Quantifizierung der Lebergröße in Larval Zebrafischen mit Brightfield-Mikroskopie
2. Februar 2020
Hier zeigen wir eine Methode zur Quantifizierung der Lebergröße in Larvenzebrafischen, die eine Möglichkeit bietet, die Auswirkungen genetischer und pharmakologischer Manipulationen auf das Leberwachstum und die Leberentwicklung zu bewerten.
Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die Lebergröße in Larvenzebrafischen zu quantifizieren. Es ermöglicht auch die Bewertung der Auswirkungen der genetischen und pharmakologischen Manipulation auf das Leberwachstum und die Entwicklung. Diese Technik bietet eine schnelle und präzise Möglichkeit, die Leber sowie den Darm und die Bauchspeicheldrüse zu visualisieren und zu messen.
Neben der Quantifizierung der Lebergröße, Diese Seziermethode kann hilfreich für die Vorbereitung der Leber, Darm, und Bauchspeicheldrüse für In-situ-Hybridisierung oder konfokale Bildgebung. Bevor Sie versuchen, an experimentellen Larven zu laborieren, stellen Sie sicher, dass Sie viel Zeit damit verbracht haben, an nicht-experimentellen Proben zu üben und eine signifikante Erfolgsrate zu haben. Es ist wichtig, die richtige Orientierung und Bewegung von Zebrafischlarven und Zangen zu visualisieren, um die Haut zu entfernen, ohne die umgebenden Organe zu stören.
Nach drei bis sieben Tagen nach der Befruchtung, nach der Einschläferung von Larven, verwenden Sie eine Glaspipette und eine Pipettenpumpe, um bis zu 15 Larven in einem Zwei-Milliliter-Rohr zu sammeln. Larven zweimal mit einem Milliliter kalter 1X PBS auf Eis waschen. Entfernen Sie so viel PBS wie möglich mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe und fügen Sie einen Milliliter kalte vier Prozent PFA in PBS hinzu.
Bei vier Grad Celsius mindestens über Nacht mit sanftem Schaukeln inkubieren. Mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe den PFA aus dem Rohr nehmen und dreimal mit einem Milliliter kalter PBS abspülen. Rock für fünf Minuten zwischen spülen.
Mehrere Larven in PBS in einen Brunnen aus neun gut rund-Boden-Glasschale pfeifen. Entfernen Sie unter dem Mikroskop die Haut, die die Leber umgibt, mit feinen Zangen, um eine Larve auf dem Rücken zu halten, und greifen Sie auf beiden Seiten des Kopfes so sanft wie möglich. Dann verwenden Sie sehr feine Zange in der anderen Hand, um die Haut nur über dem Herzen zu greifen.
Ziehen Sie die Haut diagonal zum Schwanz des Fisches in den Boden der Schale auf der linken oder rechten Seite des Fisches. Wiederholen Sie dies für die andere Seite. Greifen Sie weiter Klappen der Haut und ziehen Sie nach unten, bis die gesamte Haut und Melanophoren über oder in der Nähe der Leber entfernt wurden.
Wenn Eigelb fünf bis sechs Tage lang nach der Befruchtung samt Larven vorhanden ist, heben Sie das Eigelb in einem Stück ab, indem Sie den Fisch mit feiner Zange auf dem Rücken halten und die sehr feinen Zangen verwenden, um das Eigelb sanft zu proden. Für drei bis vier DPF-Larven halten Sie den Fisch mit feiner Zange auf dem Rücken und verwenden Sie die sehr feinen Zangen, um das Eigelb von der ventralen Seite zu streicheln. Das Eigelb in Stücke zerkleinern.
Legen Sie die sezierten Larven in frische, kalte PBS in einem Zwei-Milliliter-Rohr mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe. Um die Larven zu montieren, gießen Sie ein paar Milliliter drei Prozent Methylcellulose auf den Deckel der sauberen, Kunststoff Petrischale. Verwenden Sie eine Glaspipette und Pipettenpumpe, um Larven in die Methylcellulose einzutragen und so wenig PBS wie möglich mit den Larven hinzuzufügen.
Unter einem Sezieren Mikroskop bei geringer Vergrößerung, verwenden Sie feine Zange, um die Fische zu orientieren, so dass sie auf ihrer rechten Seite nach links legen. Bestätigen Sie, dass der zu fotografierende Fisch perfekt mit einem Auge direkt auf dem anderen Auge ausgerichtet ist. Wenn der Schwanz des Fisches gebogen ist, entfernen Sie den Schwanz, indem Sie ihn mit Kräftigen zangen, um ihn so zu entfernen, dass der Fisch flach liegt.
Zoomen Sie auf eine hohe Vergrößerung und konzentrieren Sie sich auf die Leber, um sicherzustellen, dass die Kontur der Leber deutlich sichtbar ist. Drücken Sie die Schaltfläche Bild aufnehmen, um ein Bild zu fangen und die Datei zu speichern. Wiederholen Sie dies für alle Fische, um sicherzustellen, dass die Vergrößerung für jedes Bild gleich ist.
