Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Kalziumaktivitätsmuster mit der Genexpression auf Einzelzellebene zu korrelieren, was Forscher in die Lage versetzt, neue Fragen über die Beziehungen zwischen diesen beiden Merkmalen zu untersuchen. Im Gegensatz zu früheren Ansätzen, die in der Regel ganze Gewebe untersuchen, zoomt unsere Technik auf die Einzelzellebene, so dass wir zellautonome Beziehungen zwischen Kalziumaktivität und Genexpression bewerten können. Beginnen Sie mit der UV-Sterilisation von zwei 35-Millimeter-Kunststoff-Petrischalen und einer 35-Millimeter-Zellkulturschale für ca. 30 Minuten.

In der laminaren Durchflusshaube werden je zwei 50 Milliliter Kunststoffkonische Röhren, eine UV-sterilisierte Petrischale und die UV-sterilisierte Zellkulturschale mit je zwei Millilitern von zwei Millimolaren Calciumlösung geliefert. Fügen Sie der anderen UV-sterilisierten Petrischale zwei Milliliter Kalzium- und Magnesiumfreie Lösung hinzu und füllen Sie zwei 100-Millimeter-Kunststoff-Petrischalen und eine 35-Millimeter-Kunststoff-Petrischale mit 0,1X MMR, ergänzt mit Gentamicin. Dann füllen Sie eine 60 Millimeter Kunststoff Petrischale mit 70% Ethanol.

Unmittelbar vor der Zerlegung 0,01 Gramm kollagenes B in eine Röhre Mitkalziumlösung mischen. Fügen Sie die Lösung zu einer neuen 60-Millimeter-Kunststoff-Petrischale hinzu und verwenden Sie ein Sezierenvonmikroskop, um Embryonen des gewünschten Entwicklungsstadiums zu identifizieren. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um mindestens sechs geeignete Embryonen in eine 100-Millimeter-Platte mit MMR plus Gentamicin zu bewegen.

Dann einen Embryo von der Halteplatte in die zweite 100-Millimeter-Platte mMR plus Gentamicin bewegen und diese Sezierplatte unter das Mikroskop stellen. Mit einem Paar stumpfer Zangen, um den Embryo zu stabilisieren, schälen Sie vorsichtig die Vitelline-Membran, die den Embryo umgibt, mit einem Paar feiner Zange ab. Wenn die gesamte Membran entfernt wurde, verwenden Sie die feinen Zangen, um den Embryo entlang der vorderen hinteren Achse zu kneifen, um die dorsalen und ventralen Bereiche zu trennen.

Verwenden Sie die neue sterile Transferpipette, um den dorsalen Teil für ein bis zwei Minuten auf die 60-Millimeter-Platte der kollagenen Lösung zu übertragen, bevor Sie die Probe vorsichtig zurück auf die Sezierplatte übertragen. Um die Zerlegung abzuschließen, entfernen Sie sorgfältig alle Reste der endodermalen und mesodermalen Kontamination aus dem mutmaßlichen neuronalen Gewebe des Ektoderms und übertragen Sie das Explant vorsichtig auf die 35-Millimeter-Platte der Calciumlösung. Wenn drei weitere Explanten gesammelt wurden, verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um alle vier Expflanzen auf die 35-Millimeter-Platte mit Kalzium- und Magnesium-freien Lösungen zu übertragen, wobei darauf geachtet wird, dass kein Kontakt zwischen den Explants und der Luftwasserschnittstelle besteht.

Dann wirbeln Sie die Schale sanft, so dass sich alle Explanten in der Mitte der Platte bündeln und die Proben für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, damit sich die Gewebe lösen können. Während dieser Inkubation die letzten beiden Embryonen mit Gentamicin auf die zweite Schale von MMR übertragen und die Schale bedecken, damit sich diese Proben ungestört entwickeln können. Verwenden Sie am Ende der Inkubation Superkleber, um einen mikro-regierten Deckelschlupf an der Unterseite der 35-Millimeter-Zellkulturschale zu befestigen und verwenden Sie eine P100-Mikropipette, um die dissoziierten Explants zu sammeln.

Halten Sie die Pipette in einem flachen Winkel nahe an der Oberfläche der Zellkulturschale, positionieren Sie die Pipettenspitze in der Ecke des Gitters nach innen und vertreiben Sie die Zellaufhängung fest über den gerasterten Bereich. Im Idealfall setzen sich die Zellen in einem engen, dichten Cluster ab. Lassen Sie die Zellen eine Stunde bei Raumtemperatur an der Platte haften.

