Name: Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Expression und Reinigung von Antikörpern sowie die Echtzeitüberwachung ihrer Verteilung in Tumor und Gewebe. Diese kostengünstige Methode unterstützt die Selektion therapeutischer Antikörper mit minimalem unspezifischem Gewebebefall.

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Wir danken der University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, der Biomolecular Analysis Facility, der Advanced Microscopy Facility und der Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S ist ein früher Karriere-Ermittler der Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Diese Arbeit wurde durch das NCI/NIH-Stipendium (R01CA233752) an J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) Breakthrough Level-1 Award an J. T-S (BC17097) und U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) Funding Award (OC180412) an J. T-S (BC17097) und U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S (BC17097) und U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S (BC17097) und Den U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S (BC17097) und den U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S

Alle Verfahren im Zusammenhang mit tiermundien und Tumor-Xenografts-Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) hier an der University of Virginia überprüft und genehmigt und entsprechen den einschlägigen regulatorischen Standards.
1. Expression und Reinigung von Antikörpern
<ol><li>Wartung von CHO-Zellen<ol>
<li>Grow CHO-Zellen in FreeStyle CHO Media ergänzt mit handelsüblichen 1x Glutamin-Ergänzung bei 37 °C Schütteln bei 130 U/min mit 5%CO2 mit delong Erlenmeyer Kolben entweder Glas oder Einweg. HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, einen verwirrten Kolben mit belüfteter Kappe für erhöhte Rührung zu verwenden und die Gasübertragung während des Schüttelzustands zu verbessern. Aufgrund der begrenzten Agitation der Suspensionskultur wurde mit regelmäßigen Kolben (nicht verwirrt) eine signifikant reduzierte Antikörperausbeute erzielt.</li>
		<li>Bewahren Sie die Zellzahl zwischen 1-5 x 106 Zellen/ml mit &gt;95% Zelllebensfähigkeit bei. Wenn die Zellzahl über 5 x 106 Zellen/ml ansteigt, teilen Sie die Zellen auf. Lässt CHO-Zellen niemals unter 0,2 x 106 Zellen/ml zu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfektion von CHO-Zellen<ol>
<li>Wachsen Sie CHO-Zellen in 200 ml Medien (2 x 106 Zellen/ml) in entlüfteten Erlenmeyer-Faffekolben. HINWEIS: Suspensionskulturen, die in verwirrten Kolben angebaut werden, haben immer höhere Proteinerträge im Vergleich zu dem, wenn sie in nicht-baffled Enken angebaut werden.</li>
		<li>Nehmen Sie in einem 15 ml-Rohr 5 ml CHO FreeStyle-Medien und fügen Sie 50 g VH-Klon-DNA und 75 g VL-Klon-DNA hinzu. Wirbel gut zu mischen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die DNA-Mischung bei Raumtemperatur für 5 min. HINWEIS: Eine längere Inkubation reduziert die Proteinausbeute.</li>
		<li>Fügen Sie 750 l von 1 mg/ml Polyethyleneimin (PEI) in die DNA-Lösung und mischen Sie die Mischung aggressiv für 30 s. Bei Raumtemperatur zusätzlich 5 min inkubieren. HINWEIS: PEI muss frisch gemacht werden. Multipler Gefriertauzyklus von PEI reduziert den Gesamtertrag erheblich.</li>
		<li>Fügen Sie die gesamte Mischung aus DNA und PEI auf die Zellen, während manuell schütteln den Kolben. Sofort die entlüfteten Erlenmeyer-Faffemiten mit Zellen bei 37 °C bebrüten bei 130 U/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ausdruck HINWEIS: Der Antikörper hat sekretorezielle Signalpeptid an seinem N-Terminal-Ende entwickelt, die hilft, Antikörper in die Medien abgesondert werden.<ol>
<li>Wachsen Sie die transfizierten Zellen bei 37 °C, mit Schütteln bei 130 Umdrehungen pro Minute am Tag 1.</li>
		<li>Am Tag 2 2 2 ml 100x Anti-Klumpen-Mittel und 2 ml 100x antibakterielle-antimykotische Lösung hinzufügen. Drehen Sie den Kolben auf niedrigere Temperatur (32-34 °C), mit Schütteln bei 130 U/min.</li>
		<li>An jedem fünften Tag, fügen Sie 10 ml Trypton N1-Feed, und 2 ml von 100x Glutamin Ergänzung.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen jeden dritten Tag mit Hämozytometer, nachdem Sie ein Aliquot von Zellen mit Trypan-Blaufleck gefärbt haben. Stellen Sie sicher, dass die Zelllebensfähigkeit über 80 % bleibt.</li>
