Traubenagar-Premix (Materialtabelle) nach den aufgeführten Anweisungen zu machen. Kurz dazu 1 Packung des Pulvers in 500 ml Raumtemperatur (RT, 23 °C) dH2O rühren und Mikrowelle das gelöste Gemisch zum kräftigen Kochen rühren. Nach dem Abkühlen auf 70 bis 75 °C die Mischung in Petrischalen (60 mm) gießen. Nachdem der Agar erstarrt ist, platten bei 4 °C lagern.</li>
		<li>Hefepaste vorbereiten, indem Sie aktive Trockenhefe (Materialtabelle) und Wasser zu einer Pastenkonsistenz mischen und bei 4 °C halten.</li>
		<li>Verwenden Sie Eiersammelkäfige (für 60 mm Petrischale, Tisch aus Materialien),die einen ausreichenden Luftstrom bieten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von Seziernadeln und Farbstoffinjektionsmikropipetten<ol>
<li>Bereiten Sie Farbstoff Injektion Mikropipette und Seziernadel aus der gleichen Kapillarschläuche mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm und einem Außendurchmesser von 1,2 mm(Materialtabelle). Ziehen Sie die Kapillarschläuche mit einem Mikropipette-Zieher bei 7% von 170 V maximaler Leistung (Materialtabelle), um eine scharfe Nadel mit einer Verjüngung von 0,4 cm Länge zu erstellen.</li>
		<li>Für die Farbinjektion stellen Sie die Mikropipette mit einer Mikropipette-Beveler (Tabelle der Materialien) durch eine Blasenabschrägungstechnik, die im Handbuch des Instruments beschrieben wird, ein.<ol>
<li>Kurz gesagt, tränken Sie den Schleifer mit einem Benetzungsmittel (Materialtabelle), um zu verhindern, dass das Wasser die Nadelspitze "zerreißt". Legen Sie die Nadel auf die Mikropipette-Klemme bei 25-30° und senken Sie die Spitze auf zwei Drittel des Radius aus der Mitte der Abschrägungsfläche heraus. Schleifen Sie die Nadel, während eine Spritze mit Schläuchen Luft in die Nadel drückt, um sicherzustellen, dass die Mikropipette frei von Glasspänen ist.</li>
			<li>Markieren Sie die Mikropipette mit einem feinspitzen permanenten Marker, um die Position der Öffnung an der Spitze nach dem Abschrägen anzuzeigen, da es schwierig ist, die schmale Öffnung der Mikropipette zu lokalisieren, die in einem Winkel gebildet wird.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung auf die Embryonenentnahme
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die erwachsenen Fliegen (20-40 Wild-Typ Canton-S oder weiße Fliegen), Männchen und Weibchen, in jungen (<7 Tage) und gesunden Bedingungen für die ideale Eiersammlung gehalten werden. HINWEIS: Um das Eierlegen zu stimulieren, werden fliegende fliegenin ihrem Eiersammelkäfig ein paar Tage vor der Eiersammlung auf Agarplatten trainiert, die mindestens einmal täglich mit Hefepaste übersät sind.</li>
</ol>3. Embryo-Inszenierung
<ol><li>Lassen Sie die Fliegen eier über Nacht legen (oder mindestens 15 h) bei RT, um die Embryonen bei 15 h AEL, d.h. Stadium 1618,zu sammeln, um die Dendritogenese der motorischen Neuronen aCC und RP3 zu sehen. Am Morgen, sammeln Sie den Teller mit den Eiern. HINWEIS: Die Embryonen bei 15 h AEL haben einen ausgeprägten 4-Kammer-Darm18. Für die Bildgebung folgen verschiedene Stadien ihren spezifischen morphologischen Kriterien und Alterungsbedingungen.</li>
	<li>Um die Embryonen zu sammeln, dechorionate die Eier auf dem Teller mit 50% Bleichmittel für 5 min gelegt.</li>
	<li>Sobald die Chorionen geklärt sind, gießen Sie den Inhalt der Platte durch das Filtrationsgerät oder Zellsieb, um die Embryonen zu isolieren. Mit einer Squeeze-Flasche Wasser, verdünnen Sie die Bleichmittel auf dem Teller und sammeln Sie so viele Embryonen wie möglich, indem Sie die Mischung in den Filter dekantieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen auf dem Filter 3x 4x mit mehr Wasser oder bis der Bleichgeruch ableitet. Entfernen Sie den Filter aus dem Gerät und waschen Sie die Embryonen auf eine andere saubere Platte mit Wasser. Dekantieren Sie das Wasser von der neuen Platte, auf der sich die Embryonen befinden.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Glasrutsche vor, indem Sie sie mit zwei Schichten Vinylband in der Mitte bedecken und ein Rechteck bilden. Schneiden Sie einen rechteckigen Pool mit einer Rasierklinge aus dem Band. Legen Sie einen dünnen Streifen doppelseitigen Band in Richtung des oberen Endes des Pools, dies ist, wo die Embryonen platziert werden, wie in Abbildung 1gezeigt.</li>
	<li>Mit feinen Zangen wählen Sie einzeln 5-10 Embryonen bei 15 h AEL aus und legen Sie sie auf das doppelseitige Band mit der dorsalen Seite nach oben. Fügen Sie die Seinder ringer saline19 in den Sezierpool, um die Embryonen vor der Austrocknung zu schützen (Abbildung 1).</li>
</ol>4. Zerlegung und Färbung
<ol><li>Mit einer Glasnadel unter einem Sezieren mikroskop (Tabelle der Materialien), schneiden Sie durch die Mittellinie eines einzelnen Embryos an seiner Oberfläche von seinem hinteren bis seinem vorderen Ende. Ziehen Sie dann den Embryo aus der Vitelline-Membran aus dem Band auf das Glas (in Abbildung 1verpackt). Achten Sie darauf, das innere Gewebe des Embryos nicht zu beschädigen.</li>
	<li>Drehen Sie das Epithelgewebe von der Mitte und befestigen Sie die epidermale Kante an der Oberfläche des Glasschlittens(Abbildung 1, Einschub).</li>
