Name: Entdeckung von CsgD-Regulierungszielen im Salmonellen-Biofilm mit Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Erfahren Sie, wie ChIP-seq zur Analyse von Transkriptionsfaktor-Bindung in Salmonella-Biofilmen eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung regulatorischer Ziele von CsgD in Bakterien.

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Diese Forschung wurde durch ein Stipendium des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#2017-05737) an AW und durch den Jarislowsky Lehrstuhl für Biotechnologie unterstützt. MP wurde durch ein NSERC-CREATE-Stipendium im Rahmen des Integrated Training Program in Infectious Diseases, Food Safety and Public Policy (ITraP) an der Universität Saskatchewan unterstützt.
Die Autoren danken Dani Dale für die Dreharbeiten und Schnitte.

1. Flaschenkulturzellwachstum
<ol><li>Aus gefrorenen Beständen, Streifen Salmonella serovar Typhimurium Stämme auf LB Agar (20 ml festes Medium in 100 mm Petriplatte) mit dem entsprechenden Antibiotikum und inkubieren bei 37 °C für 16-20 h, um isolierte Kolonien zu erhalten.</li>
	<li>5 ml LB-Brühe mit dem entsprechenden Antibiotikum in einem 25 mm x 150 mm Borosilikat-Kulturrohr mit 1–3 Kolonien aus Streifenplatten ab Schritt 1.1 impfen. Bei 37 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen für 7 h inkubieren.</li>
	<li>Messen Sie OD600 der Brühekultur mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie ein Aliquot von Kultur 1 in 4 in PBS in einer 2 ml Küvette und messen Sie die Absorption bei 600 nm. Wir haben festgestellt, dass der wichtigste Faktor in diesem Schritt die Zeit des Wachstums ist. Die OD-Werte werden verwendet, um die Kulturen zu normalisieren, um die gewünschte Anzahl von Zellen in Schritt 1.4 zu liefern.</li>
	<li>Fügen Sie 1,0 OD600 Volumenäquivalent der Zellkultur (d. h. 109 Zellen) zu einem Erlenmeyerkolben hinzu, der 100 ml 1% Trypton mit dem entsprechenden Antibiotikum enthält. Bei 28 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen für 13 stunden inkubieren. Hinweis: Biofilmzellen werden als aggregierte Flocken und einzelne planktonische Zellen in den trüben Medien angezeigt.</li>
</ol>2. Sammeln zellfrei konditioniert 1% Trypton
<ol><li>Sammeln Sie Kolbenkultur für zellfrei konditionierte 1% Tryptone. Pipette Kolben Kultur mehrmals zu mischen, bevor sie zu einem Zentrifugenrohr hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min bei 10 °C, um alle Zellen zu pellet.</li>
	<li>Dekantieren Sie überstand in eine 0,2 m Filtereinheit, Vakuumfilter, und geben Sie in ein neues Rohr. Hinweis: Biofilmaggregate sind in konventionellen Lösungen (z.B. PBS) haften und kleben an den Seiten von Rohren und Pipettenspitzen. Da es eine einfachere Manipulation ermöglicht, verwenden wir konditionierte Medien (1% Trypton), um Biofilm zunächst zu bewegen und warme PBS unmittelbar vor der Vernetzung (Schritt 4.5) zu verwenden, um alle Proteinvernetzungssubstrate zu entfernen, die in den Medien vorhanden sein könnten.</li>
</ol>3. Trennung von Biofilm und planktonischen Zellen von Kolbenkulturen2
<ol><li>Mit einer sterilen 25 ml Pipette, Aliquot Kolbenkultur in 15 ml Rohre. Zentrifuge bei langsamer Geschwindigkeit (210 x g) für 2 min, um die beiden Zelltypen zu trennen. Hinweis: Biofilmzellen sollten ein loses Pellet an der Unterseite des Rohres bilden</li>
	<li>Pipette den Überstand, der planktonische Zellen enthält, in zwei 40 ml Zentrifugenröhren für später (Schritt 5). Entfernen Sie die restliche Flüssigkeit, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Zelltypen von allen Medien der Kolbenkultur getrennt wurden.</li>
</ol>4. Vorbereitung von Biofilmaggregaten
Hinweis: Biofilm wird durch Nassgewicht geerntet, um 25 g DNA zu liefern, das empfohlene Mindestausgangsmaterial für ChIP. Der Biofilm-Umrechnungsfaktor (BCF) von S. Typhimurium ist 1,73 x 108 KBE/mg2. Forscher, die andere Biofilmtypen vorbereiten, müssen empirisch die Anzahl der Zellen pro Gewichtseinheit des Biofilms definieren, die verwendet wird, um das Gewicht des Biofilms zu ermitteln, das für 25 g DNA-Ausgangsmaterial erforderlich ist, mit dieser Gleichung: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60736/60736eq1.jpg">
<ol><li>Wiegen Sie eine 2 ml Fangkappe oder ein Schraubverschlussrohr genau.</li>
	<li>Das Biofilmpellet in 1 ml konditioniertem Trypton wieder aufsetzen. Bewegen Sie den resuspendierten Biofilm in ein vorgewogenes 2 ml Schnappverschluss- oder Schraubverschlussrohr.</li>
	<li>Zentrifuge für 1 min bei 11 000 x g bei 20 °C</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig alle Überstand aus dem Rohr und wiegen Sie das Rohr genau. Subtrahieren Sie das Rohrgewicht vom Gewicht der Röhre mit Biofilm, um das Gewicht des Biofilms zu finden. Es sollte 10 % des Ziel-Biofilmgewichts betragen.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen, um verbleibende konditionierte Trypton zu entfernen. Fügen Sie 1 ml warme PBS in das Rohr und Wirbel sanft, um das Pellet wieder aufzuhängen. Zentrifuge für 3 min bei 8 000 x g, um Biofilm zu pellet und den Überstand zu entfernen. Fügen Sie 1 ml PBS in das Rohr und Wirbel, um das Pellet wieder aufzuhängen.</li>
</ol>5. Vorbereitung planktonischer Zellen
<ol><li>Zeichnen Sie das Volumen und die OD600 des planktonischen Überstandes aus der langsamen Geschwindigkeitszentrifugation (Schritt 3.2) mit einem Spektralphotometer auf</li>
	<li>Berechnen Sie das benötigte Volumen für eine endgültige OD600 von 6,0: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60736/60736eq2.jpg">
</li>
	<li>Zentrifuge auf 10 °C und Sedimentplanktonzellen durch Zentrifugation abkühlen (10.000 x g, 10 min bei 10 °C)</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet im endletzten PBS-Volumen, berechnet in Schritt 5.2, wieder auf.</li>
	<li>Die OD600 der planktonischen Zellen mit einem Spektralphotometer neu messen und das Volumen von 6,0 OD600 planktonischen Zellen in ein 2 ml Schnappverschluss- oder Schraubverschlussrohr abgeben.</li>
	<li>Bringen Sie die Lautstärke mit PBS auf 1 ml.</li>
</ol>6. Homogenisierende Zellen
<ol><li>Fügen Sie jedem der Rohre eine sterilisierte 5 mm Edelstahlperle hinzu.</li>
	<li>Homogenisieren Sie mit einer Mischermühle für 5 min bei 30 Hz. Beobachten Sie Aggregatrohre, um zu bestätigen, dass Biofilm auseinandergebrochen wurde.</li>
	<li>Übertragen Sie die homogenisierten Zellen auf ein neues 1,5 ml Rohr, um die Metallperle zu vermeiden. Bringen Sie die Lautstärke mit PBS auf 1 ml. Hinweis: Führen Sie serielle Verdünnungen durch, um Eingabezellen aufzuzählen, und überprüfen Sie, ob die endgültige Zellennummer nahe an der gewünschten oder vorhergesagten Zahl liegt.</li>
