Strategisches Screening und Charakterisierung des Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex für eine erfolgreiche Kristallisation
16. März 2020
Dieser Bericht beschreibt das Screening verschiedener Reinigungsmittel zur Herstellung des visuellen GPCR, Rhodopsins und seines Komplexes mit Mini-Go. Gezeigt werden biochemische Methoden, die die Qualität des Komplexes in verschiedenen Stadien während der Reinigung charakterisieren. Dieses Protokoll kann für ihre zukünftigen Strukturstudien auf andere Membranproteinkomplexe verallgemeinert werden.
Die Signaltransduktion ist eines der wichtigsten Themen der biologischen und pharmazeutischen Forschung. Es erfordert Membranproteine, um Signale an ihr intrazelluläres Signalpartnerprotein zu übertragen. Dieses Protokoll ist für die Durchführung eines systematischen Waschmittelscreenings zur Vorbereitung eines Signalisierungskomplexes mit dem Ziel der Strukturbestimmung konzipiert.
Dieses Protokoll verwendet allgemein verfügbare Techniken in einem etablierten Biologielabor und wird leicht von den Anfängern auf dem Gebiet durchgeführt. Wir haben diese Methoden zusammengeführt, um den kritischsten Parameter bei der Herstellung des Membranproteinkomplexes zu finden. Zunächst 30 Gramm HEK293 GNT I-mangelhaftes Zellpellet auf Raumtemperatur auftauen und auf ein Becherglas übertragen.
Fügen Sie 120 Milliliter PBS-Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail und homogen mit einem Dounce Homogenisator oder einem elektrischen Homogenisator bei 13.000 RPM für 30 Sekunden hinzu. Stellen Sie das Volumen mit pbS-Puffer auf 150 Milliliter ein. Fügen Sie den homogenisierten Zellen vorsichtig 10% DDM hinzu, um eine Letzte Konzentration von 1,25%Stir auf Eis für eine Stunde zu geben.
Nach der Löslichkeit zentrifugieren Sie die Zelle bei vier Grad Celsius und 150.000 Mal G für 45 Minuten, um die unlöslichen Trümmer zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in eine 500-Milliliter-Flasche und fügen Sie 10 Milliliter des 50%1D4 Immun-Affinitätagaroseharzes hinzu. Mischen Sie das lösliche Zelllysat und Harz vier Stunden oder über Nacht bei vier Grad Celsius, um eine Proteinbindung zu ermöglichen.
Das Lysatharzgemisch in eine offene Säule laden, um das Harz zu sammeln. Waschen Sie das Harz mit 10 Säulenvolumina des Waschpuffers A, um den Proteinschadstoff zu entfernen. Schließen Sie das Ventil und setzen Sie das Harz mit zwei Säulenvolumen puffer A.Next, unter dim Rotlicht zustand, fügen Sie 9-cis Retinal zu dem resuspendierten Harz zu einer endgültigen Konzentration von 50 Mikromolar.
Bei vier Grad Celsius für vier bis 16 Stunden im Dunkeln für Die Netzhautbindung sanft mischen. Öffnen Sie anschließend den Wert, und entfernen Sie den Puffer aus der Spalte. Waschharz mit 20 Spaltenvolumina des Puffers A, gefolgt von 15 Spaltenvolumina des Puffers B, um ungebundene Netzhaut zu entfernen.
Setzen Sie das Harz in zwei Säulenvolumen von Puffer B aus und teilen Sie die Harzsuspension gleichmäßig auf 10 10 Milliliter-Entsorgungssäulen auf. Entfernen Sie den Puffer aus den 10 Spalten, und setzen Sie das Harz dann jeweils in einem Milliliter Puffer C für den Waschmittelwechsel wieder auf. Eine Stunde auf Eis bebrüten.
Wiederholen Sie die Wäsche und die Inkubation in Puffer C noch einmal. Entfernen Sie den Puffer aus den Spalten, und setzen Sie das Harz dann in 0,8 Milliliter Elutionspuffer für jede Spalte wieder auf. Zwei Stunden lang sanft mischen.