	<li>Mit einer röhrengebundenen Nadel mit einer Spitzenöffnung von 300 m (vorbereitet durch Brechen der dünnen Spitze einer Seziernadel), saugen oder blasen Sie Luft, um die dorsalen Längstrachestämme sowie alle verbleibenden Eingeweide zu lösen und zu entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Saline (PBS), um die Embryonen für 5 min bei RT zu fixieren. Waschen Sie die Embryonen 3x mit PBS.</li>
	<li>Färben Sie die Embryonen mit 1 l Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper, konjugiert mit Cyanin-3-Farbstoff (Anti-HRP Cy3)(Materialtabelle)in 200 l PBS für 1 h. Waschen Sie die Embryonen nach der Färbung mit PBS 3x. HINWEIS: Der Farbstoff von Anti-HRP kann basierend auf den lipophilen Farbstoffen der Wahl für die Injektion geändert werden.</li>
</ol>5. Füllung der Injektions-Mikropipette
<ol><li>Lipophile Farbstoffe (5 mg/ml DiO oder DiD, Materialtabelle)in einer 1:10-Mischung aus Ethanol:Pflanzenöl vor Gebrauch auf 60 °C erhitzen.</li>
	<li>Bereiten Sie einen ölgelösten Farbstoffschlitten für die Injektionsmikropipette vor. Legen Sie die Mikropipette in den Kapillarhalter(Abbildung 2, #1). Passen Sie mit dem Mikromanipulator (Materialtabelle) die Mikropipette so an, dass sie sich über dem Farbschlitten befindet. Passen Sie dann die Bühne an, um die Mikropipette auf den Farbstoff zu legen (Abbildung 2, #2).</li>
	<li>Um die Mikropipette zu füllen, verwenden Sie einen Mikroinjektor (Materialtabelle) (Abbildung 2, #3). Sammeln Sie den Farbstoff in der Mikropipette, indem Sie den Pi (Injektionsdruck) zwischen 200-500 hPa (Hektopascal), den Ti (Injektionszeit) zwischen 0,1 ,0,5 s und Pc (Kompensationsdruck) auf 0 hPa für 5 min(Abbildung 2, #4) einstellen.</li>
	<li>Sobald der Farbstoff gesammelt wurde, entfernen Sie den Farbstoffschlitten und legen Sie die Probe auf die Mikroskopstufe. Als nächstes erhöhen Sie die Pc auf einen Bereich von 20 bis 60 hPa, bevor Sie die Mikropipette in die Probe senken, um eine Kontamination von PBS durch Kapillarwirkung zu verhindern.</li>
</ol>6. Farbinjektion in Neuronen
<ol><li>Suchen Sie den Embryo in der Mitte mit dem Mikroskop mit 10x Objektivlinse (Materialtabelle) und richten Sie die Mikropipette mit dem Embryo aus. HINWEIS: Die Größe des Farbstofftröpfchens kann durch Ändern des Pi oder der Größe der Öffnung der Mikropipettespitze angepasst werden. Das Tröpfchen sollte 10 bis 20 m betragen, was ungefähr der Breite von 1 Muskel entspricht.</li>
	<li>Ändern Sie die Objektivlinse in eine 40-fache Linse (Materialtabelle) und tauchen Sie die Linse in PBS ein, um den Embryo zu sehen.<ol>
<li>Verwenden Sie Fluoreszenzmikroskopie, um die neuronale Morphologie zu überprüfen, die durch Anti-HRP Cy3 gekennzeichnet ist, und bestimmen Sie die Injektionsstelle.</li>
		<li>Verwenden Sie während der Injektion die Hellfeldmikroskopie, um das Farbstofftröpfchen zu sehen. Wenn der Embryo im Fokus ist, ändern Sie die Position der Mikropipette, um sanften Kontakt mit der Spitze des Axons von Interesse (z. B. aCC, RP3) zu machen.</li>
		<li>Lassen Sie den Farbstoff in einem rechten Bauch (A2-A6) Hämi-Segment an der neuromuskulären Kreuzung von aCC oder RP3 (Abbildung 3) mit entweder DiD oder DiO, durch die Verwendung der Neuronen durch Anti-HRP Cy3 markiert. Mit der Handsteuerung (Maus; Abbildung 2, 5) den Farbstoff loslassen und die Mikropipette entfernen, nachdem sie den Farbstoff mit dem Mikromanipulator fallen gelassen hat, und bewegen Sie sich auf die nächste Injektionsstelle. HINWEIS: Im Gegensatz zu anderen Farbstoffen (z. B. Luzifergelb, Kalkein), die sich durch Spaltknoten in benachbarte Zellen ausbreiten, assoziieren lipophile Farbstoffe mit Zellmembranen und übertragen sich nicht auf Nachbarn. Aufgrund der relativ großen Größe des Farbstofftröpfchens führt diese Technik jedoch auch zur Kennzeichnung der Partnermuskeln (Abbildung 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe bei RT für 1 h nach Farbstoff-Tropfen vor der Bildgebung. HINWEIS: Das Protokoll kann hier vor der Montage angehalten werden, und die Probe kann über Nacht bei 4 °C aufbewahrt werden. Lipophile Farbstoffe können auch mit Iontophorese geliefert werden, wenn ein intrazellulärer direkt gekoppelter (DC) Verstärker leicht verfügbar ist20.</li>
</ol>7. Bildgebung mit konfokaler Mikroskop
<ol><li>Entfernen Sie das doppelseitige Klebeband und das Vinylband mit Hilfe von Zangen von der Glasrutsche.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Abdeckschlupf (22 x 22 mm2 Nr.1 Deckglas) mit einer kleinen Menge Vakuumfett (Materialtabelle) an den vier Ecken vor und legen Sie ihn sorgfältig auf die Probe, um Luftblasen zu vermeiden. Entfernen Sie überschüssige PBS mit Task-Wischern.</li>
	<li>Drücken Sie den Deckelbeleg nach unten, um den Arbeitsabstand zwischen der Objektivlinse und der Probe anzupassen. Die Ränder des Deckelschlupfs vollständig mit Nagellack versiegeln.</li>
	<li>Bild bei 10- und 100-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskop.</li>
	<li>Verwenden Sie ImageJ-Software für die Verarbeitung von Rohbildern aus dem Mikroskop (Tabelle der Materialien). HINWEIS: Die Beobachtung muss innerhalb von 10 min nach der Montage für die besten Bilder beginnen. Andernfalls wird sich bei RT der Farbstoff auf Stellen neben der Injektionsstelle ausbreiten und unerwünschte Nimmer für die Bildgebung erzeugen. Um die Diffusion von Farbstoff zu verlangsamen, kann die Probe bei 4 °C für ein paar Stunden gelagert werden.</li>
</ol>