		<li>Am Tag 10 oder 11 das Medium zur Antikörperreinigung ernten. Drehen Sie die Kultur bei 3000 x g, 4 °C für 40-60 min und filtern Sie dann die klaren Medien mit 0,22 M Flaschenfiltern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinigung HINWEIS: Die Antikörperreinigung erfolgt mit einer handelsüblichen Protein-A-Säule (siehe Materialtabelle)mit einer peristaltischen Pumpe.<ol>
<li>Die Kolonne mit zwei Spaltenvolumen bindungspuffer (20 mM Natriumphosphat bei pH 7,4) ausdemieren.</li>
		<li>Führen Sie die gefilterten Medien mit Antikörpern (in Schritt 1.3.5) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min durch die Säule.</li>
		<li>Waschen Sie die Spalte mit einem zweispaltigen Volumen des Bindungspuffers.</li>
		<li>Den Antikörper mit 5 ml Elutionspuffer (30 mM Natriumacetat bei pH 3,4) in 500 L-Fraktionen zu vereitpen.</li>
		<li>Neutralisieren Sie den pH-Wert des eluierten Antikörpers, indem Sie 10 l Neutralisationspuffer (3 M Natriumacetat bei pH 9) pro Fraktion hinzufügen. HINWEIS: Die Bruchzahl 3-6 enthält den größten Teil des Antikörpers. Es ist ratsam, alle Fraktionen zu behalten, falls der Antikörper in einem späteren Bruchteil als erwartet eluiert wird.</li>
		<li>Messen Sie die Konzentration von gereinigtem Antikörper mit einem Spektralphotometer, indem Sie das Standardprotokoll für IgG auswählen. Die Endkonzentration des Antikörpers wird in mg/ml unter Berücksichtigung des Molekulargewichts und des Absorptionskoeffizienten ermittelt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fluoreszierende Etikettierung
HINWEIS: Antikörper werden mit dem Infrarotfarbstoff beschriftet, der eine NHS Ester-Reaktive Gruppe enthält, die sich mit Proteinen paart und ein stabiles Konjugat bildet. Diese Reaktion ist pH-empfindlich und funktioniert am besten bei pH 8,5. Fluoreszierende Konjugate, die mit dem Farbstoff gekennzeichnet sind, zeigen ein Absorptionsmaximum von 774 nm und ein Emissionsmaximum von 789 nm. pH 8.5 ist der Schlüssel für eine effektive Konjugation.
<ol><li>Dialyse 0,5 ml des Antikörpers mit einer Dialysekassette (0,1-0,5 ml) in 1 L Konjugationspuffer (50 mM Phosphatpuffer bei pH 8,5). Nach 4 h die Dialysekassette in frischen Puffer geben und über Nacht dialysieren.</li>
	<li>Richten Sie eine Konjugationsreaktion ein, indem Sie 0,03 mg IRDye 800CW pro 1 mg Antikörper in einem Reaktionsvolumen von 500 l hinzufügen. HINWEIS: IRDye 800CW wird in DMSO in einer Konzentration von 10 mg/ml aufgelöst.</li>
	<li>Durchführung von Etikettierreaktionen für 2 h bei 20 °C. HINWEIS: Wenn die Zeit über 2 h hinaus erhöht wird, wird die Beschriftung nicht verbessert.</li>
	<li>Reinigen Sie gekennzeichnete Konjugate durch umfangreiche Dialyse gegen 1x PBS.</li>
	<li>Schätzen Sie den Grad der Etikettierung, indem Sie die Absorption des Farbstoffs bei 780 nm und die Absorption des Proteins bei 280 nm messen. Der Farbstoffbeitrag zum 280 nm Signal beträgt 3%.</li>
	<li>Berechnen Sie das Farb-Protein-Verhältnis nach dieser Formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ01.jpg"> wobei 0,03 ein Korrekturfaktor für die Absorption des verwendeten Farbstoffs bei 280 nm (entspricht 3,0 % seiner Absorption bei 780 nm) ist, sind εFarbstoff und εProtein molaren Aussterbekoeffizienten für den Farbstoff bzw. das Protein (Antikörper). HINWEIS: εFarbstoff ist 270.000 M-1 cm-1 und εProtein ist 203.000 M-1 cm-1 (für ein typisches IgG) in 1:1 Mischung von PBS: Methanol. Proteine außer IgG können sehr unterschiedliche molaren Aussterbekoeffizienten haben. Die Verwendung des korrekten Aussterbekoeffizienten für das Protein von Interesse ist für die genaue Bestimmung des D/P-Verhältnisses unerlässlich.</li>
	<li>Berechnen Sie die endgültige Proteinkonzentration nach dieser Formel: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ02.jpg"> HINWEIS: Bestätigen Sie immer die antigenbindende Wirksamkeit von markierten und nicht beschrifteten Antikörpern mit ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) oder Durchflusszytometrie, bevor Sie mit In-vivo-Studien fortfahren.</li>
</ol>3. Maus Xenograft Studien
<ol><li>Vorbereitung von Tumorzellen zur Injektion<ol>
<li>Wachsen Sie OVCAR-3-Zellen in RPMI-1640 Medium, ergänzt durch 10% von FBS und 1x Penicillin-Streptomycin.</li>
		<li>Am Tag vor der Injektion, Subkultur-Zellen in neue 100 mm Kulturgerichte mit 10 ml komplettem Medium/Schale. Verwenden Sie die Zellnummer 0,5-1 x 106 Zellen/Schale.</li>
