Quantifizierung der Lebergröße in Larval Zebrafischen mit Brightfield-Mikroskopie

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die Lebergröße in Larvenzebrafischen zu quantifizieren. Es ermöglicht auch die Bewertung der Auswirkungen der genetischen und pharmakologischen Manipulation auf das Leberwachstum und die Entwicklung. Diese Technik bietet eine schnelle und präzise Möglichkeit, die Leber sowie den Darm und die Bauchspeicheldrüse zu visualisieren und zu messen.

Neben der Quantifizierung der Lebergröße, Diese Seziermethode kann hilfreich für die Vorbereitung der Leber, Darm, und Bauchspeicheldrüse für In-situ-Hybridisierung oder konfokale Bildgebung. Bevor Sie versuchen, an experimentellen Larven zu laborieren, stellen Sie sicher, dass Sie viel Zeit damit verbracht haben, an nicht-experimentellen Proben zu üben und eine signifikante Erfolgsrate zu haben. Es ist wichtig, die richtige Orientierung und Bewegung von Zebrafischlarven und Zangen zu visualisieren, um die Haut zu entfernen, ohne die umgebenden Organe zu stören.

Nach drei bis sieben Tagen nach der Befruchtung, nach der Einschläferung von Larven, verwenden Sie eine Glaspipette und eine Pipettenpumpe, um bis zu 15 Larven in einem Zwei-Milliliter-Rohr zu sammeln. Larven zweimal mit einem Milliliter kalter 1X PBS auf Eis waschen. Entfernen Sie so viel PBS wie möglich mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe und fügen Sie einen Milliliter kalte vier Prozent PFA in PBS hinzu.

Bei vier Grad Celsius mindestens über Nacht mit sanftem Schaukeln inkubieren. Mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe den PFA aus dem Rohr nehmen und dreimal mit einem Milliliter kalter PBS abspülen. Rock für fünf Minuten zwischen spülen.

Mehrere Larven in PBS in einen Brunnen aus neun gut rund-Boden-Glasschale pfeifen. Entfernen Sie unter dem Mikroskop die Haut, die die Leber umgibt, mit feinen Zangen, um eine Larve auf dem Rücken zu halten, und greifen Sie auf beiden Seiten des Kopfes so sanft wie möglich. Dann verwenden Sie sehr feine Zange in der anderen Hand, um die Haut nur über dem Herzen zu greifen.

Ziehen Sie die Haut diagonal zum Schwanz des Fisches in den Boden der Schale auf der linken oder rechten Seite des Fisches. Wiederholen Sie dies für die andere Seite. Greifen Sie weiter Klappen der Haut und ziehen Sie nach unten, bis die gesamte Haut und Melanophoren über oder in der Nähe der Leber entfernt wurden.

Wenn Eigelb fünf bis sechs Tage lang nach der Befruchtung samt Larven vorhanden ist, heben Sie das Eigelb in einem Stück ab, indem Sie den Fisch mit feiner Zange auf dem Rücken halten und die sehr feinen Zangen verwenden, um das Eigelb sanft zu proden. Für drei bis vier DPF-Larven halten Sie den Fisch mit feiner Zange auf dem Rücken und verwenden Sie die sehr feinen Zangen, um das Eigelb von der ventralen Seite zu streicheln. Das Eigelb in Stücke zerkleinern.

Legen Sie die sezierten Larven in frische, kalte PBS in einem Zwei-Milliliter-Rohr mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe. Um die Larven zu montieren, gießen Sie ein paar Milliliter drei Prozent Methylcellulose auf den Deckel der sauberen, Kunststoff Petrischale. Verwenden Sie eine Glaspipette und Pipettenpumpe, um Larven in die Methylcellulose einzutragen und so wenig PBS wie möglich mit den Larven hinzuzufügen.

Unter einem Sezieren Mikroskop bei geringer Vergrößerung, verwenden Sie feine Zange, um die Fische zu orientieren, so dass sie auf ihrer rechten Seite nach links legen. Bestätigen Sie, dass der zu fotografierende Fisch perfekt mit einem Auge direkt auf dem anderen Auge ausgerichtet ist. Wenn der Schwanz des Fisches gebogen ist, entfernen Sie den Schwanz, indem Sie ihn mit Kräftigen zangen, um ihn so zu entfernen, dass der Fisch flach liegt.