<ol><li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li>
<li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%3A+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62(2012).</li>
<li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li>
<li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347(2009).</li>
<li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348(2009).</li>
<li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li>
<li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li>
<li>Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrero-Mart%C3%ADnez%2C+FA+%22The+Sticky+Synapse%3A+Cell+Adhesion+Molecules+and+Their+Role+in+Synapse+Formation+and+Maintenance%22">The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance</a>. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).</li>
<li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li>
<li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li>
<li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia%3A+accumulation+and+function+of+Capricious%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li>
<li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin%2C+location%2C+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li>
<li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li>
<li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li>
<li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).</li>
<li>Drosophila Ringer's solution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2007 (4), (2007).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150(2013).</li>
<li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even-skipped%2C+acting+as+a+repressor%2C+regulates+axonal+projections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li>
<li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li>
<li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robo+and+Frazzled%2FDCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li>
<li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+a+motor+system%3A+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41(2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Verwendung von Farbstoffkennzeichnungen zur Untersuchung der neuronalen Morphologie hat mehrere Vorteile gegenüber genetischen Zelletikettierungstechniken. Die Färbeetikettierungstechnik kann den Zeitaufwand für die Etikettierung und Abbildung der Morphologien von motorischen Neuronen minimieren. Der Färbeetikettierungsprozess ist recht schnell, da er weniger als 2 h dauert und es uns ermöglicht, die Umrisse neuronaler Projektionen zu definieren. Alternativ kann man das aCC-Motorneuron visualisieren, indem man eine G...

