Transkriptom-weite Profilierung von Protein-RNA-Wechselwirkungen durch Vernetzung und Immunpräzipitation durch FLAG-Biotin-Tandemreinigung
May 18th, 2020
Hier stellen wir ein modifiziertes CLIP-seq-Protokoll namens FbioCLIP-seq mit FLAG-Biotin-Tandemreinigung vor, um die RNA-Ziele von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) in Säugetierzellen zu bestimmen.
Nur bindende Proteine steuern mehrere biologische Prozesse. Diese FLAG-Biotin CLIP-seq Methode, um die spezielle und zeitliche Anordnung von RNAs und RBPs in Säugetierzellen global zu profilieren. Diese Methode ermöglicht eine effiziente Detektion von direkten proteingebundenen RNAs ohne SDS-PAGE und die Membranübertragungsverfahren.
Im Vergleich zu herkömmlichen CLIP-seq ist isotopfrei und es erfordert keine proteinspezifischen Antikörper. Beginnen Sie damit, etwa 3 Millionen embryonale Mundzellen mit einer 10-Zentimeter-Platte zu beschichten und über Nacht zu inkubieren. Am nächsten Tag das Medium mit einem Vakuum entfernen und die Zellen mit zwei Millilitern 0,25%Trypsin EDTA für zwei Minuten bei Raumtemperatur behandeln.
Das Trypsin mit vier Millilitern frischem MESC-Medium ablöschen und die Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen. Dann zentrifugieren Sie sie bei 300 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Die Zellen in vier Milliliterkaltem PBS aufhängen und zur Vernetzung wieder auf die 10-Zentimeter-Platte übertragen.
Strahlen Sie die Zellen mit einem 254 Nanometer UV-Licht aus und übertragen Sie die vernetzten Zellen dann in eine 15-Milliliter-Röhre. Drehen Sie diese Zellen bei 300 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius, entfernen Sie dann den Überstand und lysen Sie die Zellen mit 500 Mikroliter Puffer A, die nach Manuskriptanweisungen hergestellt werden. Übertragen Sie die Zellen in ein RNAse-freies 1,5-Milliliter-Rohr und bebrüten Sie sie bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation für 30 bis 60 Minuten.
Behandeln Sie das Lysat mit 30 Mikroliter DNAse 1 bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Dann stoppen Sie die Reaktion, indem Sie vier Mikroliter 0,5 Molaren EDTA hinzufügen. Drehen Sie das unlösliche Pellet durch Zentrifugieren bei 12.000 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, und übertragen Sie den Überstand auf ein neues vorgekühltes 1,5-Milliliter-Rohr.
Übertragen Sie das Zelllysat in vorausgeglichene FLAG-Perlen, und brüten Sie die Probe bei vier Grad Celsius, während Sie sich für zwei bis vier Stunden drehen. Zentrifugieren Sie nach der Inkubation die Perlen zwei Minuten lang bei 3000 mal G und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 Mikroliter Puffer A in die Probe und inkubiert bei 4 Grad Celsius für fünf Minuten, dann drehen Sie die Perlen und entfernen Sie den Überstand.
Wiederholen Sie die Wäsche mit Puffer A, gefolgt von zwei Wäschen mit vorgekühltem Puffer B.To elute mit einem drei X FLAG-Peptid, bereiten Sie die Elutionslösung vor, wie im Textmanuskript beschrieben, und drehen Sie die FLAG-Perlen herunter. Entfernen Sie den Überstand mit einer schmalen Endpipettenspitze und fügen Sie 200 Mikroliter der drei X FLAG Elutionslösung zu jeder Probe hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation.
Dann drehen Sie die Perlen für zwei Minuten bei 3000 mal G.Transfer die Supernate auf ein frisches Rohr und wiederholen Sie die Elution zweimal. Sparen Sie 5% der Eluenten für western blot analysis oder Silberfärbung, um die Wirksamkeit der FLAG-Immunpräzipitation zu überprüfen. Übertragen Sie die gezogenen Eluenten auf vorbereitete Streptavidinperlen und drehen Sie die Proben sanft bei vier Grad Celsius für ein bis drei Stunden oder über Nacht.
