Lokalisation und Quantifizierung von Begomoviren in Whitefly-Geweben durch Immunfluoreszenz und quantitative PCR

Die Klärung der Räumlichkeit und Menge des Virus in Whitefly-Vektoren kann helfen, Begomovirus-Whitefly-Wechselwirkungen zu verstehen und neuartige Strategien zur Bekämpfung schwerer begomoviraler Erkrankungen zu entwickeln. Die Vorteile dieser Technik sind, dass wir Whitefly-Gewebe schnell isolieren, virale und Whitefly-Proteine kolokalisieren und Viren in Weißenfliegen-Ganzenkörpern und virusinfizierten Pflanzen quantifizieren können. Zum entsprechenden experimentellen Zeitpunkt, nach der Viruserfassung, legen Sie eisbetäuste weibliche Weißfliegen in einen Tropfen PBS auf einem Mikroskopschlitten und verwenden Sie eine feine Akupunkturnadel, um den Bauch der Weißfliege unter einem Stereomikroskop zu öffnen.

Verwenden Sie die Nadel, um das Midgut zu extrahieren und legen Sie das Midgut in eine Sammelschale von PBS. Um die PSGs zu sammeln, teilen Sie den Körper am Thorax von der Rückenseite in der Nähe des Kopfes und fixieren Sie die Weißfliege mit einer Nadel durch den Thorax. Verwenden Sie eine zweite Nadel, um die Weißfliege zu schütteln, bis die beiden Speicheldrüsen vom Körper getrennt sind und übertragen Sie die Drüsen auf eine neue Schale von PBS.

Um die Eierstöcke zu sammeln, öffnen Sie den Bauch vollständig und verwenden Sie eine Nadel, um die Eierstöcke von den anderen Geweben zu trennen. Verwenden Sie eine Pipette, um das überschüssige Gewebe zu entfernen und die Eierstöcke in eine neue Schale von PBS zu übertragen. Um eine Hämolympierprobe zu sammeln, fügen Sie 10 Mikroliter PBS auf ein neues Mikroskopschlitten und legen Sie eine neue Weißfliege in das Tröpfchen.

Verwenden Sie eine feine Akupunkturnadel, um sanft ein Loch im Bauch zu machen. Dann einen leichten Druck auf den Bauch ausüben, um die Hämolymphe in den Puffer freizusetzen und eine acht Mikroliter Probe der Flüssigkeit zu sammeln. Um die TYLCV-Lokalisation in geernteten Weißfliegen PSG, Midgut oder Eierstockgeweben zu visualisieren, übertragen Sie 15 bis 20 Exemplare in eine 3,5 Zentimeter lange Glas-Petrischale und saugen den überschüssigen Puffer ab.

Fixieren Sie das Gewebe in einem Milliliter 4%Paraformaldehyd für zwei Stunden bei Raumtemperatur, bevor Sie die Proben dreimal für zwei Minuten in einem Milliliter frischer TBS pro Wäsche sorgfältig waschen. Nach der letzten Wäsche die Proben mit einem Milliliter 0,5%Triton X-100 30 Minuten lang permeabilisieren, bevor sie dreimal gewaschen werden, wie gerade mit einem Milliliter TBST pro Wäsche gezeigt wurde. Nach der letzten Wäsche jede unspezifische Bindung mit einem Milliliter 1%Rinderserumalbumin für zwei Stunden bei Raumtemperatur blockieren, gefolgt von drei Wäschen in TBST, wie gezeigt.

Nach der letzten Wäsche die Zellen mit den primären Antikörpern von Interesse über Nacht bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt kennzeichnen. Am nächsten Morgen die Proben dreimal mit TBST waschen, bevor Sie die entsprechenden Sekundärantikörper für zwei Stunden bei Lichtschutz im Raum hinzufügen. Am Ende der Inkubation die Mittelguts dreimal waschen und die Proben auf ein sauberes Mikroskopschlitten übertragen.

Entfernen Sie so viel Puffer wie möglich und färben Sie die Kerne mit einem Tropfen DAPI, bevor Sie mit einem Deckelbeschlag montieren und die beschrifteten Gewebe durch konfokale Mikroskopie untersuchen. Für die TYLCV-Quantifizierung die geernteten Weißfliegengewebeproben zwei- bis dreimal in frischem PBS waschen und 20 Mittelguts, 20 PSGs oder einen Eierstock in fünf Mikroliter PBS in einzelne PCR-Röhren mit 25 Mikroliter Lyselösung übertragen. Fügen Sie fünf bis sieben Zwei-Millimeter-Keramikperlen zu jedem Rohr hinzu und schleifen Sie die Proben in einem Homogenisator.

Fügen Sie eine Acht-Mikroliter-Probe Hämolympium in eine neue PCR-Röhre und fügen Sie 10 Mikroliter Lyse in das Rohr mit gründlicher Mischung. Inkubieren Sie alle Proben bei 65 Grad Celsius für eine Stunde, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 100 Grad Celsius und einer kurzen Zentrifugation. Als nächstes fügen Sie 18 Mikroliter Master-Mix in die Durchstechflaschen der quantitativen PCR-Streifenröhren und fügen Sie zwei Mikroliter jeder DNA-Probe zu mindestens drei Durchstechflaschen hinzu.

Wenn alle Proben geladen sind, schließen Sie die Rohre und zentrifugen, um die Lösung am Boden jeder Durchstechflasche zu sedimentieren. Laden Sie die Durchstechflaschen auf einen Echtzeit-Thermocycler für quantitative PCR, indem Sie Cyber als Fluorophorfarbstoff und unbekannt als Probentyp auswählen. Exportieren Sie dann die quantitativen Daten in eine Tabelle zur Analyse der relativen Menge der viralen DNA in jeder Probe.

Hier werden repräsentative Bilder von TYLCV in DAPI-Färbung in Whitefly PSGs, Midguts und Eierstöcken gezeigt. Wie beobachtet, zeigt TVLCV eine größere Akkumulation innerhalb der PSGs und Midguts als in den Eierstöcken. Die Quantifizierung des Virus in Whitefly PSGs, Midguts, Hämolymphe und Eierstöcken nach der Fütterung mit TYLCV-infizierten Tomaten für 24, 48 und 72 Stunden zeigt an, dass die Virusmenge in verschiedenen Weißfliegengeweben in direkter Korrelation mit der Zunahme des Zugangszeitraums für den Erwerb zunimmt.

Es ist am besten, frische Weißfliegen zu verwenden, da tote Insekten die Schwierigkeit der Sezieren erhöhen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Analysen, wie Western Blotting und Co-Immunoprecipitation, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur viralen Proteinexpression und viralen und Vektorprotein-Wechselwirkungen zu beantworten.