Das embryonale motorische Neuronensystem von Drosophila bietet ein leistungsfähiges experimentelles Modell zur Analyse der Mechanismen, die der Entwicklung des Zentralnervensystems (ZNS)1,2,3zugrunde liegen. Das motorische Neuronensystem ist für biochemische, genetische, bildgebende und elektrophysiologische Techniken zugänglich. Mit den Techniken können genetische Manipulationen und funktionelle Analysen auf der Ebene der einzelnen motorischen Neuronen2,4,5,6durchgeführt werden.
Während der frühen Entwicklung des Nervensystems, Neuroblasten teilen und erzeugen eine große Anzahl von Glia und Neuronen. Die räumlich-zeitliche Beziehung zwischen der Delamination und dem Genexpressionsprofil von Neuroblasten wurde zuvor im Detail untersucht7,8,9. Im Falle des motorischen Neuronsystems wurde die Bildung embryonaler neuromuskulärer Knoten (NMJ) mit dem aCC (vordere Eckzelle), RP2 (Rohgarnelen 2) und RP5 Motorneuronen2,10ausgiebig untersucht. Wenn das RP5-Motorneuron beispielsweise eine entstehende synaptische Verbindung bildet, werden die präsynaptischen und postsynaptischen Filopodia11,12,13vermischt. Eine solche direkte zelluläre Kommunikation ist entscheidend, um die NMJ-Bildung zu initiieren. Im Gegensatz zu dem, was wir über die peripheren Nervenzweige wissen, ist unser Wissen darüber, wie motorische Dendriten eine synaptische Konnektivität innerhalb des ZNS initiieren, immer noch primitiv.
In diesem Bericht stellen wir eine Technik vor, die eine retrograde Kennzeichnung von motorischen Neuronen in Embryonen mittels mikropipettevermittelter Abgabe lipophiler Farbstoffe ermöglicht. Diese Technik ermöglicht es uns, die 38 motorischen Neuronen zu verfolgen, die jede der 30 Körperwandmuskeln in einem Hemi-Segment bei 15 h nach Dereiablage (AEL)14innervieren. Mit dieser Technik hat unsere Gruppe zahlreiche Funktionsverstärkungs-/Funktionsverlust-Allele15,16,17gründlich untersucht. Wir haben vor kurzem die molekularen Mechanismen entwirrt, die die Initiierung der motorischen Dendritenkonnektivität vorantreiben, und gezeigt, dass eine Dscam1-Dock-Pak-Interaktion den Ort des Dendritenauswachsens im aCC-Motorneuron17definiert. Im Allgemeinen ist diese Technik anpassungsfähig für die phänotypische Analyse von embryonalen motorischen Neuronen in wilden Typ- oder mutierten Stämmen, was unsere Fähigkeit verbessert, neue Einblicke in das funktionelle Design des Drosophila-Nervensystems zu geben.