Dann sammeln Sie die Perlen auf einem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 500 Mikroliter Puffer C mit sanfter Rotation für fünf Minuten pro Wäsche. Als nächstes waschen Sie die Perlen zweimal mit 500 Mikroliter Puffer D und zweimal mit 500 Mikrolitereiseis PNK-Puffer, sammeln Sie die Perlen auf dem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand zwischen den Waschungen.
Um eine partielle RNA-Verdauung durchzuführen, fügen Sie 100 Mikroliter MNA-Lösung zu jeder Probe hinzu und Wirbel auf 37 Grad Celsius mit einem thermischen Mischer für 10 Minuten eingestellt. Sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie sie dann mit PNK-EDTA-Puffer, Puffer C und PNK-Puffer gemäß Manuskriptanweisungen.
Sammeln Sie die Perlen mit dem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Puffer. Dann fügen Sie die CIP-Reaktionsmischung hinzu und wirbeln Sie die Perlen bei 37 Grad Celsius mit einem thermischen Mischer für 10 Minuten. Waschen Sie die Perlen schnell zweimal mit 500 MikrolitereisepEDTA-Puffer, gefolgt von zwei Wäschen mit 500 Mikrolitereiskaltem PNK-Puffer.
Nach den Wassen 40 Mikroliter dreier Hauptlinkerligationsmischungen zu den Perlen hinzufügen und bei 16 Grad Celsius mit einem Thermomischer drei Stunden oder über Nacht wirbeln. Eine effiziente Ligation des Linkers zu den Verbündeten ist für dieses Experiment von entscheidender Bedeutung. Überprüfen Sie das Reaktionsrohr gelegentlich, um sicherzustellen, dass diese während der Ligation nicht ausfallen.
Wiederholen Sie nach der Inkubation die Waschungen mit PNK EDTA- und PNK-Puffern, fügen Sie 40 Mikroliter PNK gemischt in die Perlen und wirbeln Sie sie bei 37 Grad Celsius mit dem Thermomischer für 10 Minuten. Waschen Sie die Perlen mit PNK EDTA- und PNK-Puffern, und fahren Sie dann mit der RNA-Isolierung fort, wie im Textmanuskript beschrieben. Im Vergleich zu FLAG-vermittelten oder Streptavidin vermittelte ein Schritt Affinitätsreinigung, FLAG-Biotin Tandem-Reinigung entfernt fast alle Kern gereinigtproteine, Vermeidung der Kontamination der indirekten Protein-RNA-Wechselwirkungen.
LIN28 und WDR43, Fbio CLIP-seq wurde mit Maus embryonalen STEM-Zellen durchgeführt. Insgesamt wurden für LIN28 bzw. WDR43 rund 7,7 Millionen bzw. 2,2 Millionen Eindeutige Lesevorgänge abgerufen. Der Vergleich der Trackansichten zeigt unterschiedliche Bindungsmuster im RN45 Pre-rRNA-Lokus.
Die vernetzten Seiten auf dem GGA G Motiv der pre-let7-g RNA von LIN28, Fbio CLIP-seq oder identifiziert. Darüber hinaus wurden angereicherte RNA-Motive in den Bindungsstellen und der Prozentsatz mutierter Nukleotide in verschiedenen Mutationsarten bestimmt. Zeigt, dass LIN28 es vorzieht, an das Gennukleotid zu binden.
Nun, um 22:00 Uhr, dieses Protokoll, ist es wichtig, die Wirksamkeit der Immunpräzipitation zu bestätigen, um sicherzustellen, dass das Protein nur Komplexe erfolgreich gereinigt wurden.