		<li>Inkubationskulturen bei 37 °C Temperatur, 95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2 für 20-24 h.</li>
		<li>Am Tag der Injektion, entfernen Sie das Wachstumsmedium von Kulturgerichten. Spülen Sie die Zellschicht gründlich mit Ca2+/Mg2+ frei Dulbecco Phosphat-gepufferte Saline (DPBS), um abgestorbene Zellen, zellulären Schmutz und alle Spuren von Serum zu entfernen, die in trypsin Wirkung stören können.</li>
		<li>Versuchen Sie die Zellen, indem Sie 1,0-1,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Schale hinzufügen und versuchen, die Lösung zu verbreiten, indem Sie die Schale rundum kippen, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 5-10 min. HINWEIS: Beobachten Sie Zellen unter einem invertierten Mikroskop, um den tatsächlichen Trypsinisierungsstatus zu überprüfen. Unter Trypsinisierung führt zu einer geringeren Anzahl von Zellablösung von der Oberfläche der Kulturschale, über Trypsinisierung induziert zellulären Stress. Also, richtige Trypsinisierung ist wichtig.</li>
		<li>Fügen Sie 1,0-1,5 ml komplettes Wachstumsmedium zu jeder Schale hinzu, um die Trypsin-Aktion zu stoppen, nachdem sie Zellen durch sanftes Pipettieren wieder aufhängen. HINWEIS: Sanfte Pipettierung ist wichtig, um die Zellgesundheit zu erhalten.</li>
		<li>Die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr einsammeln und bei 250 x g 5 min bei Raumtemperatur drehen.</li>
		<li>Sammeln Sie das Zellpellet nach dem Entfernen des Überstandes und waschen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 1x DPBS wieder aufhängen.</li>
		<li>Drehen Sie die Zellsuspension mit niedriger Geschwindigkeit 250 x g für 5 min.</li>
		<li>Fügen Sie 500 L DPBS hinzu und setzen Sie Zellen durch sanftePipettieren wieder auf, um eine einzellige Suspension zu erhalten.</li>
		<li>Zählen Sie Zellen mit Hämozytometer oder automatisiertem Zellzähler. HINWEIS: Für eine bessere Genauigkeit, wiederholen Sie die Zählung für dreimal und nehmen Sie einen Durchschnitt.</li>
		<li>Passen Sie das Volumen so an, dass die endgültige Zelldichte 1 x 108 Zellen/ml beträgt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Subkutane Injektion von Zellen zur Entwicklung von Maus-Xenografts HINWEIS: Alle Verfahren sollten in einem BSL2-Sicherheitsschrank durchgeführt werden. Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ Mäuse wurden in der aktuellen Studie verwendet.<ol>
<li>Nehmen Sie 50 l der Zellsuspension in ein 1,5 ml-Rohr und mischen Sie es mit 50 l Kellermatrix-Matrixmedium. HINWEIS: Kellermembran Matrix Medium neigt dazu, ein Gel wie Zustand bei Raumtemperatur zu bilden, so sorgfältig halten Sie die Zellen und die Matrix Medium Mischung auf Eis. Es ist ratsam, Schläuche, Spitzen und Spritzen im Kühlschrank aufzubewahren und dann vor der Tierinjektion auf Eis zu übertragen.</li>
		<li>Rühren Sie die Mischung, um Zellklumpen zu vermeiden. Nehmen Sie dann diese 100 l des Zellsuspensions-Matrix-Medium-Gemischs, das 5 x 106 Zellen enthält, in eine 1-ccm-Spritze.</li>
		<li>Heben Sie die Haut des Tieres vorsichtig an, um die Haut von der darunter liegenden Muskelschicht zu trennen, und injizieren Sie die Zellsuspension (100 l) langsam unter die Haut (5 x 106 Zellen), mit einer 26 G Nadel. Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel herausnehmen, so dass Das Kellermatrixmedium die halbfeste gelähnliche Struktur zusammen mit Zellen unter der Haut bilden kann, wodurch verhindert wird, dass die Mischung von der Injektionsstelle kommt. HINWEIS: Zellen müssen vor der Injektion auf Verunreinigungen getestet werden, die immundefizienten Mäusen schaden können. Während der Injektion setzen Sie die Nadel nicht zu tief in die Haut, da dies den Tumor tiefer als erwartet bilden kann.</li>
		<li>Halten Sie das Tier in einem sterilen Käfig und beobachten Sie für ca. 20 min.</li>
		<li>Beobachten Sie die Mäuse für 2-3 Wochen und lassen Sie den Tumor bis zu 500 mm3 Größe wachsen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Antikörperlokalisierung mit einem In-vivo-Bildgebungssystem
HINWEIS: In vivo-Bildgebungsgeräte (siehe Tabelle der Materialien),die in diesem Experiment verwendet werden, verwenden eine Reihe von hocheffizienten Filtern und spektralen Un-Mixing-Algorithmen für die nichtinvasive Visualisierung und Verfolgung zellulärer und genetischer Aktivitäten innerhalb eines lebenden Organismus in Echtzeit. Das System bietet sowohl Fluoreszenz- als auch Biolumineszenzüberwachungsfunktionen.