<table><tbody><tr><td>10x Objektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan</td></tr><tr><td>40x Wasser-Immersionsobjektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td>NIR Apo</td></tr><tr><td>Kapillarschlauch</td><td>Frederick Haer& Co</td><td>27-31-1</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td>Dragonfly Spinning Disk Konfokaleinheit</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Corning</td><td></td><td>22x22 mm Quadrat #1</td></tr><tr><td>DiD</td><td>ThermoFisher</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>ThermoFisher</td><td>V22888</td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>ThermoFisher</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>SMZ-U</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Hochvakuumfett</td><td>Fisher Sci.</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Eierauffangkäfig</td><td>FlyStuff</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 5247</td><td>Eppendorf</td><td>abgekündigt</td><td>FemtoJet 4i (Kat.-Nr. 5252000021)</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Bildverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten-Anfaser</td><td>Sutter</td><td>BV-10-B</td><td></td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Trauben-Agar-Pulver Premix-Pakete</td><td>FlyStuff</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Nylon-Netzfilter</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% Lösung, EM-Qualität</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>Alle EM-Qualitäten</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td>Verkauft auf sigmaaldrich, boxed 10x solution</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>146 4510</td><td>Netzmittel</td></tr><tr><td>Aufrechtes Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Eclipse Ci mit LED-Lichtquelle</td></tr><tr><td>Vinyl Isolierband</td><td>Scotch</td><td>6143</td><td></td></tr><tr><td>VWR Zellsiebe</td><td>VWR</td><td>10199-659</td><td></td></tr><tr><td>Hefe</td><td>FlyStuff</td><td>62-103</td><td>Aktive Trockenhefe (RED STAR)</td></tr></tbody></table>