Nehmen Sie ein Bild von einem Mikrometer mit der gleichen Vergrößerung. Um das Programm R zu verwenden, um alle Leberbilder zu blenden, um potenzielle Voreingenommenheit des Ermittlers zu vermeiden und wissenschaftliche Strenge zu fördern, benennen Sie Dateien nach dem Zufallsprinzip um und erstellen Sie eine Randomisierungsdatei, die eine Liste der ursprünglichen Dateinamen und der entsprechenden geblendeten Dateinamen enthält. Öffnen Sie randomisierte Dateien in der Reihenfolge, beginnend mit Datei eins.
Wählen Sie das Freehand-Auswahl-Tool und skizzieren Sie jede Leber. Drücken Sie Control-M, um den Bereich jeder Leber zu messen. Für alle Lebern, die nicht genau gemessen werden können, weil sie Resthaut, Eigelb, a-fokussieren oder nicht intakt sind, fügen Sie eine Platzhaltermessung ein.
Speichern Sie die Messungen in einer Textdatei. Um die Blindheit zu entblinden und zu analysieren, öffnen Sie die Messdatei und die Randomisierungsdatei in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Fügen Sie eine neue Spalte in die Messdatei ein, und fügen Sie die ursprünglichen Dateinamen für die geblendeten Dateien mithilfe der Randomisierungsdatei hinzu.
Speichern Sie diese Datei als Datei "Nicht blinde Messungen". Sortieren Sie die Daten nach dem ursprünglichen Dateinamen. Schließen Sie alle Lebermessungen aus, für die die Bilder nicht ausreichten.
Konvertieren Sie bei Bedarf Messwerte in die gewünschte Skala in Quadratmillimetern. Öffnen Sie die Skalenleiste in der Bildverarbeitungssoftware. Verwenden Sie das Werkzeug Gerade Linie, um einen Millimeter auf der Maßstabsleiste zu messen.
Die Bildverarbeitungssoftware misst dann in den gleichen Einheiten wie die Lebern, was einen Umrechnungsfaktor ergibt. Verwenden Sie den Konvertierungsfaktor, um Messungen in der Datei "Nicht blinde Messungen" zu konvertieren. Bestimmen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung und berechnen Sie P-Werte.
Nach sechs Tagen nach der Befruchtung zeigten nicht-transgene Zebrafischlarven eine natürliche Position und Form der Leber, die über dem Darm lag. Transgene Zebrafische haben die Lebergröße im Vergleich zu ihren nicht-transgenen Geschwistern deutlich erhöht. Einige Beispiele für unzureichende Bilder und Mikrometer sind hier gezeigt.
Larve mit Haut bedeckt die Leber, Larve mit Dotter verdunkelt die Leber, Larve mit Teilen der Leber abgeklemmt, und Larve mit Leber disloziert und fallen abfallen, Larve mit fehlender Leber, Larve mit Leberumriss, die schwer zu identifizieren ist, und Larve mit unsachgemäßer Positionierung. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, kleine und kontrollierte Bewegungen zu verwenden, um Schäden an der Leber zu verhindern. Neben der Hellfeldmikroskopie können wir auf diese Weise sezierte Larven auch für die konfokale Mikroskopie, zur Visualisierung fluoreszierender Reporterproteine oder immunfluoreszierender Färbungen und für die In-situ-Hybridisierung verwenden.
Das Formaldehyd oder PFA ist reizend und vermutet krebserregend. Handschuhe sollten beim Umgang mit PFA getragen werden und konzentrierte Lösungen sollten in einer chemischen Rauchhaube behandelt werden.
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Übersicht
Diese Methode ermöglicht es, die Lebergröße bei larvalen Zebrafischen zu quantifizieren, wodurch die Beurteilung genetischer und pharmakologischer Einflüsse auf das Leberwachstum und die Leberentwicklung ermöglicht wird. Außerdem wird die Visualisierung und Vermessung von Leber, Darm und Bauchspeicheldrüse erleichtert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Die Quantifizierung der Lebergröße ist entscheidend für das Verständnis der Organentwicklung.
- Larven von Zebrafischen dienen als Modellorganismus für Entwicklungsstudien.
- Genetische und pharmakologische Eingriffe können das Organwachstum beeinflussen.
- Eine korrekte Technik ist entscheidend für eine erfolgreiche Dissektion und Visualisierung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Quantifizierung der Lebergröße bei larvalen Zebrafischen.
- Beurteilung des Einflusses genetischer und pharmakologischer Interventionen auf die Leberentwicklung.
- Vorbereitung der Organe für weitere Analysetechniken wie die In-situ-Hybridisierung.
Verwendete Methoden
- Präparation von Zebrafischlarven, um Leber, Darm und Bauchspeicheldrüse freizulegen.
- Visualisierungstechniken zur Messung der Organgröße.
- Übung an nicht-experimentellen Proben, um die Beherrschung der Technik sicherzustellen.
- Orientierung und Bewegungssteuerung während der Präparation, um Organschäden zu vermeiden.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine schnelle und präzise Messung der Lebergröße.