<ol><li>Injizieren Sie 25 g Farbstoff als Antikörper über Schwanzvene.<ol>
<li>Anästhetisieren Sie Tumor tragende Mäuse mit 2% Isofluran. Überprüfen Sie, ob auf Pedalreflexe nicht reagiert wird.</li>
		<li>Sobald Mäuse aufhören, sich zu bewegen, deisieren Sie die seitliche Schwanzvene, indem Sie Wurmwasser auftragen.</li>
		<li>Mit einer 26 G-Nadel mit einer Insulinspritze von 1 cc injizieren.</li>
		<li>Ebenso etikettieren und injizieren Sie als Negativkontrolle den unspezifischen IgG1 Isotype-Antikörper, der nicht auf Krebszellen abzielt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie in vivo Live-Bildgebung nach 8, 24, 48 h, etc. von Antikörper-Injektionen.<ol>
<li>Klicken Sie in der zugehörigen Software auf Initialisieren im Bedienfeld, und bestätigen Sie, dass die Stufentemperatur 37 °C beträgt.</li>
		<li>Schalten Sie die Sauerstoffversorgung, alle Pumpen auf dem Anästhesiesystem, Isofluran-Gasversorgung an die Anästhesiekammer und stellen Sie die Isoflurane Verdampferventil auf 2%.</li>
		<li>Übertragen Sie die Mäuse in die Anästhesiekammer und warten Sie, bis die Mäuse vollständig beästhetisiert sind. Tragen Sie die Augenschmiersalbe auf, um das Trocknen ihrer Augen zu vermeiden.</li>
		<li>Gehen Sie zum Bedienfeld, richten Sie die Fluoreszenzbildgebung über die Option Imaging Wizard ein und wählen Sie die Anregung bei 773 nm und die Emission bei 792 nm aus. HINWEIS: Die standardmäßigen Einstellungen für die automatische Belichtung bieten ein gutes fluoreszierendes Bild. Die Einstellungen für die automatische Belichtung können jedoch je nach Bedarf geändert werden.</li>
		<li>Übertragen Sie die anästhesierten Mäuse in die Bildkammer und montieren Sie sie mit Nasenkegel auf dem Bildfeld. Die Bildgebungsphase bietet die Möglichkeit, 5 Mäuse gleichzeitig aufzunehmen. HINWEIS: Lassen Sie Kontrollmäuse zusammen mit den Testmäusen abbilden, um während der Analyse eine ähnliche Menge an Exposition und anderen Einstellungen zu haben.</li>
		<li>Sobald alles fertig ist, wählen Sie auf dem Bedienfeld für die Bildaufnahme die Option Übernehmen aus.</li>
		<li>Mit Autoexposure-Einstellungen generiert das System das Bild innerhalb einer Minute. Das erzeugte Bild ist die Überlagerung der Fluoreszenz auf fotografischem Bild mit optischer Fluoreszenzintensität, die in Einheiten von Zählungen oder Photonen oder in Bezug auf die Effizienz angezeigt wird.</li>
		<li>Nach dem Erfassen des Bildes, übertragen Sie die Mäuse aus der Bildkammer zurück in ihren Käfig und beobachten für ihre Genesung für 1 bis 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optimieren Sie das Bild weiter mit den Tools und Funktionen, die in der Software für die Bildanalyse zur Verfügung gestellt werden. Bildanalysewerkzeuge befinden sich in der Menüleiste und Werkzeugpalette.<ol>
<li>Passen Sie unter Bildanpassendie Helligkeit, den Kontrast oder die Deckkraft an, und wählen Sie die Farbskala aus.</li>
		<li>Verwenden Sie die ROI-Tools, um einen Bereich von Interesse (ROI) in einem optischen Bild anzugeben und die Signalintensität innerhalb des ROI zu messen. Exportieren Sie bei Bedarf die quantifizierten Signaldaten in eine Tabellenkalkulationssoftware und zeichnen Sie die Daten.</li>