Während sich die Zellen absetzen, bestimmen und erfassen Sie das Entwicklungsstadium der Geschwisterkontrollembryonen. Am Ende der Inkubation die Probenschale an einen lichtgeschützten Ort bewegen und 100 Mikroliter Lösung vom Rand der Schale ansaugen. Mischen Sie diese Lösung mit sieben Mikrolitern einer frisch zubereiteten Fluo-4 AM Pluronic F127 Säurelösung mit Auf- und Abpipetten, bevor Sie das volle Volumen in die Probenschale zurückgeben.

Wirbeln Sie sanft, um die Platte mit Aluminiumfolie zu mischen und zu bedecken. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur einen Milliliter des Explant-Kultur-Überstandes durch drei Milliliter frische zwei Millimolar Kalziumlösung ersetzen. Dann ersetzen Sie drei Milliliter Überstand durch drei Milliliter frische Kalziumlösung zwei weitere Male.

Legen Sie die Probenplatte für die Kalziumaktivitäts-Bildgebung innerhalb der Explanten auf die Bühne eines invertierten konfokalen Mikroskops, das vor Umgebungslichteinwirkung geschützt ist, und verwenden Sie einen Marker, um den vorderen Punkt der Platte zu beschriften, so dass das gleiche Sichtfeld bei nachfolgenden Bildgebungssitzungen gefunden werden kann. Verwenden Sie die 10- und 20-fachen Ziele, um eine Probe unter dem Mikroskop zu lokalisieren und ein geeignetes Sichtfeld auszuwählen, das zelldicht, aber nicht so dicht ist, dass die Zellen verklumpt oder schwer einzeln zu unterscheiden sind. Passen Sie den Mikroskopfokus so an, dass der gittergeregelte Abdeckungsslip sichtbar ist, und ändern Sie das ursprüngliche Sichtfeld, bis sich bei Bedarf eine identifizierbare Zahl im Rahmen befindet.

Erhalten Sie ein helles Feldbild des ausgewählten Sichtfeldes mit dem gittergeregelten Deckblatt im Fokus und einem hellen Feldbild des ausgewählten Sichtfeldes mit den Zellen im Fokus. Ohne ein klares Bild des gerasterten Coverslips und des Sichtfeldes können Sie Ihre Zellen nicht mit denen in den Fischbildern registrieren, die Sie später generieren werden. Dann beleuchten Sie die Proben mit einem 488 Nanometer Laser.

Ändern Sie für ein zweistündiges Bild die Bildverarbeitungskonfiguration, um 901 Frames mit einer Scanzeit von 3,93 Sekunden in einem Intervall von acht Sekunden aufzuzeichnen, bevor Sie die Konfiguration ausführen, um das Bild zu erfassen. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus der Mikroskopstufe und ersetzen Sie den Kulturüberstand durch einen Milliliter 1X MEMFA für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur, wobei Sie darauf achten, die Entwicklungsphase der Geschwisterkontrollembryonen zu Beginn der Inkubation aufzuzeichnen. Die Visualisierung eines zusammengesetzten Diagramms, das Spuren für alle in einem Experiment aufgezeichneten Zellen enthält, zeigt, inwieweit Massen- oder Populationsmessungen nuanciertere Muster des Spiking-Verhaltens verschleiern können.

Wenn die aufgezeichneten Profile einzelner Zellen isoliert sind, können Beispiele für die unregelmäßige Spiking-Aktivität, die für neuronale Vorläuferzellen charakteristisch ist, eindeutig identifiziert werden. Um diese Komplexität zu quantifizieren, können verschiedene Datenanalysemethoden angewendet werden, einschließlich verschiedener Parameter, um eine Spitze zu definieren. Wenn die Platten grob gehandhabt werden oder die Wässen während der fluoreszierenden In-situ-Hybridisierung zu stark ausgeführt werden, können die Zellen von den Plattenoberflächen entfernt werden, so dass es unmöglich ist, die Zellen bildübergreifend abzugleichen.

Wenn diese Unterbrechung nur einige der Zellen im Sichtfeld betrifft, kann es möglicherweise immer noch möglich sein, einige der Zellen im Bild zu erkennen und zuzuweisen. Die maximale Datenmenge wird jedoch aus einem Experiment gewonnen, bei dem die Hybridisierung sorgfältig durchgeführt wird und nur wenige Zellen zwischen Bildern verloren gehen oder neu positioniert werden. Ergebnisse von Experimenten, die Kalziumaktivität mit der Expression von neuronalen Vorläufermarkergenen zusammenfassten, können zahlreiche Assoziationen zwischen spezifischen Mustern der Kalziumaktivität und Neurotransmitter-Phänotypen aufdecken.

Mit diesen Daten können Forscher komplexere Merkmale dieser dynamischen Kalziummuster und der Beziehungen zur Genexpression untersuchen, anstatt sich auf einfache Spike-Zählungen zu beschränken.