Zoomen Sie auf eine hohe Vergrößerung und konzentrieren Sie sich auf die Leber, um sicherzustellen, dass die Kontur der Leber deutlich sichtbar ist. Drücken Sie die Schaltfläche Bild aufnehmen, um ein Bild zu fangen und die Datei zu speichern. Wiederholen Sie dies für alle Fische, um sicherzustellen, dass die Vergrößerung für jedes Bild gleich ist.

Nehmen Sie ein Bild von einem Mikrometer mit der gleichen Vergrößerung. Um das Programm R zu verwenden, um alle Leberbilder zu blenden, um potenzielle Voreingenommenheit des Ermittlers zu vermeiden und wissenschaftliche Strenge zu fördern, benennen Sie Dateien nach dem Zufallsprinzip um und erstellen Sie eine Randomisierungsdatei, die eine Liste der ursprünglichen Dateinamen und der entsprechenden geblendeten Dateinamen enthält. Öffnen Sie randomisierte Dateien in der Reihenfolge, beginnend mit Datei eins.

Wählen Sie das Freehand-Auswahl-Tool und skizzieren Sie jede Leber. Drücken Sie Control-M, um den Bereich jeder Leber zu messen. Für alle Lebern, die nicht genau gemessen werden können, weil sie Resthaut, Eigelb, a-fokussieren oder nicht intakt sind, fügen Sie eine Platzhaltermessung ein.

Speichern Sie die Messungen in einer Textdatei. Um die Blindheit zu entblinden und zu analysieren, öffnen Sie die Messdatei und die Randomisierungsdatei in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Fügen Sie eine neue Spalte in die Messdatei ein, und fügen Sie die ursprünglichen Dateinamen für die geblendeten Dateien mithilfe der Randomisierungsdatei hinzu.

Speichern Sie diese Datei als Datei "Nicht blinde Messungen". Sortieren Sie die Daten nach dem ursprünglichen Dateinamen. Schließen Sie alle Lebermessungen aus, für die die Bilder nicht ausreichten.

Konvertieren Sie bei Bedarf Messwerte in die gewünschte Skala in Quadratmillimetern. Öffnen Sie die Skalenleiste in der Bildverarbeitungssoftware. Verwenden Sie das Werkzeug Gerade Linie, um einen Millimeter auf der Maßstabsleiste zu messen.

Die Bildverarbeitungssoftware misst dann in den gleichen Einheiten wie die Lebern, was einen Umrechnungsfaktor ergibt. Verwenden Sie den Konvertierungsfaktor, um Messungen in der Datei "Nicht blinde Messungen" zu konvertieren. Bestimmen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung und berechnen Sie P-Werte.

Nach sechs Tagen nach der Befruchtung zeigten nicht-transgene Zebrafischlarven eine natürliche Position und Form der Leber, die über dem Darm lag. Transgene Zebrafische haben die Lebergröße im Vergleich zu ihren nicht-transgenen Geschwistern deutlich erhöht. Einige Beispiele für unzureichende Bilder und Mikrometer sind hier gezeigt.

Larve mit Haut bedeckt die Leber, Larve mit Dotter verdunkelt die Leber, Larve mit Teilen der Leber abgeklemmt, und Larve mit Leber disloziert und fallen abfallen, Larve mit fehlender Leber, Larve mit Leberumriss, die schwer zu identifizieren ist, und Larve mit unsachgemäßer Positionierung. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, kleine und kontrollierte Bewegungen zu verwenden, um Schäden an der Leber zu verhindern. Neben der Hellfeldmikroskopie können wir auf diese Weise sezierte Larven auch für die konfokale Mikroskopie, zur Visualisierung fluoreszierender Reporterproteine oder immunfluoreszierender Färbungen und für die In-situ-Hybridisierung verwenden.

Das Formaldehyd oder PFA ist reizend und vermutet krebserregend. Handschuhe sollten beim Umgang mit PFA getragen werden und konzentrierte Lösungen sollten in einer chemischen Rauchhaube behandelt werden.