retrograde tracing von drosophila embryonal motor neuronen mit lipophilen fluoreszierenden farbstoffen

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Wir beschreiben eine Technik zur retrograden Kennzeichnung von motorischen Neuronen in Drosophila. Wir verwenden einen ölaufgelösten lipophilen Farbstoff und liefern ein kleines Tröpfchen an ein embryonales Filetpräparat durch einen Mikroinjektor. Jedes Motorneuron, dessen Membran vom Tröpfchen kontaktiert wird, kann dann schnell beschriftet werden. Einzelne Motorneuronen werden kontinuierlich beschriftet, so dass feine Strukturdetails klar visualisiert werden können. Da lipophile Farbstoffe in verschiedenen Farben erhältlich sind, bietet die Technik auch ein Mittel, um benachbarte Neuronen in mehrfarbig beschriftet zu bekommen. Diese Tracing-Technik ist daher nützlich für die Untersuchung der neuronalen Morphogenese und synaptischen Konnektivität im motorischen Neuronensystem von Drosophila.

Ein repräsentatives Bild der motorischen Neuronen aCC und RP3 ist in Abbildung 3C dargestellt, um die mehrfarbige Kennzeichnung von motorischen Neuronen bei 15 h AEL zu demonstrieren. Ihre dendritischen Morphologien sind weitgehend invariant zwischen Embryonen. Das mit Anti-HRP-Antikörpern erhaltene Färbemuster ist grau dargestellt. Ein kleines Tröpfchen DiO oder DiD wurde auf dem NMJ von Muskel 1 bzw. 6/7 abgelagert. Abbildung 4 zeigt die Fähig...

Wir beschreiben eine Methode zur retrograden Rückverfolgung der embryonalen motorischen Neuronen Von Drosophila mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoffen.