		<li>Für Folgestudien analysieren Sie Mäusenekropsien verschiedener Gewebe (z. B. Leber, Lunge, Herz, Niere, Milz, Gehirn usw.) Seite an Seite für eine detaillierte unspezifische Verteilung fluoreszierend markierter Antikörper. HINWEIS: Die Daten können durch die Verwendung von Antigen (FOLR1 in diesem Fall) in 96-Well-Tests weiter mit gewebespezifischem ELISA unterstützt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Selektive und tumorgewebespezifische Abgabe von Anti-Krebs-Therapeutika ist der Schlüssel zur Messung der Wirksamkeit und Sicherheit einer bestimmten gezielten Therapie13. Hier haben wir einen schnellen und effizienten Ansatz beschrieben, um die detaillierte Gewebe- und Tumorverteilung von klinischem Farletuzumab und einem nichtklinischen BaCa-Antikörper zu untersuchen. Der beschriebene Ansatz ist auf jeden neu erzeugten Antikörper anwendbar und kann zusammen mit einem klinisch wirksamen Antikörpe...

Die FDA genehmigte 1986 den ersten monoklonalen Antikörper gegen CD3 (OKT3, Muromonab)1,2. Seitdem hat es in den nächsten zwanzig Jahren eine schnelle Explosion im Bereich der Antikörpertechnik gegeben, aufgrund des überwältigenden Erfolgs von Antikörpern gegen Immun-Checkpoint-Inhibitoren3. Neben der indirekten Aktivierung des Immunsystems zielen Antikörper darauf ab, Krebszellen direkt zu kennzeichnen, um Immuneffektorzellen präzise zu aktivieren, Zytotoxizität über Todesrezeptor-Agonisten auszulösen, Tumorzellüberlebenssignale zu blockieren, Angiogenese zu behindern (Wachstum der Blutgefäße), Immun-Checkpoint-Regler einzuschränken, Radioisotope, Chemotherapie-Medikamente und siRNA als konjugierte Wirkstoffe zu liefern2. Darüber hinaus ist die Untersuchung der einkettigen variablen Fragmente (scFv) verschiedener Antikörper auf der Oberfläche von patientenabgeleiteten T-Zellen und NK-Zellen (CAR-T und CAR-NK) ein schnell wachsendes Gebiet klinischer Untersuchungen für zellbasierte Therapien4.
Die ultrahohe Affinität von Antikörper-basierten Medikamenten, die Selektivität gegenüber Antigen-exemittierenden Tumorzellen bietet, macht es zu einem attraktiven Mittel. Ebenso ist die gezielte Abgabe und Tumorretention eines therapeutischen Antikörpers (oder eines chemischen Medikaments) der Schlüssel, um die Wirksamkeit über die Toxizität auszugleichen. Daher wird eine große Anzahl von Protein-Engineering-basierten Strategien, die, aber nicht beschränkt auf bispezifische5 und tri-spezifische Antikörper6 sind, genutzt, um die Avidität optimierte Tumorretention von intravenös (IV) injizierten Therapeutika5,7zu verbessern. Hier beschreiben wir eine einfache fluoreszenzbasierte Methode zur Behandlung der Tumor- und Gewebeverteilung potenziell wirksamer Krebsantikörper.
Da tierische Gewebe eine Autofluoreszenz besitzen, wenn sie im sichtbaren Spektrum angeregt werden, wurden die Antikörper zunächst mit einem nahen Infrarotfarbstoff (z. B. IRDye 800CW) gekennzeichnet. Für Proofs von Konzeptuntersuchungen haben wir Follatrezeptor alpha-1 (FOLR1) verwendet, der auf Antikörper namens Farletuzumab und dessen Derivat Namensbispecific Anker Cytotoxizitätsaktivator (BaCa)7 Antikörper abzielt, der FOLR1 und Todesrezeptor-5 (DR5)8 in einem rekombinanten Antikörper kotargets. FOLR1 ist ein klar definierter überexprimierter Zielrezeptor in Eierstock- und TNBC-Krebszellen, Tumor-Xenografts und Patiententumoren9. Bemerkenswert ist, dass es mehrere Bemühungen gibt, FOLR1 klinisch zu nutzen, indem Antikörper-basierte Ansätze verwendet werden, um Immuneffektorzellen und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADC) für Eierstock- und Brustkrebs zu engagieren10,11.