Sammeln Sie die Elution aus jeder Spalte in ein Rohr. Setzen Sie das Harz in 0,7 MilliliterElutionspuffer für jede Spalte wieder auf. Sanft für eine Stunde mischen.
Sammeln Sie die Elution aus jeder Spalte in die gleichen Rohre. Laden Sie das ausgedunstete Protein im Dunkeln in die Quarzküvette. Messen Sie das Spektrum der Proteinprobe.
Beleuchten Sie das Protein zwei Minuten lang direkt in der Küvette mit einem Lichtdurchgang von 495 Nanometer lang. Messen Sie das Spektrum der beleuchteten Probe. Führen Sie die gleiche Messung für alle Proteinproben durch, die in den anderen neun Reinigungsmitteln gereinigt werden.
Sowohl dunkle als auch beleuchtete Zustände. Bei normalem Licht bereiten Sie für jeden Waschmittelzustand 100 Mikroliter Rhodopsin zu 0,7 Milligramm pro Milliliter vor. Unter dim rotem Licht, bereiten 100 Mikroliter Mischung aus Rhodopsin bei 0,7 Milligramm pro Milliliter und Mini-GO bei 0,2 Milligramm pro Milliliter.
Ergänzen Sie die Mischung mit einem Millimolaren Magnesiumchlorid. Beleuchten Sie die Mischung mit Licht aus einem 495 Nanometer langen Passfilter und inkubieren Sie 30 Minuten lang. Übertragen Sie die Proben auf die Auto-Sampler-Fläschchen und legen Sie sie in das Probenfach.
Programmieren Sie eine Methodendatei, um sequenzielle SEC-Läufe für jede Probe zu automatisieren, wobei der Auto-Sampler 77 Mikroliter der Probe in die Spalte lädt und der Reiniger 25 Milliliter SEC-Puffer pro Ausführung entgeht. Erfassen Sie die Absorption mit 280 Nanometern und 380 Nanometern. Sammeln Sie die Spitzenfraktionen von Rhodopsin und Rhodopsin-Mini-GO-Komplex bei der Retentionsmenge um 12,9 Milliliter.
Analysieren Sie die linken Rhodopsin-Proben und die Spitzenfraktionen des Rhodopsin-Mini-GO-Komplexes auf vier bis 12% SDS-Denaturierunggradientengelen mit Coomassie-Blaufärbung. Bereiten Sie eine 200 Mikroliter Mischung aus Rhodopsin bei einem Milligramm pro Milliliter und PNGase F bei 0,01 Milligramm pro Milliliter vor. Gut mischen und über Nacht auf Eis bebrüten.
Bereiten Sie eine 200 Mikroliter Mischung aus Rhodopsin bei einem Milligramm pro Milliliter und Endo F1-13 bei 0,01 Milligramm pro Milliliter vor. Gut mischen und über Nacht auf Eis bebrüten. Analysieren Sie das Verdauungsergebnis durch SDS-Page und Coomassie blue staining.
In dieser Studie lieferte der kleinräumige Reinigungsaufbau genügend Protein für weitere Analysen. Ultraviolett sichtbare Spektren von Rhodopsin zeigen den dunklen Zustand 9-cis Retinal gebundenrhodopsin in blauen Kurven. Nach der Beleuchtung wird 9-cis Retinal deproteiniert und isomerisiert in alle trans-Retinal.
Die Verhältnisse von Absorbern bei 280 Nanometern über Absorbern von 488 Nanometern und Absorbern bei 280 Nanometern über Absorbern bei 380 Nanometern zeigen die Stabilität von Rhodopsin, das in jedem Waschmittel gereinigt wird. Hier werden Größenausschlusschromatographieprofile von Rhodopsin- und Rhodopsin-Mini-GO-Komplex gezeigt, der in 10 verschiedenen Waschmitteln gereinigt wird. Das Profil der Standard-Markerproteine wird zusammen mit der DDM-Probe als Overlay dargestellt.