</ol>7. Vernetzung von Proteinen mit DNA
<ol><li>Frisches Formaldehyd in Probenröhrchen auf eine Endkonzentration von 1% geben. 30 min bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad inkubieren. Achtung: Formaldehyd ist ätzend, haut-, augen- und atemsaugend reizend und entzündlich. In einer Dunstabzugshaube dosieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 M Glycin zu einer Endkonzentration von 125 mM hinzu, um die Vernetzung zu beenden. 5 min bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad inkubieren.</li>
</ol>8. Waschzellen, um überschüssigen Vernetzen zu entfernen
<ol><li>Sedimentieren Sie die Zellen bei 8.000 x g für 3 min und entfernen Sie den Überstand</li>
	<li>Setzen Sie das Pellet in 20 l 25-fachen Proteasehemmern und 500 l filtersterilisiertem PBS aus.</li>
	<li>Zentrifugenrohr für 3 min bei 8000 x g und entfernen Sie den Überstand.</li>
</ol>9. Lysing-Zellen
<ol><li>Setzen Sie das Pellet in einem 600-L-Lysispuffer (siehe Tabelle 1)wieder auf und brüten Sie 10 min auf Eis.</li>
	<li>1,4 ml IP-Verdünnungspuffer (siehe Tabelle 1)zu einem sterilen 15 ml-Rohr hinzufügen und lysierte Zellen in das 15 ml-Rohr verschieben. Halten Sie die Röhre 1,5-2 h auf Eis und wirbeln Sie sanft und gelegentlich. Hinweis: Einige widerstandsfähige Zellmaterialien können in Rohren verbleiben. Eine lange Inkubationszeit auf Eis mit gelegentlichem Wirbel wird Material auseinanderbrechen. Der Rest wird durch Beschallung aufgebrochen.</li>
</ol>10. Fragmentierung der DNA durch Beschallung
<ol><li>Legen Sie das 15 ml-Rohr in einen Becher Auseis und legen Sie die 3 mm Sonde in das Rohr.</li>
	<li>Führen Sie 5 Beschallungsrunden von 30 s bei 20–40% von 400 W mit 2 min Kühlung auf Eis zwischen den Bursts durch.</li>
	<li>Sediment ausgefälltes Material durch Zentrifugation (8000 x g, 10 min bei 4 °C). Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre.</li>
	<li>Optional die Decrosslinking bei 65 °C für 30–60 min durchführen und RNA und Protein bei 45 °C für 30-60 min verdauen, bevor Sie auf einem 2% Agarose-Gel laufen, um nach Fragmenten der richtigen Größe zu suchen. Hinweis: Tauchen Sie die Sonde in das Zelllysat ein. Halten Sie die Lösung auf Eis, während Beschallung und Ruhe. Entfernen Sie das Rohr nicht, während die Beschallungssonde pulsiert. Die Lösung sollte trübe Vorbeschallung und klare Nachbeschallung erscheinen.</li>
</ol>11. Immunpräzipitierende DNA-Protein-Antikörper-Komplexe
<ol><li>Vorbereitung<ol>
<li>Geben Sie ein 1,35 ml aliquot für Immunpräzipitation und ein 200-L-Aliquot als Eingangskontrolle aus. Bewahren Sie die Eingabesteuerung bei -80 °C auf, bis Entkreuzungs- und Verdauungsschritte durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunpräzipitation mit primärem Antikörper<ol>
<li>Fügen Sie dem 1,35-L-Aliquot 10 g gereinigten proteinspezifischen Primärantikörper hinzu. Über Nacht bei 4 °C auf einem rotierenden Rad inkubieren. Hinweis: Der primäre Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper, ein hochwertiges polyklonales Serum oder ein kommerzieller Epitop-Antikörper (d. h. Anti-FLAG) sein.</li>
		<li>Fügen Sie den Röhren ab Schritt 11.2.1 50 l Protein G-Magnetperlen hinzu und inkubieren Sie bei 4 °C für 3 h auf einem rotierenden Rad.</li>
		<li>Platzieren Sie IP-Waschpuffer 1, IP-Waschpuffer 2 und TE pH 8.0 (siehe Tabelle 1) in einem Eiskübel. Warmer Elutionspuffer auf 65 °C. Hinweis: Legen Sie die Lösung, die den Elutionspuffer enthält, nicht auf Eis.</li>
		<li>Binden Sie die Protein G Magnetperlen mit einem magnetischen Ständer an die Seite von Röhrchen</li>
		<li>Waschen: 2x mit 750 l kalter IP-Waschpuffer 1 waschen, 1x mit 750 l kaltem IP-Waschpuffer 2 waschen und 2x mit 750 l kaltem TE bei pH 8,0 waschen. Halten Sie die Rohre während des Einwass auf dem magnetischen Ständer.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Rohr 450 l IP-Elutionspuffer (siehe Tabelle 1) hinzu und inkubieren Sie bei 65 °C 30 min mit sanfter Wirbelung alle 5 min.</li>
		<li>Binden Sie Perlen an der Seite von Rohren mit einem magnetischen Ständer. Warten Sie mindestens 2 min, bis die Lösung klar ist.</li>
		<li>Geben Sie den gereinigten Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr, wobei Sie darauf achten, das magnetische Perlenpellet nicht zu stören.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. Entvernetzung von DNA-Protein-Komplexen und Verdauung von koreinigender RNA und Protein
<ol><li>Fügen Sie 2 g RNase A und NaCl zu einer Endkonzentration von 0,3 M in jedes Rohr.</li>
	<li>Bei 65 °C, für 6 h oder über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Vollständige Proteinverdauung durch Zugabe von 180 g Proteinase K zu jeder Röhre, dann inkubieren bei 45 °C für 3–5 h.</li>
</ol>13. Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung
<ol><li>DNA mit magnetischen Perlen reinigen Hinweis: Magnetperlen werden bevorzugt, um die kleinen Mengen an DNA zu isolieren, die normalerweise während ChIP mit Bakterienzellen zurückgewonnen werden.</li>
	<li>Bereiten Sie Bibliotheken mithilfe eines Kits vor, das mit der ausgewählten Sequenzierungsplattform kompatibel ist.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Bibliothekskonzentration mit einem Fluorometer und einem breit gefächerten dsDNA-Kit oder einem qRT-PCR-Bibliotheks-Quantifizierungskit. Hinweis: Nach unserer Erfahrung können Fluorometermessungen die DNA-Konzentration überschätzen.</li>
	<li>Poolbibliotheken, die eine angemessene Abdeckung für jedes Bibliotheksbeispiel berücksichtigen. Für die Illumina-Sequenzierung mit Salmonellahaben wir 10–12 Bibliotheken gepoolt. Tris-HCl pH 8.0 zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzufügen.</li>
	<li>Sequenz nach den Spezifikationen der ausgewählten Plattform.</li>
</ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieses Protokoll skizziert eine Technik zur Durchführung von ChIP-seq mit Salmonella enterica serovar Typhimurium Biofilm und planktonischen Zellen aus reiner Kultur, um regulatorische Ziele des Master-Biofilmregulators CsgD zu finden. Wir erwarten differenzielle Bindungsinformationen aufgrund der Bi-Stabilität von CsgD in den beiden Zelltypen, mit hohen Konzentrationen in Biofilmaggregaten und niedrigen Konzentrationen in planktonischen Zellen2,3. Diese Technik kann jedoch auch auf andere bakterielle Transkriptionsfaktoren, Zelltypen oder Wachstumsbedingungen angewendet werden. Insbesondere kann diese Technik mit einem experimentell ermittelten Umwandlungsfaktor für Die KBE pro Gewichtseinheit von Biofilmzellen an andere bakterielle Biofilme angepasst werden.