In diesem Methodenpapier haben wir klinische samt Anti-FOLR1 (Farletuzumab) geklont, exprimiert und gereinigt. Als Negativkontrollen wurden der IgG1-Isotyp und ein klinischer Anti-Idiotyp Mucin-16-Antikörper namens Abagovomab12 verwendet. Nach der Protein-A-Reinigung wurden die angegebenen Antikörper mit IRDye 800CW gekennzeichnet und in die Schwanzvene von Nacktmäusen verabreicht, die entweder Eierstocktumor-Xenografts trugen oder stabil transfizierte menschliche FOLR1-Exzessen murinen Darmkrebs-Xenografts. Die Antikörperlokalisierung wurde durch Live-Bildgebung mit In-vivo-Bildgebungsspektrum an mehreren verschiedenen Zeitpunkten7verfolgt. Diese Methode erfordert keine genetische Veränderung oder Injektion des Substrats, um Lichtemission zu ermöglichen und ist deutlich schneller, kostengünstig und effizient. Das unten beschriebene allgemeine Klon-, Expressions-, Reinigungs- und Etikettierungsprotokoll kann auf jeden klinischen und nichtklinischen Antikörper angewendet werden, wenn schwere und leichte Kettensequenzen verfügbar sind.

<table><tbody><tr><td>FreeStyle CHO media</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Katze # 12651-014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti-Anti (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Katze # 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klumpen-Mittel</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Katze # 01-0057DG</td><td></td></tr><tr><td>BD Insulinspritze</td><td>BD BioSciences</td><td>Katze #329420</td><td></td></tr><tr><td>Bremssattel IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>Katze #124262</td><td></td></tr><tr><td>CHO CD EfficientFeed B</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat #A10240-01</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-13-CV</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 konjugiertes Anti-Human-IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Katze # 709-175-149</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Katze # 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Katze # K21007</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap MabSelect SuRe Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>Katze # 11-0034-93</td><td></td></tr><tr><td>Infusion</td><td>Takara BioScience</td><td>STO344</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW NHS Ester</td><td>LI-COR</td><td>Katze # 929-70020</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran, USP</td><td>Covetrus</td><td>Katze # 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Gleitmittel Augensalbe</td><td>Auffrischung Lacri-Lube</td><td>Katze #4089</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Katze # 354234</td><td></td></tr><tr><td>PEI Transfektionsreagenz</td><td>Thermo Fisher</td><td>Katze # BMS1003A</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysekassetten</td><td>Thermo Scientific</td><td>Katze # 66333</td><td></td></tr><tr><td>Steritop Vakuum Filter</td><td>Millipore Express</td><td>Cat #S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15400-054</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Experimentelle Modelle: Zelllinien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mensch: OVCAR-3</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>Mensch: CHO-K Zellen</td><td>Stabil transformiert in unserem Labor</td><td>ATCC CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>Maus: 4T1</td><td>Freundliches Geschenk von Dr. Chip Landen, UVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus: MC38</td><td>Freundliches Geschenk von Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td><td>Authentisch durch STR Profiling</td><td></td></tr><tr><td>Maus: MC38 hFOLR1</td><td>Erzeugt in unserem Labor (Dieses Papier)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Experimentelle Modelle: Tier</starke></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mäuse: athym Nude Foxn1nu/Foxn1+</td><td>Envigo</td><td>Mehrere Bestellungen</td><td></td></tr><tr><td>Mäuse: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Mehrere Bestellungen</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der tumor- und gewebeverteilung von zielantigen-spezifischen therapeutischen antikörpern

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoklonale Antikörper sind hochaffine multifunktionale Medikamente, die durch variable unabhängige Mechanismen arbeiten, um Krebszellen zu eliminieren. In den letzten Jahrzehnten hat sich das Feld der Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, bispezifischen Antikörper, chimären Antigenrezeptoren (CAR) und Krebsimmuntherapie als der vielversprechendste Bereich der grundlegenden und therapeutischen Untersuchungen herauskristallisiert. Mit zahlreichen erfolgreichen Studien am Menschen, die auf Immun-Checkpoint-Rezeptoren und CAR-T-Zellen bei Leukämie und Melanom in einem bahnbrechenden Tempo abzielen, sind es hochspannende Zeiten für onkologische Therapeutika, die aus Variationen der Antikörpertechnik abgeleitet sind. Bedauerlicherweise hat sich eine signifikant große Anzahl von Antikörpern und CAR-basierten Therapeutika auch in Studien am Menschen mit soliden Krebsarten als enttäuschend erwiesen, da Immuneffektorzellen im Tumorbett nur begrenzt zur Verfügung stehen. Wichtig ist, dass die unspezifische Verteilung von therapeutischen Antikörpern in anderen Geweben als Tumoren auch zum Mangel an klinischer Wirksamkeit, damit verbundener Toxizität und klinischem Versagen beiträgt. Da die getreue Übersetzung präklinischer Studien in klinische Pfade am Menschen in hohem Maße auf Dieko-Effizienz- und Sicherheitsstudien von Mäusen beruht, heben wir hier eine Methode zur Untersuchung des Tumors und der allgemeinen Gewebeverteilung von therapeutischen Antikörpern hervor. Dies wird durch die Kennzeichnung des protein-A-gereinigten Antikörpers mit einem nahen Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff erreicht, gefolgt von einer Live-Bildgebung von tumortragenden Mäusen.

