Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellpopulationen in der Tumormikroumgebung

Die räumliche Organisation der Immunzellen in der Tumormikroumgebung hat einen klinischen Wert. Diese Strategie kann leicht für die Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen innerhalb von Tumorgewebe verwendet werden. Die Immuntherapie hat die Krebsbehandlung revolutioniert.

Allerdings reagieren nicht alle Patienten gut. Diese Strategie kann dazu dienen, die Gewebe-Immun-Signaturen zu definieren, die eine gute Anti-Tumor-Reaktion vorhersagen können. Testen Sie vor der Durchführung eines Experiments die Antikörperkombinationen und Stripping-Techniken an Kontrollgeweben und überprüfen Sie, ob die APPs bei der Detektion von Markern von Interesse genau sind.

Da schriftliche Beschreibungen von Bildanalysemethoden eine ausgeklügelte technische Sprache verwenden, erleichtert die Kombination von Text und Video ein besseres Verständnis und eine bessere Replikation der Methodik. Für die Antigenrückgewinnung von formalinfixierten, paraffineingebetteten Tumorgewebeabschnitten tauchen Sie die entwachste Gewebeprobe in ein Coplin-Glas mit Antigen-Retrieval-Lösung ein und legen Sie das Glas in einen elektrischen Schnellkochtopf, der Leitungswasser enthält. Der Wasserstand sollte die Hälfte der Höhe des Glases nicht überschreiten, damit sich das Wasser nicht mit der Antigen-Retrievallösung vermischt.

Schließen Sie den Deckel und das Druckventil am Herd und behandeln Sie die Dias 10 Minuten lang mit hohem Druck. Ziehen Sie am Ende der Behandlung den Herd ab, lassen Sie den Druck los und öffnen Sie den Deckel. Nachdem die Dias im Herd für 30 Minuten abgekühlt sind, waschen Sie die Proben zwei Mal für fünf Minuten in frischem PBS pro Wäsche in einem neuen Coplin-Glas, und verwenden Sie dann einen hydrophoben Stift, um eine Barriere um jeden Gewebeabschnitt zu ziehen.

Als nächstes tauchen Sie die Dias in 0,1-Molarenglycin in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur ein, bevor Sie die Dias zweimal in PBS spülen, wie gezeigt. Nach der zweiten Wäsche die Dias in eine Feuchtigkeitskammer geben und jeden Gewebeabschnitt mit einer Blockierlösung abdecken. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur die Abschnitte zweimal für fünf Minuten in frischem PBS-Tween pro Wäsche abspülen und dann die primären, in Blockierlösung verdünnten Antikörper zu jedem Dia, vor Licht geschützt, hinzufügen.

Am Ende der Inkubation die Dias dreimal in frischem PBS-Tween für fünf Minuten pro Wäsche abspülen, dann die Abschnitte mit den entsprechenden Sekundärantikörpern für eine Stunde bei Raumtemperatur beschriften. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Dias dreimal in frischem PBS-Tween für fünf Minuten pro Wäsche. Folgen Sie mit einer einzigen Spülung in doppelt destilliertem Wasser.

Entfernen Sie das überschüssige Wasser von jedem Schlitten und montieren Sie das Gewebe mit Montagemedium, ergänzt durch DAPI und einen Abdeckschlitten. Nachdem Sie das überschüssige Montagemedium herausgequetscht haben, lassen Sie die Dias 20 Minuten bei Raumtemperatur trocknen, geschützt vor Licht, bevor Sie bilder für alle Kanäle mit einem Ganzdiascanner erfassen. Öffnen Sie nach dem Scannen die Bilder in der Bildanalysesoftware, und klicken Sie auf die Registerkarte Tissuealign.

Um die Bilder zu importieren, die in das Folienfach ausgerichtet werden sollen, wählen Sie das erste Bild aus, das aus der Datenbank ausgerichtet werden soll. Wenn alle Bilder geladen wurden, klicken Sie in den Schritten Workflow auf Weiter, um die Bilder zu verknüpfen, und ziehen Sie alle Bilder, die am ersten Bild ausgerichtet werden sollen, und legen Sie sie ab. Wenn alle Bilder entsprechend verknüpft wurden, verwenden Sie mindestens drei Pins pro Bild, die homologe Gewebemerkmale in den verknüpften Bildern anzeigen.

Verwenden Sie einen Pin, um das erste Bild zu verfolgen, um die Qualität der resultierenden Ausrichtung zu überprüfen. Wenn eine zufriedenstellende Ausrichtung erreicht wurde, klicken Sie auf Weiter, um die Bildebenen anzuzeigen und das zusammengesetzte Bild in der Datenbank zu speichern. Um eine Gewebeerkennung mit dem benutzerdefinierten Protokoll APP 1 durchzuführen, öffnen Sie die Registerkarte Bildanalyse und öffnen Sie das zusammengesetzte Bild im Bildanalysemodul.

Klicken Sie auf das Symbol APP öffnen und die entsprechende APP auswählen. Um zu bestätigen, dass die APP funktioniert, navigieren Sie zu einer ausgewählten Gewebeposition, und klicken Sie auf Vorschau. Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, klicken Sie auf , um das Bild mit der ausgewählten APP zu verarbeiten.

Während der Verarbeitung bestimmt die APP, ob das Pixel mit dem Gewebe verknüpft ist, um die Umwandlung aller gewebeassoziierten Pixel in einen Bereich von Interesse zu ermöglichen. Der neu erstellte Interessenbereich kann dann auf jedes der ausgerichteten Bilder übertragen werden. Klicken Sie am Ende der Analyse auf Datei und Speichern, um das geänderte Bild mit dem neu erstellten Interessenbereich zu speichern.