ChIP-seq kann durch Sequenzierung anfällig für die Verstärkung technischer Fehler sein; Eine Bestätigung bei kritischen Schritten kann dies jedoch verhindern27. Primäre Antikörperspezifität ist wichtig für die Auswahl nur des Zieltranskriptionsfaktors und der DNA, die es während der Immunpräzipation kontrolliert7. In diesem Experiment wurde csgD mit einem plasmidcodierten 3xFLAG-Tag am 3'-Ende des Gens verschmolzen, das dem C-Terminus von CsgD22entspricht. Das p3xFLAG-Plasmid ohne csgD wurde als "Kontrolle"(S. Typhimurium 14028 csgD + p3xFLAG). ENCODE-Richtlinien empfehlen die Durchführung von Immunoblots mit primärem Antikörper gegen das Protein von Interesse und Lysaten von ChIP-Stämmen und Deletionsstämmen21. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Wachstumsbedingungen in allen Replikationen konsistent sind, um die Variabilität der Transkriptionsfaktorbindung und der nachgelagerten Sequenzierungsergebnisse zu reduzieren. Wenn man darauf achtet, inokulum Größen und Pre-Inoculum Wachstumsbedingungen konsistent sind, Biofilm Wachstum in Kolbenkultur ist konsistent4. Es ist wichtig zu bestätigen, dass alle Biofilme nach der Homogenisierung auseinandergebrochen sind, um einen gleichberechtigten Zugang von Reagenzien, insbesondere Formaldehyd-Kreuzverlinkern, zu allen Zellen zu gewährleisten.
Mehrere Modifikationen können es Forschern ermöglichen, dieses Protokoll für andere DNA-bindende Proteine, Zelltypen, Stämme, Wachstumsbedingungen oder Laborgeräte zu verwenden. Wenn es für biofilmbildende Arten außer S. verwendet wird. Typhimurium, der Umrechnungsfaktor der koloniebildenden Einheiten pro Einheitsgewicht des Biofilms, muss experimentell bestimmt werden, indem verschiedene Mengen an Biofilm geerntet, der Biofilm gründlich homogenisiert und serielle Verdünnungen und Plattenzählungen ausgeführt werden, um eine Standardkurve zu erstellen, die bei niedrigeren Biofilmgewichten2möglicherweise nicht genau ist. Sonicator Energieübertragung und Zelltypwiderstand können abweichen; Daher wird ein Beschallungstest empfohlen, um die Anzahl der Beschallungsbursts zu ermitteln, die den Fragmentgrößenbereich erzeugen, der für die Nachbereitung und Sequenzierung der Bibliothek erforderlich ist11. Chromatin-Fragmentierung durch Mikrokokken-Nuklease ist eine Alternative zur Beschallung, die eine hohe Auflösung von Belegungsstellen erzeugt; Diese Methode kann jedoch zu Fragmentierungsverzerrungen7,28führen. Der DNA-Größenbereich kann in Abhängigkeit von nachgeschalteten Bibliotheksvorbereitungskits und Sequenzierungsplattformen geändert werden. Anstelle der Mischermühle können andere Homogenisierungsmethoden eingesetzt werden. Zum Beispiel kann ein Glasgewebe Homogenisator ersetzt werden, aber es kann Aerosolisieren oder unvollständig aufbrechen Biofilm. In Bezug auf die Kontrollen kann die vorimmunpräcipitate DNA in der Verarbeitung und Analyse der Nachsequenzierung normalisiert werden. Als Kontrollmittel kann auch eine Mock-IP-Steuerung mit artgerechtem normalem Antikörperserum verwendet werden13.
Forscher müssen die Einschränkungen dieser Methode berücksichtigen, wenn sie ein ChIP-seq-Experiment in Betracht ziehen. Erhebliche Änderungen können erforderlich sein, um sie an andere Biofilmtypen anzupassen. Zum Beispiel führt die sofortige Resuspension von Biofilm in PBS bei Salmonella Typhimurium zu einem messbaren Verlust von Biofilmaggregaten. Immunpräzipitation, die auf regulatorische Ziele von Transkriptionsfaktoren in Bakterien abzielt, kann zu sehr geringen Mengen an DNA führen, was eine Herausforderung für die Reinigung und detektion in späteren Schritten darstellt. Bias kann während des Scherens und der nachgeschalteten Manipulation während der Bibliothekserkennung9eingeführt werden. Darüber hinaus zeigt diese Methode keine In-vivo-Expressionsniveaus als Reaktion auf die Transkriptionsfaktorbindung. Forscher, die wenig Erfahrung in der Bioinformatik haben, können durch die Analysepipeline herausgefordert werden. Diese Methode kann zeitintensiv und teuer sein. Die Kosten für die Sequenzierung sind jedoch oft niedriger als bei einem Mikroarray und gehen im Laufe der Zeit zurück, da die technologischen Verbesserungen weiterhin vorgenommen werden.
Wenige Methoden in der Literatur beschreiben ChIP mit Bakterien, und die meisten bakteriellen Experimente beginnen mit einem einfachen Wachstumszustand13,14,15,17,18. Die ChIP-Probenvorbereitung mit Einzelzellen ist einfach und stellt weniger Herausforderungen dar als die ChIP-Probenvorbereitung mit Biofilmaggregaten. Was ChIP-seq betrifft, so wurden frühere Methoden zur Untersuchung von cis-regulatorischen Schaltkreisen, einschließlich der systematischen Entwicklung von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX), elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests (EMSA), ChIP-Chip, Promoter-Deletion und Reporteranalyse, durch ChIP-seq29ergänzt oder ersetzt. ChIP-seq ersetzt den ChIP-Chip aufgrund der fortschreitenden Technologien und der Verfügbarkeit der Sequenzierung. Die tiefe Sequenzierung bietet Forschern riesige Datenmengen, die Standorte mit geringerer Bindungsaffinität und höherer Basispaarauflösung mit weniger Ausgangsmaterial als ChIP-Chip11,30identifizieren können. Die Analyse von ChIP-Daten von Organismen mit hochwertigen Referenzgenomen ist im Allgemeinen schnell und spezifisch. Darüber hinaus ist ChIP-seq eine gründliche Methode zur Entdeckung in silico vorhergesagten Bindungsstellen, die möglicherweise nicht in allen Zelltypen, Wachstumsphasen oder Umgebungsbedingungen belegt sind31.
In Zukunft kann dieses Protokoll verwendet werden, um das Verständnis der bakteriellen Pathogenese, insbesondere biofilmbildender Organismen, zu erleichtern. Eine breite Anwendung dieser Technik und die Verfügbarkeit neuer Datensätze können zur Datenintegration führen, um Gruppen von Proteinen zu identifizieren, die zur Steuerung zellulärer Prozesse in biofilmbildenden Mikroorganismen mitlokalisieren32. Darüber hinaus können ChIP-seq- und RNA-seq-Daten integriert werden, um regulatorische Systemmodelle zu erstellen33.

Bakterielle Biofilme, strukturelle Aggregate von Zellen, die in eine selbst produzierte Matrix eingebettet sind, sind resistent gegen Austrocknung, Antibiotika und Wirtsimmunantworten1. Als solche verursachen sie anhaltende und chronische Infektionen und stellen Forscher aufgrund ihrer Überlebens- und Übertragungslösungen vor einzigartige Herausforderungen. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) wurde gefunden, um phänotypisch heterogene Populationen von Biofilm-Aggregaten zu etablieren, die gegen Austrocknung und Antibiotika resistent sind, und planktonischen Zellen, die Virulenzfaktoren in reine Kultur ausdrücken, wenn sie Umweltstress ausgesetzt sind (28 °C, Begrenzung von Nährstoffen)2. Diese beiden Zelltypen entstehen durch die bistabile Expression des Master-Biofilmregulators CsgD3. Wir haben vermutet, dass dies eine Bet-Hedging-Strategie für Salmonellensein kann, wo die planktonischen Zellen an der kurzfristigen Übertragung teilnehmen und Biofilmzellen in der Lage sind, langfristig in der Umwelt zu bleiben, bis eine Gelegenheit entsteht, einen neuen Wirt zu infizieren2,4. Viele der regulatorischen Elemente, die den csg-Operon-Ausdruck steuern, sind gut charakterisiert5. Abgesehen von adrA und dem csg operon6sind jedoch nur wenige regulatorische Ziele von CsgD bekannt. Die Identifizierung des CsgD-Regulierungsnetzes würde uns helfen, den Salmonellen-Lebenszyklus und die Rolle, die Biofilme bei der Übertragung spielen, besser zu verstehen.
Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) ist eine leistungsstarke In-vivo-Technik zur genomweiten Identifizierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen und liefert Informationen über regulatorische Prozesse mit Transkriptionsfaktoren, Histonmodifikationen oder Nukleosomen7. Neuere Studien haben diese Technik verwendet, um die Differentialproteinbindung zwischen Wachstumsbedingungen und Zelltypen8zu bewerten. Bei Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) werden DNA-Fragmente mit interagierenden Proteinen durch Antikörperauswahl der Zielproteine angereichert. Die Zellen werden geerntet und DNA-bindende Proteine werden durch formaldehyd-Kreuzlinkerbehandlung mit der DNA in vivo vernetzt. Die Zellen werden lysiert, wodurch der Zellinhalt freigesetzt wird, und Chromatin wird in etwa 200–600 bp Fragmente7geschert. DNA-Fragmente, die an das Zielprotein gebunden sind, werden mit Antikörpern immunpräzipiert und durch De-Vernetzung isoliert, gefolgt von der Proteinverdauung9. Diese DNA-Fragmente stellen Proteinbindungsstellen dar, die durch Hybridisierung zu einem Mikroarray (ChIP-Chip) oder durch tiefe Sequenzierung und Kartierung zur Genomsequenz10,11ergänzt werden. Obwohl ChIP-Chip-Experimente ausreichende regulatorische Daten liefern, sind sie aufgrund des Einsatzes teurer Sonden sowie Hybridisierung und Array-Bias12begrenzt. ChIP-seq hat einen größeren Dynamikbereich mit erhöhter Nukleotidauflösung und -abdeckung, verbessertem Signal-Rausch-Verhältnis und weniger Artefakten im Vergleich zu ChIP-Chip7.
ChIP wurde verwendet, um Sfh und OmpR Regulierung in Salmonella serovar Typhimurium13,14, Quorum-Sensing AphA Regulierung in Vibrio alginolyticus15, RpoS Regulierung in Escherichzu analysieren ia coli16, Virulenzregulator EspR-Regulierung bei Mycobacterium tuberculosis17, potentielle Digulylatcyclasen durch AmrZ-Regulierung in Pseudomonas aeruginosa18, sowie VraSR Regulierung in Staphylococcus aureus19. Die beschriebenen bakteriellen ChIP-Seq-Experimente beginnen mit dem Anbau von Zellen in flüssigen Medien und der Ernte in einzelliger Form. Die Analyse von Biofilmen und die entsprechende Genregulation stellen jedoch eine neue Reihe von Herausforderungen dar, um ein erfolgreiches ChIP-seq-Protokoll zu generieren. In diesem Protokoll wird ChIP-seq verwendet, um differenzielle regulatorische Ziele von CsgD, der S, zu finden. Typhimurium-Master-Biofilmregulator in Biofilm- und planktonischen Zelltypen. Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der geeigneten Mengen an Biofilm für ChIP-seq, Ernte Biofilm aus Kolbenkultur, Normalisierung Vonbiose und Einzelzell-Kontrollproben, Homogenisierung von Biofilm und vollständige Immunpräzipitation. Dies wird für die Untersuchung der regulatorischen Ziele in bakteriellen Biofilmen nützlich sein und kann für viele Arten angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Agarosepulver</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>Balance (Explorer pro)</td><td>Ohaus</td><td>EP214</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge (8510R)</td><td>Eppendorf</td><td>022627023</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>BR dsDNA-Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>ChIP-Grade Protein G Magnetische Beads</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9006 cOmplete</td><td></td></tr><tr><td>, EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>COEDTAF-RO ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Röhrchen 15 mL</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-500</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Röhrchen 50 mL</td><td>FroggaBio</td><td>TB50-500</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay Kit II</td><td>BioRad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>Einwegküvette, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoresegerät (mini-PROTEAN)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000</td><td></td></tr><tr><td>Bodenzentrifuge (Sorvall Evolution RC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>728211</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer (Qubit 3.0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>GelRed&reg; Nukleinsäure-Gel-Färbung 10 000x in Wasser</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA-Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator (Schütteln)</td><td>VWR</td><td>1570-ZZMFG</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator (Wasserbad-Schütteln)</td><td>New Brunswick</td><td>G76D</td><td></td></tr><tr><td>LB Medien</td><td>VWR</td><td>90000-808</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Ständer (DynaMag)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge (gekühlt)</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v3 (150 Zyklen)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Mühle</td><td>Retsch</td><td>MM400</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 115 mL Filtereinheiten, steril, 0,2 & Mikro; m Porengröße</td><td>Thermo Scientific</td><td>73520-980</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit für Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NGS Reinigung und Größenauswahl Magnetische Kügelchen</td><td>Machery-Nagel</td><td>744970.5</td><td></td></tr><tr><td>Normales Mausserum</td><td>AbCam</td><td>ab188776</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen mit durchsichtigem Deckel (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Pipettencontroller</td><td>FroggaBio</td><td>MP001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2542</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-FLAG Polyklonaler Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>RNase A (10 mg/ml; DNase- und Protease-frei)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Rotierendes Rad</td><td>Kristalltechnologien & Branchen</td><td>TR 01A</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Röhrchen (2,0 mL, farblos)</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette 25 mL</td><td>FroggaBio</td><td>94024</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Montreal Biotech Inc.</td><td>Libra S22</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlperlen, 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Konische Mikrospitze 1/8" (3mm) Ultraschallsonde</td><td>Sonics & Materialien, Inc.</td><td>630-0418</td><td></td></tr><tr><td>Trypton-Medien</td><td>VWR</td><td>90000-286</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall-Flüssigkeitsprozessor (Ultraschallgerät)</td><td>Sonics & Materialien, Inc.</td><td>VC300</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumgeräte (Vacufuge plus)</td><td>Eppendorf</td><td>022820001</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad 1 (Lab-line Aquabath)</td><td>Thermo Scientific</td><td>18000-1</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad 2 (Präzision)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221044</td><td></td></tr></tbody></table>

entdeckung von csgd-regulierungszielen im salmonellen-biofilm mit chromatin-immunpräzipitation und hochdurchsatz-sequenzierung (chip-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung (ChIP-seq) ist eine Technik, die verwendet werden kann, um die regulatorischen Ziele von Transkriptionsfaktoren, Histonmodifikationen und anderen DNA-assoziierten Proteinen zu entdecken. ChIP-seq-Daten können auch verwendet werden, um differentiale Bindung von Transkriptionsfaktoren in verschiedenen Umgebungsbedingungen oder Zelltypen zu finden. Zunächst wurde ChIP durch Hybridisierung auf einem Mikroarray (ChIP-Chip) durchgeführt; ChIP-seq ist jedoch durch technologische Fortschritte, abnehmende finanzielle Hürden für die Sequenzierung und massive Mengen hochwertiger Datenproduktion zur bevorzugten Methode geworden. Techniken zur Durchführung von ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen, einer Der Hauptquellen persistenter und chronischer Infektionen, werden in diesem Protokoll beschrieben. ChIP-seq wird auf Salmonella enterica serovar Typhimurium Biofilm und planktonischen Zellen durchgeführt, die auf den Master-Biofilm-Regulator CsgD abzielen, um die Differentialbindung in den beiden Zelltypen zu bestimmen. Hier zeigen wir die für die Ernte geeignete Menge an Biofilm, die Normalisierung zu einer planktonischen Kontrollprobe, die Homogenisierung des Biofilms für den Crosslinker-Zugriff und die Durchführung routinemäßiger ChIP-Seq-Schritte, um qualitativ hochwertige Sequenzierungsergebnisse zu erzielen.