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Die in diesem Protokoll beschriebene Tracing-Technik hilft uns, neuronale Morphogenese zu studieren und die Konnektivität im motorischen Neuronensystem von Drosophila zu schnappen. Der lipophile Farbstoff kann schnell auf jeden Teil der Zellmembran mit einer extrem hohen Dichte diffundieren. Aus diesem Grund löst unser Protokoll effizient, Strukturen eines markierten Neurons zu finden.Wenn ein Axonterminal mit einer Injektionsmikropipette zugänglich ist, könnte diese Technik auf jedes Neuron in den Larven- und Erwachsenenstadien von Fliegen oder in anderen Organismen angewendet werden. Wenn Sie keine Erfahrung mit der Sezieren oder Verwendung eines Mikroinjektors haben, der die Operation an der Probe präzise, kann dies eine Herausforderung darstellen. Das Verständnis der Anatomie des Embryos, wird mit Anleitung zu richtigen Portionierung von Werkzeugen helfen, um Sezieren oder eine Dinjektion durchzuführen.Um zu beginnen, vorzubereiten und Layout alle Embryo-Sammlung Materialien. Bereiten Sie das Filtergerät vor, indem Sie ein 50-Milliliter-Rohr abtrennen und ein Loch in der Kappe öffnen. Legen Sie dann einen Netzfilter mit 100 Mikrometer Poren zwischen rohr und kappe n.A. fest.Bereiten Sie die Farbstoffinjektionsmikropipette und Diesektionsnadel aus demselben Kapillarschlauch mit einem Innendurchmesser von 1,2 Millimetern vor. Ziehen Sie die Schläuche mit einer Mikropipette, Ziehen bei 7% von 170 Volt maximale Leistung, um eine scharfe Nadel mit einer Verjüngung von etwa 0,4 Zentimeter n Länge zu schaffen. Um die Farbstoffinjektionsmikropipette vorzubereiten, den Schleifer mit einem Benetzungsmittel einweichen und die Nadel auf die Mikropipetteklemme bei 25 bis 30 Grad legen.Senken Sie dann die Spitze auf zwei Drittel des Radius aus der Mitte der Abschrägungsfläche heraus. Schleifen Sie die Nadel, während eine Spritze mit Schläuchen Luft hineinschiebt. Markieren Sie die Mikropipette mit einem feinspitzen permanenten Marker, um die Position der Öffnung an der Spitze nach dem Abschrägen anzuzeigen, da es schwierig sein kann, die schmale Öffnung zu lokalisieren, die in einem Winkel gebildet wird.Lassen Sie die Fliegen Eier über Nacht bei Raumtemperatur legen und sammeln Sie die Pfeife mit den Eiern am Morgen. Um die Embryonen zu sammeln, entchloren Sie die Eier auf dem Teller mit 50% Bleichmittel für fünf Minuten. Sobald die Chlorionen geklärt sind, gießen Sie den Inhalt der Platte durch das Filtrationsgerät oder Zellsieb, um die Embryonen zu isolieren.Verwenden Sie eine Squeeze-Flasche Wasser, um die Bleichmittel auf dem Teller zu verdünnen und so viele Embryonen wie möglich zu sammeln, indem Sie die Mischung in den Filter dekantieren. Waschen Sie die Embryonen drei- bis viermal mit Wasser, bis sich der Bleichgeruch auflöst. Entfernen Sie den Filter aus dem Gerät und waschen Sie ihn auf eine andere saubere Platte mit Wasser.Dann dekantieren Sie das Wasser von der neuen Platte, auf der sich die Embryonen befinden. Verwenden Sie feine Zangen, um fünf bis zehn Embryonen bei 15 Stunden nach der Eiablage auszuwählen und legen Sie sie auf doppelseitiges Klebeband mit der dorsalen Seite nach oben. Fügen Sie Insektenringer-Salzin in den Sezierpool, um die Embryonen vor Austrocknung zu schützen.Verwenden Sie eine Glasnadel unter einem Seziermikroskop, um den Embryo aus der Middling-Membran aus dem Band auf das Glas zu ziehen, wobei darauf geachtet wird, dass das innere Gewebe des Embryos nicht beschädigt wird. Dann durchschneiden Sie die Mittellinie eines einzelnen Embryos an seiner Oberfläche von seinem hinteren zum vorderen Ende. Drehen Sie das Epithelgewebe von der Mitte und befestigen Sie die epidermale Kante an der Oberfläche des Glasschlittens.Verwenden Sie eine Rohr-verbundene Nadel mit einer Spitzenöffnung von etwa 300 Mikrometern, um Luft zu aspirieren oder zu blasen, um die dorsalen Längs-Trachealstämme sowie alle verbleibenden Eingeweide zu entfernen. Verwenden Sie 4%PFA und PBS, um die Embryonen für fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker zu fixieren. Dann waschen Sie sie dreimal mit PBS.Färben Sie die Embryonen mit einem Mikroliter Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper, der mit Cyanine3-Farbstoff konjugiert ist, und 200 Mikroliter PBS für eine Stunde auf dem Orbitalshaker. Und wiederholen Sie die Wähungen in PBS. Um die Injektionsmikropipette zu füllen, legen Sie sie in den Kapillarhalter.Als nächstes legen Sie den Farbstoff auf die Bühne und verwenden Sie den Mikromanipulator, um ihn über dem Schlitten zu positionieren. Passen Sie dann die Bühne an, um die Mikropipette auf den Farbstoff zu legen. Sammeln Sie den Farbstoff in der Mikropipette, indem Sie den Injektionsdruck auf 200 bis 500 Hektopascal, die Injektionszeit zwischen 0,1 und 0,5 Sekunden und den Kompensationsdruck auf Null für fünf Minuten einstellen.Sobald der Farbstoff gesammelt wurde, entfernen Sie den Farbstoffschlitten und legen Sie die Probe auf die Mikroskopstufe. Erhöhen Sie dann den Kompensationsdruck auf einen Bereich von 30 bis 60 Hektopascal und senken Sie die Mikropipette in die Probe. Verwenden Sie die 10-fache Objektivlinse, um den Embryo zu lokalisieren und die Mikropipette mit dem Embryo auszurichten.Ändern Sie die Objektivlinse in eine 40-fache Linse. Und tauchen Sie die Linse in die PBS. Verwenden Sie Fluoreszenzmikroskopie, um die neuronale Morphologie zu überprüfen, die durch Anti-HRP Cy3 gekennzeichnet ist, und bestimmen Sie die Injektionsstelle.Wenn der Embryo im Fokus ist, ändern Sie die Position der Mikropipette, um sanften Kontakt mit der Spitze des Axons von Interesse zu machen. Verwenden Sie dann die Hellfeldmikroskopie während der Injektion, um das Farbstofftröpfchen zu sehen. Lassen Sie den Farbstoff im rechten Bauchhemisegment an der neuromuskulären Kreuzung von aCC oder RP3 entweder mit DiD oder DiO fallen.Verwenden Sie die Handsteuerung, um den Farbstoff loszulassen und die Mikropipette zu entfernen. Fahren Sie dann zur nächsten Injektionsstelle. Inkubieren Sie die Probe für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker vor der Bildgebung.Entfernen Sie die Bänder mit feinen Zangen von der Glasrutsche. Um die Probe zu montieren, bereiten Sie einen Abdeckschlupf mit einer kleinen Menge Vakuumfett an den vier Ecken vor. Legen Sie es vorsichtig auf die Probe, um sicherzustellen, dass Luftblasen zu vermeiden.Drücken Sie den Deckelbeleg nach unten, um den Abstand von der Probe anzupassen, um den Arbeitsabstand zwischen der Objektivlinse und dem Dia zu ermöglichen. Entfernen Sie überschüssige PBS mit Aufgabentüchern. Die Ränder des Deckelschlupfs vollständig mit Nagellack versiegeln.Bild bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskop und verarbeiten die Bilder mit der imageJ-Software. Dieses Protokoll wurde verwendet, um das aCC Motorneuron innervating Muskel eins und die RP3 Motor Neuron innervating Muskeln sechs und sieben retrograd. Dendritische Zweige aus den Motorneuronen ACC und RP3 weisen eine große Überlappung auf.Beide Neuronen sind bipolar und stellen zwei verschiedene Populationen von Dendriten her. Um die quantitativen Fähigkeiten dieser Methode zu demonstrieren, wurde die Gesamtzahl der Dendritenspitzen in Wildtyp- und Dscam1-Mutanten gezählt. Die ipsilateralen Dendriten von aCC werden für den wilden Typ gezeigt, aber nur wenige ipsilaterale Dendriten wurden für die Dscam1 Mutant beobachtet.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Größe des Farbstofftröpfchens entscheidend ist, die etwa 10 bis 20 Mikrometer beträgt. Testen Sie die Größe auf dem doppelseitigen Band, und wenden Sie sie dann auf die Injektionsstelle an. Mit diesem Verfahren können wir die fotoschaltbare Eigenschaft der DiD-Sonde nutzen, um hochauflösende Bilder der Plasmamembran zu erhalten.Auf diese Weise können wir die ultrastrukturelle Charakterisierung der synaptischen Membranen an der neuromuskulären Kreuzung untersuchen. Wir haben den Klick gemacht. Wir führten eine phänotypische Analyse der aCC Dendriten in mutierter Sorte durch und entdecken, dass eine Dscam1-Dock-Pak-Injektion die Stelle des Dendritenauswachsens in aCC definiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschriebenen strukturellen Merkmale der Glia-neuromuskuläre Synapsen in einem Roman Inside-out Gewebe Vorbereitung der Live-Larven unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen mit der konfokalen Mikroskopie. Wir gekennzeichnet leben Neuronenendigungen mit fluoreszierenden primären Antikörper gegen HRP und auch visualisiert die perisynaptic Raum mit fluoreszierenden Dextrane.