In der beschriebenen Methodik klonten wir zunächst Antikörper, die auf den Folatrezeptor Alpha-1 (FOLR1) mit dem Namen Farletuzumab abzielten, und einen bispezifischen Antikörper namens BaCa, der aus Farletuzumab und Lexatumumab besteht, zusammen mit Kontrollantikörpern wie Abagovomab (Sequenzen in der Zusatzdatei 1). Einzelheiten zu repräsentativen variablen Schweren (VH) und variablen Licht (VL) Domänen in DNA-Klonen (pVH, pVL) sind in Abbildung 1Adargestellt. Um die posit...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der In-vivo-Lokalisierung von Antikörpern in Mäusetumor-Xenograft-Modellen vor.

Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Dieses Protokoll demonstriert die Expression und Reinigung von Antikörpern und die Echtzeitüberwachung der Antikörperverteilung in Tumor und Gewebe. Screening-Antikörper mit beschriebenem Protokoll helfen bei der Auswahl von Antikörpern, die eine begrenzte unspezifische Gewebeverteilung haben, und bereichern Tumorlokalisierungen. Die beschriebene Technik ist schnell und kostengünstig.Andere Techniken, wie die Computertomographie für Einzelphotonenemissionen und die Positronenemissionstomographie, sind sehr teuer und erfordern radioaktive und andere ausgeklügelte Tracer. Die Technik beschränkt sich nicht auf Krebsmedikamente. Es kann auf jede andere Krankheit angewendet werden, wie Lungen- oder Herzerkrankungen, für die Analyse der Antikörperverteilung im Körper.Demonstrieren das Verfahren, wird Jeremy Gatesman, ein Veterinärtechniker von meiner Universität sein. Rohe CHO-Zellen in 200 Milliliter Medien, in Delong, Erlenmeyer verwirrtKolben. Kombinieren Sie fünf Milliliter CHO-Freestyle-Medien mit 50 Mikrogramm variabler schwerer Klon-DNA und 75 Mikrogramm eine variable Lichtklon-DNA in einer 15-Milliliter-Röhre.Dann wirbeln Sie die Röhre. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Fügen Sie 750 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Polyethylenimin-Lager in die DNA-Lösung, und aggressiv wirbeln Sie es für 30 Sekunden.Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für weitere fünf Minuten. Fügen Sie die gesamte Mischung zu den CHO-Zellen hinzu, während Sie den Kolben manuell schütteln. Sofortige Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius beim Schütteln bei 130 RPM.Am nächsten Tag zwei Milliliter 100 X Anti-Klumpen-Mittel und zwei Milliliter 100 X antibakterielle antimykotische Lösung in die Zellen geben. Inkubieren Sie die Kolben bei 32 bis 34 Grad Celsius, mit Schütteln bei 130 U/min. Fahren Sie die Kultivierung der Zellen für 10 bis 11 Tage, Hinzufügen von 10 Milliliter Tryptone N1 Futter, und zwei Milliliter von 100 X Glutamin Ergänzung an jedem fünften Tag.Zählen Sie die Zellen an jedem dritten Tag, um sicherzustellen, dass die Zelllebensfähigkeit über 80% bleibt Am Tag 10 oder 11, ernten Sie das Medium für die Antikörperreinigung durch Zentrifugieren der Kultur bei 3000 mal G, und vier Grad Celsius für 40 bis 60 Minuten. Filtern Sie dann die klaren Medien mit einem 0,22 Mikrometer Flaschenfilter. Um die Antikörper zu reinigen, gleicht die Protein-A-Säule mit zwei Spaltenvolumina von Bindungspufferaus.Übergeben Sie die gefilterten Medien mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute durch die Spalte. Waschen Sie dann die Spalte mit zwei Spaltenvolumes mit Bindungspuffer. Verwenden Sie fünf Milliliter Elutionspuffer, um den Antikörper in 500 Mikroliter-Fraktionen zu verwandeln.Und neutralisieren den pH-Wert des angedeuteten Antikörpers, indem 10 Mikroliter Neutralisationspuffer für Fraktion hinzugefügt werden. Messen Sie die Konzentration des gereinigten Antikörpers mit einem Spektralphotometer mit dem Standardprotokoll für IgG. Dialyse 0,5 Milliliter des Antikörpers mit einer Dialysekassette in einem Liter Konjugationspuffer.Nach