Die Herstellung von Chromatin-Immunpräzipitationsproben aus bakteriellem Biofilm umfasst mehrere Schritte, wie in Abbildung 1dargestellt. Dazu gehören das Anbauen von Biofilm in der Kolbenkultur, das Sammeln konditionierter Medien, das Sammeln einer ausreichenden Menge an Biofilm und planktonischen Zellen als Kontrolle, das Waschen von Zellen in PBS, die Homogenisierung, die Vernetzung von Proteinen zur DNA, die Fragmentierung von DNA durch Beschallung, das Immunpräzipieren der DNA mit den entsprechenden Antikörpern und Protein-G-Perlen, das Waschen und Eluieren immunozipisierter DNA und die Reinigung der DNA.
S. Typhimuriumzellen, die in flüssiger Kultur unter biofilminduzierenden Bedingungen angebaut werden, durchlaufen einen Phänotypwechsel zu multizellulären Biofilmaggregaten und planktonischen Zellen. Diese Population wird etwa 40% Biofilmaggregate enthalten, die höhere Konzentrationen von Digulylatcyclasen (DGCs) und Biofilmregulatoren ausdrücken, und 60% planktonische Zellen, die höhere Konzentrationen von Virulenz-assoziierten Genen ausdrücken2,4 (Abbildung 2A). In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zum Ernten beider Zelltypen, um Transkriptionsstellen über ChIP-seq zu vergleichen; Dieses Protokoll kann jedoch für andere Arten von Biofilmen angepasst werden, die von anderen Bakterienarten gebildet werden. Biofilmaggregate und planktonische Zellen werden durch langsame Geschwindigkeitszentrifugation getrennt, die Biofilm pellets und planktonische Zellen im Überstand2 (Abbildung 2B) hinterlässt. Die Zelltypen werden dann für nachfolgende Schritte im Protokoll separat behandelt.
Die empfohlene Menge an DNA-Eingang für ChIP-seq beträgt 10-25 g20. In S. Typhimuriumkolbenkultur, 30 mg Biofilm ergibt etwa 25 g DNA. Da Biofilmaggregate eine Fülle von proteinhaltigem extrazellulärem Material haben, gehen wir davon aus, dass dies die Effizienz der Vernetzung beeinträchtigen würde. Wenn wir die verschiedenen Zelltypen einfach nach Zellzahl normalisieren würden, kann die Behandlung von planktonischen Zellen zu einer ungleichen Menge an vernetzten Produkten führen, die für die Immunpräzipitation vorgelegt werden. Ein Proteintest wurde durchgeführt, um die entsprechende Menge an planktonischem Zellmaterial zu bestimmen, die 30 mg Biofilm entspricht (Abbildung 3). 6.0 OD600 planktonische Zellen wurden geerntet, um 30 mg Biofilm zu entsprechen.
Biofilmaggregate müssen zuerst auseinandergebrochen werden, um einen gleichberechtigten Zugang des Verkreuzers zu allen Zellen zu ermöglichen. Wir fanden heraus, dass die gleichmäßigste und hochdurchsatzweiseste Möglichkeit, die Zellen zu homogenisieren, die Verwendung einer Mischermühle und einer 5 mm Edelstahlperle war (Abbildung 4A). Planktonische Zellen werden auf die gleiche Weise behandelt, um Variablen im ChIP-seq-Experiment zu reduzieren (Abbildung 4B).
Sobald die DNA durch Beschallung fragmentiert, vernetzt und mit RNase und Proteinase K behandelt wurde, kann sie auf einem 2% Agarose-Gel visualisiert werden. Beschallte DNA wird in eine Sammlung von Fragmenten zerlegt, die als Abstrich auf dem Agarose-Gel erscheinen. Die durchschnittliche Fragmentgröße nimmt mit einer zunehmenden Anzahl von Beschallungsausbrüchen ab (Abbildung 5). Die Energieübertragung variiert für verschiedene Beschallungseinheiten, daher wird ein Beschallungstest empfohlen, um die Anzahl der Beschallungsbursts zu bestimmen, die erforderlich sind, um DNA auf durchschnittlich weniger als 1 kb zu fragmentieren. Für unser ChIP-seq-Experiment haben wir 5 Bursts ausgewählt.
ENCODE-Richtlinien empfehlen eine Bestätigung der Antikörper-Zielbindungsaktivität mit einem Immunoblot21. In diesem Fall haben wir die Spezifität und Bindungsfestigkeit unseres Antikörpers durch Immunoblot an ganzen zellspezifischen Lysaten gemessen, die für ChIP vorbereitet wurden (Abbildung 6). Wir haben bestätigt, dass der Antikörper an CsgD-3xFLAG bindet; Anti-FLAG- und Anti-CsgD-Signale kolokalisieren sich mit dem erwarteten Molekulargewicht (28 kDa)22.
ChIP-Verfahren führen oft zu geringen DNA-Konzentrationen. Daher wurde ein Reinigungsverfahren gewählt, das Verunreinigungen entfernt und einen hohen Anteil der DNA beibehält. Die magnetische Perlenreinigung wurde über die säulenbasierte Reinigung gewählt, da sie niedrige Konzentrationen der Eingangs-ChIP-DNA besser beibehielt (Abbildung 7) und Verunreinigungen entfernte (Daten nicht dargestellt).
Aufgrund reduzierter Ausgangsmengen an DNA kann die Bibliotheksvorbereitung von ChIP-DNA verdünnte Adapter und PCR-Anreicherung erfordern. Vor der Sequenzierung können Bibliotheken durch Bioanalyzer-Ablaufvisualierung visualisiert werden, um die korrekte Größenverteilung vor und nach der PCR-Anreicherung zu bestätigen (Abbildung 8). Darüber hinaus sollte qPCR verwendet werden, um die Anreicherung von Bindungsregionen zu bestätigen, wenn ein bekanntes regulatorisches Ziel des Transkriptionsfaktors vorhanden ist, indem die Faltenveränderung (Ct) zwischen bekannter Ziel- und Referenzgensequenzhäufigkeit in immunoprezipierter und beschallter Input-DNA verglichen wird.