Für die Segmentierung des Gewebes in Stroma und Parenchym öffnen Sie die Registerkarte Bildanalyse und wählen Sie die interessierten Dateien aus der Datenbank aus. Öffnen App 2, APP 2 verwendet die PSR-gefärbte Bild für Gewebesegmentierung. Vorschau APP 2 durch Verarbeitung des Bildes in einem ausgewählten Sichtfeld.

Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, klicken Sie auf Ausführen, um APP 2 auf dem vollständigen Bild zu verarbeiten. Die Interessenregion des Gewebes wird in Stroma und Parenchym segmentiert und ihre jeweiligen Bereiche bestimmt. Die neu geschaffenen Bereiche von Interesse für stroma und parenchyma können auf die ausgerichteten Bilder übertragen werden, dann exportieren und speichern Sie das modifizierte Bild wie gezeigt.

Um Zellpopulationen von Interesse zu identifizieren und zu quantifizieren, importieren Sie das segmentierte Bild von Interesse in das Bildanalysemodul. Öffnen Sie nach dem Anpassen der Farbe APP 3. APP 3 wird die Zellpopulationen von Interesse erkennen und sie innerhalb des Parenchyms und des Stromas quantifizieren.

Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, führen Sie APP 3 auf dem vollständigen Bild aus. Alle einzelnen Von interesseten Zellen werden beschriftet, ihre Gewebekoordinaten gespeichert und die Dichte der Voninteresseszellen in den Stroma- und Parenchymalregionen bestimmt. Das geänderte Bild kann dann wie gezeigt gespeichert werden.

Um die Gewebe-Wärmezuordnung der mit Der Interessen zelleiver bezeichneten Objekte durchzuführen, öffnen Sie das entsprechende benutzerdefinierte Protokoll im APP-Auswahlfenster, und klicken Sie auf Ausführen, um die APP aufzufordern, die Koordinaten der mit Antikörpern beschrifteten Objekte zum Generieren der Heatmap zu verwenden. Hot-Spot-Bereiche, rot hervorgehoben, enthalten die höchste Dichte der Zellpopulation von Interesse, während die dunkelblauen Bereiche die niedrigsten haben. Die Wärmekarte einer bestimmten Zellpopulation kann auf die ausgerichteten Bilder überlagert werden, um zusätzliche Informationen darüber zu liefern, wie diese Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung organisiert sind.

Exportieren Und speichern Sie dann die Gewebe-Wärmekarte. Es ist wichtig, die Spezifität der Beschriftung, die Genauigkeit der entworfenen APPs und die Abisolierungs- und Reproduziereffizienz der verschiedenen Flecken auf demselben Abschnitt zu überprüfen. Durch die Integration von serieller Bildgebung, sequentieller Kennzeichnung und Gewebeausrichtung können mehr Marker gleichzeitig visualisiert und weitere Informationen aus begrenzten klinischen Proben extrahiert werden.

Die H&E-Färbung von resektierten Tumorgewebeabschnitten ermöglicht die Bewertung der Gewebearchitektur, der Zellmorphologie und klinisch relevanter Parameter wie maligne Art, Tumorgrad und allgemeine Immuninfiltration. CD34 Färbung ermöglicht den Nachweis von Endothelzellen. Cytokeratin 8/18 Färbung zeigt das Vorhandensein von Epithelzellen, und Anti-Alpha glatte Muskel-Actin Färbung ermöglicht die Identifizierung von fibrogenen, aktivierten, leberstellaten Zellen.

Das Reprobing mit Antikörpern gegen CD68 und Desmin ermöglicht den Nachweis von Makrophagen bzw. Myofibroblasten. Um das Tumor-Immun-Infiltrat besser charakterisieren zu können, kann eine Färbung nach T-Zell-Markern und Myeloperoxidase durchgeführt werden. Picro Sirius Rote Färbung kann auch durchgeführt werden, um fibrillares Kollagen zu visualisieren und Stroma und Parenchymsegmentierung zu erleichtern.

Gewebeassoziierte Pixel innerhalb der gebeizten Abschnitte können identifiziert werden, um die Segmentierung verschiedener Fächer innerhalb eines bestimmten Interessenbereichs zu ermöglichen. Die von Interesse sindden Zellpopulationen können dann innerhalb jeder Region identifiziert werden, so dass Gewebekarten erstellt werden können, für die Regionen mit hoher Dichte für eine bestimmte Zellpopulation als Hotspots und Regionen mit einer relativ geringen Dichte als kalte Flecken angezeigt werden. Diese Methode zur Identifizierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen in Gewebeproben kann an spezifische Forschungsfragen und Marker von Interesse angepasst und validiert werden.

Diese Strategie kann auf Gewebe-Mikroarrays für die Analyse mit hohem Durchsatz angewendet werden. Es kann auch mit In-situ-Hybridisierung kombiniert werden, um gleichzeitig In-situ-Protein und Genexpression zu untersuchen. Wir haben diese Strategie verwendet, um IL-17A-produzierende Zellen in situ in fibrotischem Lebergewebe von Patienten zu identifizieren und zu kartieren.

Wie im Protokoll angegeben, sind mehrere Reagenzien chemisch gefährlich, und die entsprechenden Verfahren sollten in einer chemischen Haube mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung und Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt werden.