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Überblick
Dieser Artikel präsentiert ein modifiziertes CLIP-seq-Protokoll namens Fbio CLIP-seq, das eine FLAG-Biotin-Tandem-Reinigung nutzt, um RNA-Ziele von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) in Säugerzellen zu identifizieren. Die Methode ermöglicht eine effiziente Detektion von direkt proteingebundenen RNAs ohne die Notwendigkeit von SDS-PAGE und Membrantransfer-Verfahren.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Molekularbiologie
Hintergrund
- RNA-bindende Proteine (RBPs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung verschiedener biologischer Prozesse.
- Traditionelle CLIP-seq-Methoden erfordern oft Isotope und spezifische Antikörper.
- Fbio CLIP-seq zielt darauf ab, den Prozess der Profilerstellung von RBPs und ihren RNA-Zielen zu vereinfachen.
- Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung von Säugerzellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer effizienteren Methode zur Identifizierung von RNA-Zielen von RBPs.
- Beseitigung der Notwendigkeit komplexer Verfahren wie SDS-PAGE.
- Bereitstellung eines Protokolls, das einfach in Säugerzellstudien angewendet werden kann.
Verwendete Methoden
- Ansäen von Maus-embryonalen Stammzellen in einer 10 cm Platte.
- Inkubation der Zellen über Nacht vor der Behandlung.
- Behandlung mit Trypsin EDTA zum Ablösen der Zellen.
- Nutzung der FLAG-Biotin-Tandem-Reinigung zur RNA-Isolierung.
Hauptergebnisse
- Die Fbio CLIP-seq-Methode profiliert erfolgreich RBPs und ihre RNA-Ziele.
- Gezeigte Effizienz bei der Detektion von proteingebundenen RNAs.
- Zeigte, dass die Methode isotopfrei und antikörperfrei ist.
- Bot einen optimierten Ansatz für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen.
Schlussfolgerungen
- Fbio CLIP-seq ist ein wertvolles Werkzeug für Forscher, die RBPs in Säugerzellen untersuchen.
- Die Methode verbessert die Fähigkeit, RNA-Interaktionen ohne traditionelle Einschränkungen zu profilieren.
- Zukünftige Anwendungen können sich auf verschiedene biologische Kontexte und Zelltypen ausweiten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Direct mapping of protein-RNA interactions is critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery pipelines. The Fbio CLIP-seq method enables transcriptome-wide identification of direct RNA-binding protein targets without reliance on isotopes or protein-specific antibodies, reducing confounding from indirect interactions. This capability enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in RNA-targeted drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables transcriptome-wide interrogation of direct protein-RNA interactions for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by eliminating indirect RNA-binding protein contaminants.
- Supports predictive confidence in target engagement and pathway mapping.
- Facilitates triage of RNA-binding proteins based on direct interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, antibody-free workflow for preparing validated protein-RNA complexes.
- Delivers quantitative readouts of direct binding events suitable for downstream screening.
- Improves reproducibility and scalability by removing isotope and antibody dependencies.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by profiling endogenous interactions in mammalian cells.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by mapping direct RNA targets.
- De-risks translational biomarker selection through high-specificity interaction data.
- Facilitates risk-adjusted advancement of RNA-targeted therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
The Fbio CLIP-seq method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing direct evidence of protein-RNA interactions for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping direct RNA-binding protein targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound screening and assay standardization.
- Analytics: Enables transcriptome-wide comparison of binding patterns and motif enrichment.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models by profiling interactions in disease-relevant cell types.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, antibody-independent platform for diverse RNA-binding protein studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows through antibody-free, isotope-free, and scalable purification steps.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA-protein biochemistry and cross-linking techniques.
- Needs access to UV cross-linking, FLAG and streptavidin bead purification, and high-throughput sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various mammalian cell models with protocol optimization.
- Potential limitations include requirement for tagged protein expression and careful validation of purification efficiency.