ChIP-Sequenzierungsdaten sollten analysiert werden, indem Qualitätsbewertungen zugewiesen, Basen niedriger Qualität gestutzt, Vorwärts- und Rückwärtslesevorgänge ausgerichtet werden (in gepaarter Endsequenzierung), zu einem hochwertigen Referenzgenom zusammengemontelt, Spitzen über dem Hintergrund gefunden und nachgelagerte Analysen durchgeführt werden (Abbildung 9A). Die nachgeschaltete Analyse sollte die Visualisierung und Anmerkung von Spitzen, die Konsistenz mit biologischen Replikationsproben und die Motivanalyse umfassen und könnte eine Differenzbindungsanalyse zwischen Bedingungen oder Zelltypen sowie die Datenintegration mit der Genexpression aus bekannten Pfaden umfassen. Bei ChIP-seq-Daten wie unserer sollten Spitzen als deutlich über dem Hintergrund liegend(Abbildung 9B,C, rote Balken) mit einer p-Wertbestimmung identifiziert werden, nicht nur durch Faltenwechsel. Letztendlich werden die zugeordneten Lesevorgänge anhand der Anmerkung des Referenzgenoms visualisiert (Abbildung 9D). Ein schlechtes ChIP-Seq-Ergebnis würde wie Input-Seq ohne signifikante Spitzen über dem Hintergrund erscheinen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig1.jpg"> Abbildung 1: Abbildung der Schritte in ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen. Im beschriebenen Verfahren hat S. Typhimurium-Zellen werden in 1% Tryptonkolbenkultur bei 28 °C mit Schütteln (1) angebaut, zellfreie konditionierte Medien werden für den Umgang mit Biofilmzelltypen (2) gesammelt, die verwendet werden, um eine ausreichende Menge an Biofilm und planktonischen Zellen zu sammeln (3). Diese Zellen werden mit PBS gewaschen und homogenisiert, um Biofilm (4) auseinanderzubrechen. Proteine sind mit einem Formaldehyd-Verlinker mit der DNA vernetzt, danach werden die Zellen lysiert, um Zellinhalte freizusetzen (5). Die DNA im Zelllysat wird durch Beschallung fragmentiert (6). Die mit dem Zielprotein vernetzte DNA wird durch Immunpräzipitation mit einem Antikörper ausgewählt, der an das Zielprotein und die Protein G-Magnetperlen bindet (7). Ausgewählte DNA wird aus Protein G-Magnetperlen (8) gewaschen und eluiert und zur Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung gereinigt (9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig2.jpg"> Abbildung 2: In-vitro-Kolbenmodell zum Studium von S. Typhimurium Biofilm Entwicklung. (A) S. Typhimuratzellen, die in 1% Trypton für 13 h bei 28 °C angebaut werden, durchlaufen phänotypumwechselzu den Biofilmaggregaten und planktonischen Zellen in der flüssigen Phase der Kolbenkultur. (B) Biofilmaggregate und planktonische Zellen aus der Kolbenkultur in (A) wurden 2 min durch Zentrifugation bei 210 x g getrennt. Der Überstand wurde für planktonische Zellpräparate geerntet und das Pellet für Biofilmzellpräparate geerntet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig3a.jpg"> Abbildung 3: Gesamtproteinkonzentrationen für planktonische Zellen und Biofilmzellproben, die von S geerntet wurden. TyphimuriumKolben Kultur. Es wurden farbmetrische Protein-Assays durchgeführt und Proteinmengen relativ zu einer BSA-Standardkurve bei 750 nm gemessen. Der Proteingehalt von lysierten planktonischen Zellproben bei 4,0, 6,0 und 8,0 OD600 wurde mit 30 mg Biofilmaggregaten verglichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig4.jpg"> Abbildung 4: Homogenisierung von Zellproben aus S. Typhimurium Biofilmkolbenkulturen. (A) Biofilmaggregate aus der in PBS (links) resuspendierten Kolbenkultur wurden mit einer Mischmühle bei 30 Hz für 5 min (rechts) homogenisiert. (B) Planktonzellen aus kolbenkultur, die in PBS resuspendiert wurden, wurden von der Mischermühle bei 30 Hz für 5 min verarbeitet, um die Konsistenz zwischen Zelltypproben zu gewährleisten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig5a.jpg"> Abbildung 5: Beschallungstest mit Vor-ChIP-Zelllysaten. Biofilm-Aggregat und planktonische Zellproben wurden getrennt, homogenisiert, vernetzt und lysiert. DNA-Protein-Komplexe wurden bis zu 8 Mal bei 30 s und 2 min auf Eis beschallt, um DNA in kleinere Fragmente zu brechen. Ein Teil des beschallten Lysats wurde auf einem 2% Agarose-Gel abgetrennt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig6a.jpg"> Abbildung 6: Zielbindende Spezifität von Anti-FLAG-Antikörpern, die in ChIP-seq verwendet werden. Die Antikörperspezifität wurde durch Immunoblotting gegen ganze Zelllysate beurteilt, die aus Kolbenkulturen des S hergestellt wurden. Typhimurium-Stämme wie gezeigt. Die Proben der DehnungcsgD + p3xFLAG/csgD und der WT-Biofilm stellen Biofilmaggregate dar, die aus Kolben geerntet werden, während Die Stamm-CsgD-p3xFLAG- und WT-Planktonzellen planktonische Zellen planktonische Zellen darstellen. Gereinigte CsgD mit T-Tags wurde als Steuerung geladen. Ganze Zelllysate wurden normalisiert, so dass in jeder Spur 30 g Gesamtprotein analysiert wurden. Zahlen auf der linken Seite beziehen sich auf die Größe (in kDa) der vorgefärbten Molekulargewichtsmarker. Primärer Antikörper für den oberen Fleck war ein polyklonaler Kaninchen-Anti-FLAG-Antikörper (Sigma-Aldrich #F7425), während der untere Fleck zusammen mit einem CsgD-spezifischen monoklonalen Antikörper2mit Kaninchen-Anti-FLAG inkubiert wurde. Goat Anti-Rabbit IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) und Goat Anti-Maus IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) wurden als sekundäre Antikörper verwendet. Fluoreszierende Signale wurden mit dem Odyssey CLx Bildgebungssystem und dem Softwarepaket Image Studio 4.0 (Li-Cor Biosciences) visualisiert. Repräsentative Bilder werden angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig7a.jpg"> Abbildung 7: Säulen- oder magnetische Perlen-basierte Reinigungsstrategien für kleine Mengen an DNA, die aus ChIP-seq-Experimenten resultieren. Proben bekannter DNA-Mengen wurden mit säulenbasierten Kits oder magnetischen Perlen gereinigt und die Konzentration des Eluats nach der Reinigung gemessen. Magnetische Perlen zeigten eine bessere Erholung bei niedrigen DNA-Spiegeln, ähnlich den geringen MENGEN an DNA, die typischerweise am Ende des ChIP-seq-Protokolls, aber vor der Vorbereitung der NGS-Bibliothek auftreten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig8.jpg"> Abbildung 8: ChIP-DNA-Präparate und nachfolgende Bibliotheken, die von Bioanalyzer visualisiert werden. (A) Die durchschnittliche Fragmentgröße der genomischen DNA nach Zelllyse und Beschallung betrug &lt;1000 bp, wobei die Mehrheit der Fragmente im Bereich von 200–500 bp lag. (B) Das Ausgangsmaterial für die Bibliotheksvorbereitung war unten entdeckt. (C) Adapterligation und PCR-Anreicherung ermöglichen die Verstärkung von Bibliotheksfragmenten. (D) Eine schlechte Bibliotheksvorbereitung hat niedrige DNA-Peaks, ungerade oder hochmolekulare Spitzen oder reichlich Adapterspitzen bei ca. 100 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig9a.jpg"> Abbildung 9: ChIP-seq-Daten werden mit bioinformatischen Werkzeugen analysiert und in einem Genombrowser visualisiert. Ein. Flussdiagramm zur typischen bioinformatischen Analyse von ChIP-seq-Daten. Rohlesevorgänge für Biofilm(csgD-Stamm + p3xFLAG/csgD) und planktonische Zellen (csgD + p3xFLAG) wurden für minderwertige Lese- und Adapter gereinigt und Szugeordnet. Typhimurium 14028s Genome (NC_016856.1 für das Chromosom und NC_016855.1 für das Plasmid) von Bowtie2 (v2.3.3.1) mit den Standardparametern23. MACS2 (v2.1.2) wurde verwendet, um die Peaks mit Denparametern von '-q 0.01 -- nomodel' aufzurufen und Biofilmreplikationen als Testdatensätze und planktonische als Steuerung24zu verwenden. Das MACS2 bdgcmp Modul wurde weiter verwendet, um Faltanreicherungsspur mit Parametern von '-m FE' zu erzeugen. Die signifikante Peak-Datei mit Falten-Anreicherungsspur wurde mit bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig25 in eine Perückendatei umgewandelt und mit DemIntegrative Genomics Viewer v2.5.126auf dem Referenzgenom visualisiert. Repräsentative Spitzen werden angezeigt (rote Balken). (B) Ein großer Bereich von 40 kbp, der mehrere Spitzen enthält, ist ein atypisches Ergebnis, aber immer noch potenziell wertvoll. (C) Dies ist ein typischeres Ergebnis, das zwei signifikante Spitzenregionen zeigt. (D) Zoomen Sie auf den linken Peak in C, zeigt Lesekarten zuordnung zum Bereich des S. Typhimurium 14028s Genom mit divergierenden Promotoren für uspA und uspB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig9alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Zelllysepuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lysis-Puffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl pH 8,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protease-Inhibitoren</td>
		</tr>
<tr>
<td>IP-Verdünnungspuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mM Tris-HCl pH 8,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% Triton X-100</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,01% SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>Immunpräzipitationspuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>IP-Waschpuffer 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mM Tris-HCl pH 8,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% Triton X-100</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1% SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>IP-Waschpuffer 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM Tris-HCl pH 8,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>250 mM LiCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% NP-40</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% Desoxycholsäure</td>
		</tr>
<tr>
<td>TE (T10E1) pH 8,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elutionspuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 mM NaHCO3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Pufferrezepte.

Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit der Sequenzierung der nächsten Generation (ChIP-seq) ist eine Methode, die verwendet wird, um Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und den von ihnen kontrollierten genomischen Sequenzen herzustellen. Dieses Protokoll skizziert Techniken zur Durchführung von ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen, wobei Salmonella enterica serovar Typhimurium bakterieller Biofilm als Beispiel verwendet wird.

Entdeckung von CsgD-Regulierungszielen im Salmonellen-Biofilm mit Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung, oder ChIP-Seq, ist eine Technik, die verwendet werden kann, um die regulatorischen Ziele von Transkriptionsfaktoren, Histonmodifikationen und anderen DNA-assoziierten Proteinen zu entdecken. In ChIP-seq werden Zellen geerntet und DNA-bindendes Protein. mit Formaldehyd mit DNA in vivo verbunden ist.Die Zellen werden lysiert, der Zellinhalt freisetzt und Chromatin wird in Fragmente von weniger als 1000 Basenpaaren, in der Regel zwischen 200 und 600 Basenpaaren, geschert. DIE DNA, die mit dem Zielprotein interagiert, wird mit Antikörpern immunpräzipiert und durch De-Vernetzung isoliert. DNA-Protein-Kreuzverbindungen werden umgekehrt und RNA und Protein verdaut.Die DNA wird gereinigt, in Bibliotheken umgewandelt und sequenziert. ChIP-seq-Daten können auch verwendet werden, um differentiale Bindung von Transkriptionsfaktoren in verschiedenen Umgebungsbedingungen oder Zelltypen zu finden. Zunächst wurde ChIP durch Hybridisierung auf einem Mikroarray durchgeführt.Die ChIP-Sequenzierung ist jedoch aufgrund technologischer Fortschritte, abnehmender finanzieller Hindernisse für die Sequenzierung und einer massiven qualitativ hochwertigen Datenausgabe zur bevorzugten Methode geworden. In diesem Protokoll zeigen wir Techniken zur Durchführung von ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen, einer der Hauptursachen für anhaltende und chronische Infektionen. ChIP-seq wird auf Salmonellentyphimurium-Biofilm und planktonischen Zellen durchgeführt werden, die auf den Master-Biofilm-Regulator, CSGD, abzielen, um die Differentialbindung in den beiden Zelltypen zu bestimmen.In diesem Video zeigen wir Techniken zur Bestimmung der geeigneten Menge an Biofilm für die Ernte, zur Normalisierung zu einer planktonischen Kontrollprobe, zur Homogenisierung von Biofilm für den Anschlusszugriff und zur Durchführung routinemäßiger ChIP-Seq-Schritte, um qualitativ hochwertige Sequenzierungsergebnisse zu erzielen. Streak Platte Salmonella enterica dienen unserem Typhimurium auf einer LB Agarplatte, um Kolonien zu isolieren und bei 37 Grad Celsius über Nacht zu brüten. Fünf mL LB Brühe mit ein bis drei Kolonien von der Streifenplatte impfen und bei 37 Grad Celsius mit Schütteln für sieben Stunden bebrüten oder DasWachstum protokollieren.Finden Sie die optische Dichte der Kolbenkultur bei 600 Nanometern, indem Sie ein Spektralphotometer verwenden, und fügen Sie ein OD 600-Äquivalent der Zellkultur oder 10 zu den neun Zellen zu einem Erlenmeyerkolben hinzu, der 100 Milliliter eines Prozenttryptons enthält. Bei 28 Grad Celsius mit Schütteln 13 Stunden bebrüten. Biofilmzellen erscheinen als aggregierte Flocken und einzelne planktonische Zellen befinden sich in den trüben Medien.Biofilm sind sehr widerstandsfähig und kleben an den Seiten von Rohren und Pipettenspitzen. Wir verwenden konditionierte Medien, um Biofilm zunächst zu bewegen und verwenden warme PBS unmittelbar vor der Vernetzung, um Proteinvernetzungssubstrate in den Medien zu entfernen. Forscher müssen möglicherweise eine geeignete Lösung finden, um Biofilm wieder in suspendieren.Sammeln Sie die Kolbenkultur in einem Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 12.000 G für 10 Minuten bei 10 Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand in eine 0,2 Mikrometer-Filtereinheit und einen Vakuumfilter. Aliquot Kolbenkultur in Röhren und Zentrifuge mit langsamer Geschwindigkeit, um die beiden Zelltypen zu trennen.Biofilmzellen befinden sich im Pellet am Boden der Röhre und einzelne Zellen im trüben Überstand. Pipette der Überstand, der planktonische Zellen enthält, in ein Zentrifugenrohr für später. 25 Mikrogramm DNA werden als Input für ChIP-seq-Experimente empfohlen.In unserem Fall ergeben 30 Milligramm Biofilm etwa 25 Mikrogramm DNA. Da Biofilmaggregate eine Fülle von proteinhaltigem extrazellulärem Material haben, konkurriert es um Vernetzen und kann zu ungleichen vernetzten Produkten führen, die für die Immunpräzipitation präsentiert werden. Es wird ein Proteintest zur Bestimmung des äquivalenten Zellmaterials durch Proteinkonzentration vorgeschlagen.In diesem Fall werden sechs OD 600 planktonische Zellen als Kontrolle für 30 Milligramm Biofilm geerntet. Biofilm wird durch Nassgewicht geerntet und die Koloniezuchteinheiten des Biofilms können mit dem gezeigten Umrechnungsfaktor gefunden werden. Die Forscher werden ermutigt, den Umrechnungsfaktor der Biofilmbildenden Arten zu finden, mit denen sie durch Homogenisierung und Tropfenverdünnungen arbeiten.Das Biofilmpellet in einem Milliliter konditioniertem Trypton wieder aufhängen und in eine vorgewogene Zwei-Milliliter-Snap-Cap oder ein Schraubverschlussrohr bewegen. Zentrifuge für eine Minute bei 11.000 G. Entfernen Sie den Überstand aus dem Rohr und wiegen Sie das Rohr genau. Subtrahieren Sie das Rohrgewicht vom Gewicht des Rohres mit Biofilm, um das Gewicht der Aggregate zu finden.Es sollte innerhalb von 10% des Ziel-Biofilmgewichts liegen. Fügen Sie einen Milliliter PBS und Wirbel hinzu, um Biofilmaggregate wieder aufzuhängen. Geben Sie den Überstand aus der langsamen Geschwindigkeitszentrifugation in Zentrifugenrohre.Messen Sie die optische Dichte der planktonischen Zellen mit einem Spektralphotometer bei 600 Nanometern und berechnen Sie das benötigte Volumen für eine endgültige OD 600 von sechs. Kühlen Sie die Flora-Zentrifuge auf 10 Grad Celsius und pellet die planktonischen Zellen mit der Flora-Zentrifuge. Zentrifuge bei 10.000 G für 10 Minuten bei 10 Grad Celsius.Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet in PBS wieder auf. Messen Sie die OD 600 der planktonischen Zellen mit einem Spektralphotometer neu und geben Sie das Volumen von sechs PLANktonzellen OD 600 in ein zwei Milliliter-Snapcap oder Schraubverschlussrohr. Biofilmaggregate müssen auseinandergebrochen werden, damit vernetzende Zellen zugreifen können.Planktonische Zellen werden auf die gleiche Weise behandelt wie Biofilmzellen, um Variablen zu reduzieren. Die Verwendung von Metallperlen in einer Mischermühle kann effektiver sein, um Biofilm aufzubrechen als Glasgewebehomogenisatoren. Aseptisch, fügen Sie eine sterilisierte Metallperle zu jedem der Rohre.Mit einer Mischmühle fünf Minuten lang bei 30 Hertz homogenisieren. Beobachten Sie Aggregatrohre, um zu bestätigen, dass der Biofilm auseinandergebrochen wurde, bevor Sie die homogenisierten Zellen in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr übertragen, wodurch die Metallperle vermieden wird. Bringen Sie das Volumen mit PBS auf einen Milliliter.An diesem Punkt ist es optional, Tropfenverdünnungen durchzuführen, um Eingabezellen aufzuzählen. Frisches Formaldehyd in Probenröhrchen auf eine Endkonzentration von einem Prozent geben. 