vier Stunden die Dialysekassette in einen frischen Puffer geben und über Nacht dialysieren. Um eine Konjugationsreaktion einzurichten, fügen Sie 0,03 Mikrogramm IRR-Farbstoff 800 CWU pro einem Milligramm Antikörper in einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern hinzu. Inkubieren Sie die Mischung für zwei Stunden bei 20 Grad Celsius, dann reinigen Sie die markierten Konjugate durch umfangreiche Dialyse gegen PBS.Schätzen Sie den Grad der Etikettierung, indem Sie die Absorption des Farbstoffs 780 Nanometer und die Absorption des Proteins bei 280 Nanometern messen. Um Maus-Xenographen zu entwickeln, heben Sie die Haut des Tieres sanft an und trennen Sie sie von der darunter liegenden Muskelschicht. Mit einer 26-Meter-Nadel spritzen Sie langsam 100 Mikroliter Zellsuspension unter die Haut.Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel herausnehmen, damit das Kellermatrixmedium die halbfeste gelartige Struktur zusammen mit zellenförmigen Zellen unter der Haut informiert, wodurch verhindert wird, dass die Mischung aus der Injektionsstelle kommt. Um in vivo-Bildgebung durchzuführen, injizieren Sie den Farbstoff beschrifteten Antikörper über die Schwanzvene. Nach der Anästhesisierung der Maus, überprüfen Sie auf die fehlende Reaktion auf Pedalreflexe, und die Vene durch die Anwendung von warmem Wasser zu deisieren.Verwenden Sie eine 1cc Insulinspritze mit einer 26-Messgerät-Nadel, um 25 Mikrogramm des markierten Antikörpers in einem Volumen von 100 Mikrolitern zu injizieren. Als Negativkontrolle den unspezifischen IgG-Isotyp-Antikörper, der nicht auf Krebszellen abzielt, zu kennzeichnen und zu injizieren. Führen Sie in vivo Bildgebung acht, 24 und 48 Stunden nach Antikörperinjektionen durch.Klicken Sie in der Imaging-Software auf Initialisieren. Bestätigen Sie, dass die Stufentemperatur 37 Grad Celsius beträgt. Richten Sie im Bedienfeld die Fluoreszenz-Bildgebung über den Bildgebungsassistenten ein und stellen die Anregung auf 773 Nanometer, die Emission auf 792 Nanometer.Übertragen Sie die anästhesierte Maus in die Bildkammer. Positionieren Sie es mit dem Nasenkegel auf dem Bildfeld. Wenn Sie bereit sind, klicken Sie auf das Bedienfeld für die Bildaufnahme auf "Erfassen", und klicken Sie auf automatische Belichtung.Das erzeugte Bild ist die Überlagerung der Fluoreszenz auf dem fotografischen Bild mit optischer Fluoreszenz und Dichte, die in Einheiten von Zählungen oder Photonen angezeigt wird. Positive cDNA-Klone mit variablen schweren und variablen Lichtdomänen wurden mit Kolonie PCR bestätigt. Repräsentative Ergebnisse von gereinigtem Farletuzumab auf nicht-reduzierender und reduzierender SDS-Seite werden hier gezeigt.Schwere und leichte Ketten produzierten 50 und 25 KilodaltonBänder nach reduktion. Die Bindung von Antikörpern an native Proteine in der Zelloberfläche wurde ebenfalls bestätigt. Fluoreszierend markierte Antikörper wurden Schwanzvenen in Mäuse injiziert, die mit vollen R1-exezierenden Tumoren transplantiert wurden.Tiere wurden zu mehreren Zeitpunkten mit IVIS gelebt. die Daten konfirs selektive Anreicherung von vollständigen R1- und BaCa-Antikörpern in die Tumoren. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass die Aufrechterhaltung von CHO-Zellen für die Antikörperausbeute von entscheidender Bedeutung ist.Und es ist wichtig, einen ähnlichen Grad an fluoreszierender Farbkonjugation für eine wettbewerbsfähige Tumorlokalisierung zu haben. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Gewebeimmunhistochemie und Gewebe- oder tumorspezifische ELISA durchgeführt werden, um die bildgebenden Daten der lebenden Mäuse zu unterstützen.

analyzing-tumor-tissue-distribution-target-antigen-specific

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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