- Erleichtert die Untersuchung der Organentwicklung als Reaktion auf experimentelle Manipulationen.
- Bietet eine Grundlage für weitere bildgebende Studien.
- Verdeutlicht die Bedeutung der Technik für die experimentellen Ergebnisse.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode ist wirksam zur Quantifizierung der Lebergröße bei larvalen Zebrafischen.
- Sie ermöglicht die Beurteilung genetischer und pharmakologischer Wirkungen auf das Organwachstum.
- Eine korrekte Dissektionstechnik ist entscheidend für erfolgreiche experimentelle Ergebnisse.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Quantifizierung der Lebergröße von Larven in Zebrafisch-Modellen ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Wirkstoffeffekte auf onkogenbedingte Phänotypen und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in der frühen Forschung zu hepatozellulärem Karzinom. Diese Methode liefert Vorhersagesicherheit, indem genetische oder pharmakologische Interventionen mit messbaren Veränderungen des Organwachstums verknüpft werden, was Entscheidungen zur Selektion von Wirkstoffkandidaten unterstützt. Der Ansatz trägt zur mechanistischen Entlastung von Risiken bei, indem er einen quantitativen, reproduzierbaren Endpunkt für die Modulation von Signalwegen in präklinischen Krankheitsmodellen bietet.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Messung von Leberflächenveränderungen als Reaktion auf die Modulation von Onkogenen.
- Operationaler Wert: Bietet eine schnelle und präzise Quantifizierungsmethode, die für den Hochdurchsatzscreening genetischer oder pharmakologischer Interventionen geeignet ist.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch objektive, messbare Phänotypen, die mit krankheitsbedingter Hepatomegalie korrelieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Das Präparationsprotokoll bereitet Leber, Darm und Pankreas für nachgeschaltete Anwendungen wie Immunfluoreszenz und In-situ-Hybridisierung vor.
- Reproduzierbarkeit: Standardisierte Fixierungs-, Präparations- und Abbildungsschritte gewährleisten konsistente Messungen der Leberfläche in experimentellen Gruppen.
- Skalierbarkeit: Die Methode ermöglicht die Bearbeitung von bis zu 15 Larven pro Röhrchen und unterstützt die Analyse in Chargen zur Wirkstoffbewertung.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Anwendbar auf transgene Zebrafisch-Modelle des hepatozellulären Karzinoms, bei denen Hepatomegalie ein frühes larvales Phänotyp ist.
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Validierung, indem quantifizierbare Daten zur Organgröße bereitgestellt werden.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Lebergrößenmessungen unterstützen Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf dosis- oder genotypabhängigen Wachstumseffekten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Bewertung ein und schafft eine quantitative Verbindung zwischen genetischer Modulation und phänotypischem Ergebnis.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die Expression von Onkogenen mit messbaren Veränderungen der Leberfläche in larven Zebrafischen verknüpft wird.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse (Leberfläche in mm²), die einen zuverlässigen Vergleich zwischen verschiedenen Behandlungsbedingungen ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt messbare Daten (Mittelwert, Standardabweichung, P-Werte), die für statistische Analysen und die Bestätigung von Hits geeignet sind.
- Translationale Forschung: Verbindet frühe phänotypische Screenings mit präklinischer Kontinuität durch krankheitsrelevante Messungen der Leberhypertrophie.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Der Workflow zur Dissektion und Bildgebung ist auf verschiedene Organsysteme (Leber, Darm, Pankreas) übertragbar und kompatibel mit multiplexierten nachgeschalteten Assays.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem ein direkter, quantifizierbarer Endpunkt des Leberwachstums als Reaktion auf die Modulation von Signalwegen bereitgestellt wird.
- Operationaler Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch verblindete Bildanalyse und Kalibrierung mit Maßstabsbalken sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühe phänotypische Bewertung ermöglicht wird, wodurch Investitionen in ineffektive Zielstrukturen reduziert werden.
- Portfolio-Implikation: Erleichtert eine risikoadjustierte Priorisierung, indem Verbindungen oder Genotypen identifiziert werden, die die Lebergröße im Vergleich zu Kontrollen signifikant verändern.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Zebrafischen, in der Dissektion und in der Hellfeldmikroskopie, um Gewebeschäden zu vermeiden.
- Benötigt Instrumente wie Stereomikroskope, Glaspipetten, Pinzetten und Bildverarbeitungssoftware (z. B. R, ImageJ).
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Dissektionstechnik, der Verblindung von Dateien und den Messprotokollen voraus, um Untersuchungsverzerrungen zu minimieren.
- Zu berücksichtigende Anpassungen sind die Anpassung des Zeitpunkts der Dissektion entsprechend dem Larvenalter (3–7 dpf) und dem Vorhandensein des Dotters.
- Praktische Einschränkung: Die Messung der Leberfläche kann Volumenänderungen unterschätzen; ergänzende Methoden sind erforderlich, um Hypertrophie von Hyperplasie zu unterscheiden.