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad inkubieren.Glycin zu einer Endkonzentration von 125 Millimolar hinzufügen, um die Vernetzung zu löschen und fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad zu brüten. Um die Zellen zu waschen und überschüssigen Vernetzen zu entfernen, Zentrifugieren Sie für drei Minuten bei 8.000 G und entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in Protease-Inhibitoren und 500 Mikroliter Filter sterilisierte PBS wieder aus.Das Pellet in 600 Mikroliter Lysepuffer wieder aufhängen und 10 Minuten auf Eis brüten. Verschieben Sie das Partilysat in ein neues Rohr, das 1,4 Milliliter IP-Verdünnungspuffer enthält. Eineinhalb bis zwei Stunden auf Eis halten und gelegentlich Wirbel machen.Einige widerstandsfähige Materialien können in den Rohren verbleiben. Eine lange Inkubationszeit und gelegentliche Wirbel werden jedoch aggregiertes Material auseinanderbrechen und der Rest wird während der Beschallung gebrochen. Tune den Beschallungsgerät.Legen Sie die 15 Milliliter Tube in einen Becher Eis und legen Sie die Sonde in die Röhre. Puls bei 20 bis 40 Prozent für fünf Beschallungsausbrüche von 30 Sekunden und kühlen zwischen Beschallungsrunden ab. Das Zelllysat erscheint vor der Beschallung trüb und nach der Beschallung klar.Um ausgefälltes Material zu entfernen, Zentrifuge bei 8 000 G für 10 Minuten bei vier Grad und geben Sie den Überstand in ein neues Rohr, um das schwarze Pellet zu vermeiden. Die Energieübertragung von Sonicator und der Zelltypwiderstand können unterschiedlich sein, sodass ein Beschallungstest empfohlen wird, um die Anzahl der Beschallungsrunden zu ermitteln, die den Fragmentgrößenbereich erzeugen, der für die Nachflussbibliotheksvorbereitung und -sequenzierung erforderlich ist. Geben Sie beschallte DNA in ein 1,35 Milliliter Aliquot für Immunpräzipitation und einen 200-Mikroliter-Aliquot als Eingabe-DNA.Halten Sie die Eingabesteuerung bei minus 80 Grad Celsius, bis die Schritte zum Entnetzen und Verdauen deaktiviert werden. Nach dem Testen der Antikörper, um ihre Spezifität für das Zielprotein zu gewährleisten, fügen Sie den Antikörper zu Immunpräzipitationsröhrchen hinzu und brüten bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem rotierenden Rad. 50 Mikroliter Protein G-Magnetperlen hinzufügen und bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad drei Stunden lang brüten.Binden Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer an die Seiten von Rohren und führen Sie Wähvorgänge durch. Zweimal mit 750 Mikroliter kaltem IP-Waschpuffer waschen. Waschen Sie einen mit 750 Mikroliter kalten IP-Waschpuffer zwei.Und zweimal mit 750 Mikroliter kaltem TE bei pH-Wert acht waschen. Halten Sie die Rohre während der Wähzweiungen auf dem magnetischen Ständer. Fügen Sie 450 Mikroliter IP-Elutionspuffer in jede Röhre und inkubieren bei 65 Grad Celsius für 30 Minuten mit sanften Wirbeln alle fünf Minuten.Binden Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer an die Seiten von Rohren. Warten Sie mindestens zwei Minuten, bis die Lösung klar ist, und geben Sie die gelöschte Lösung dann auf ein neues 1,5-Milliliter-Rohr. Um Kreuzverbindungen umzukehren und RNA zu verdauen, fügen Sie zwei Mikrogramm RNase acht hinzu und fügen Sie Natriumchlorid zu Ihrer Endkonzentration von 0,3 Mol in jeder Röhre hinzu.Bei 65 Grad Celsius für mehr als sechs Stunden oder über Nacht inkubieren. Um Protein zu verdauen, fügen Sie 180 Mikrogramm Proteinase K in jede Röhre und inkubieren bei 45 Grad Celsius für drei bis fünf Stunden. Reinigen Sie die DNA.Magnetische Perlen werden bevorzugt für die Isolierung der kleinen Mengen an DNA während ChIP mit Bakterienzellen zurückgewonnen. Eine säulenbasierte oder phenylchlorforme Extraktion kann jedoch die ChIP-DNA angemessen wiederherstellen. Nach der Reinigung werden Bibliotheken aus gereinigter ChIP-DNA mit einem Kit hergestellt, das mit der ausgewählten Sequenzierungsplattform kompatibel ist.ChIP-DNA-Bibliotheken erfordern häufig das Hinzufügen der minimalen Anzahl von Adaptern und die maximale Anzahl von PCR-Verstärkungszyklen. Überprüfen Sie die Bibliotheksgröße mit einem Bioanalyzer und überprüfen Sie die Bibliothekskonzentration mit einem Cubit oder einem QPCR-Bibliotheksquantifizierungskit. Bündeln Sie die Bibliotheken, und fahren Sie mit der Sequenzierung gemäß der Spezifikation der ausgewählten Plattform fort.Die Analyse von ChIP-seq-Daten erfordert die Bewertung der Basisqualität, das Trimmen von Basen von geringer Qualität, das Ausrichten einer Assembly liest sich an einem Referenzgenom, ruft Spitzen auf, assoziiert Spitzen mit Genen und analysiert überrepräsentierte Bindungsmotive. ChIP-seq-Daten haben in der Regel einen niedrigen Hintergrund. DNA, die durch das Protein kontrolliert wird, das durch Immunpräzipitation angegriffen wird, wird angereichert und erscheint als Spitzen, die mindestens zweifach über dem Hintergrund liegen.In diesem Video haben wir Methoden beschrieben, um ChIP-seq auf Salmonellen-Biofilm und einzelnen planktonischen Zellen durchzuführen, die Spitzen der angereicherten DNA bei Genen ergeben, die durch den Transkriptionsfaktor von Interesse gesteuert werden. Der Großteil des bakteriellen Lebens in der Natur wird angenommen, dass in Biofilmen vorhanden ist und bis zu 40% der menschlichen Krankheiten werden angenommen, dass biofilmbedingt. Sie haben also enorme medizinische und wirtschaftliche Auswirkungen.Biofilm ist jedoch resistent und schwieriger aufzuzählen, aufzubrechen und zu manipulieren. Die Forscher können die von uns beschriebenen ChIP-Seq-Techniken verwenden, um eine angemessene Menge an Biofilm zu ernten, den Biofilm zu homogenisieren, Lysezellen zu homogenisieren, zu beschallen, Immunpräzipitation durchzuführen, DNA von anderen biofilmbildenden Bakterienarten zu reinigen und zu sequenzieren.

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Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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Entdeckung von CsgD-Regulierungszielen im Salmonellen-Biofilm mit Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) (Video) | JoVE Journal

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