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Untersuchung des synaptischen Vesikelrecyclings an neuromuskulären Verbindungen in Channelrhodopsin-exprimierenden Drosophila-Larven unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs. Blaues Licht aktiviert die Kanalrhodopsine, was zu Kalziumeinstrom und synaptischer Vesikelexozytose führt. Der Farbstoff integriert sich in die neuronalen Membranen und wird während der Endozytose internalisiert, was zu einer verstärkten Fluoreszenz führt. Eine weitere...

Analyse des synaptischen Vesikelrecyclings und der Aufnahme von Fluoreszenzfarbstoffen in Drosophila-Larven

Quelle: Inal, M. A. et. al., Retrograde Verfolgung von Drosophila embryonalen Motoneuronen unter Verwendung lipophiler fluoreszierender Farbstoffe. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die Methode der retrograden Markierung von Drosophila Motoneuronen unter Verwendung lipophiler Farbstoffe. Der Farbstoff dringt in das Axon ein, wandert rückwärts und markiert die Neuronen grün, was eine detaillierte Visualisierung ihrer Morphologie und Projektionen unter einem konfokalen Mikroskop ermöglicht.

Retrograde Markierung von Drosophila-Motoneuronen mit fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen

Quelle: Guan, W., et. al. Visualisieren Sie Drosophila Bein-Motoneuronen-Axone durch die adulte Schuppenschicht. J. vis. exp. (2018) Dieses Video zeigt die Bildgebung von Drosophila Beinen mit grün fluoreszierenden Protein-exprimierenden Motoneuronen mittels konfokaler Mikroskopie. Ein Laser und zwei Detektoren erfassen die Autofluoreszenz von GFP und Nagelhaut. Die Bilder werden verarbeitet, indem Kanäle geteilt, Autofluoreszenz subtrahiert und zu einem farbigen Kompositbild zusammengeführt...

Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Motoneuronen in einem adulten Drosophila-Bein

Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung der axonalen targeting mit ein fluoreszierendes Protein in Erwachsenen Beinen von Drosophila durch Fixierung, Montage, imaging und Post-Bildgebung Schritte.

Drosophila Bein Motoneuronen Axone durch die Erwachsenen Nagelhaut zu visualisieren

Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

Lernen Sie die retrograde Markierung motorischer Neuronen in Drosophila-Embryonen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse neuronaler Morphogenese und Konnektivität.

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

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