Die Interpretation der Spitzenprofile wird für DMNG mit dem idealen Szenario für DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 und OGNG dargestellt. Das vergrößerte Profil der OGNG-Probe zeigt sowohl Rhodopsin- als auch Rhodopsin-Mini-GO-Komplex, der um das gleiche Retentionsvolumen entwichen ist. Hier wird die SDS-Seitenanalyse von Rhodopsin- und SEC-gereinigten Proben des Rhodopsin-Mini-GO-Komplexes gezeigt.
Diese Abbildung zeigt die SDS-Seitenanalyse der Rhodopsin-Deglycosylierung mit Endo F1 und PNGase F Enzymen. Es ist wichtig, das Waschmittelscreening systematisch durchzuführen, damit die Wirkung jedes einzelnen Waschmittels ohne Mehrdeutigkeit klar verglichen werden kann. Für Proteine unterschiedlicher Menge kann auch der thermische Schichttest verwendet werden, um die Auswirkungen von Reinigungsmitteln auf die Proteinstabilität zu untersuchen.
Dank dieser Methode sind wir in der Lage, einen stabilen Proteinkomplex vorzubereiten und schließlich die in der Geomontage verlorene Kristallstruktur zu lösen. Es lieferte wichtige Einblicke in die GpCR-G-Proteininteraktionsspezifität.
Übersicht
Dieser Bericht beschreibt ein systematisches Reinigungsmittel-Screening-Protokoll zur Vorbereitung des visuellen GPCR, Rhodopsin, und seines Komplexes mit mini-G o. Die eingesetzten biochemischen Methoden charakterisieren die Qualität des Komplexes in verschiedenen Reinigungsstufen und bieten einen Rahmen, der auf andere Membranproteinkomplexe anwendbar ist.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biochemie
- Strukturbiologie
- Membranproteinforschung
Hintergrund
- Signaltransduktion ist entscheidend für die zelluläre Kommunikation.
- Membranproteine sind wesentlich für die Signalübertragung an intrazelluläre Partner.
- Reinigungsmittel-Screening ist wichtig für die Optimierung der Vorbereitung von Membranproteinkomplexen.
- Diese Studie konzentriert sich auf Rhodopsin, ein wichtiger visueller GPCR.
Zweck der Studie
- Ein Protokoll für systematisches Reinigungsmittel-Screening zu etablieren.
- Rhodopsin und seinen Komplex mit mini-G o für Strukturstudien vorzubereiten.
- Kritische Parameter zu identifizieren, die die Vorbereitung von Membranproteinkomplexen beeinflussen.
Verwendete Methoden
- Auftauen und Homogenisieren von HEK293-Zellpellets.
- Hinzufügen von Reinigungsmitteln und Durchführung der Zentrifugation zur Solubilisierung von Proteinen.
- Verwendung von Immunaffinitätschromatographie zur Proteinreinigung.
- Messung von Proteinspektren und Analyse von Proben mittels SDS-PAGE.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Reinigung von Rhodopsin und Rhodopsin-mini-G o-Komplex.
- Reinigungsmittel-Screening ergab optimale Bedingungen für die Proteinstabilität.
- UV-sichtbare Spektren demonstrierten die Bindung und Isomerisierung von Retinal.
- SDS-PAGE-Analyse bestätigte die Integrität der gereinigten Proteine.
Schlussfolgerungen
- Systematisches Reinigungsmittel-Screening ist wesentlich für Membranproteinstudien.
- Optimale Reinigungsmittelbedingungen beeinflussen die Proteinstabilität und -qualität erheblich.
- Dieses Protokoll kann für andere Membranproteinkomplexe angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Systematic detergent screening and complex characterization are critical for enabling high-resolution structural studies of GPCR signaling complexes, directly supporting target validation in early drug discovery. This approach reduces mechanistic ambiguity by defining stable, monodisperse protein samples, thereby increasing predictive confidence in downstream screening and lead identification efforts. The methodology provides a reusable framework for de-risking membrane protein targets across therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of GPCR-G protein interaction specificity through stabilized complex formation.
- Operational Value: Provides quantitative UV-Vis and SEC metrics to assess complex stability and monodispersity.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing by correlating detergent conditions with functional complex integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, monodisperse complex preparations suitable for biophysical and biochemical assays.
- Operational Value: Automated SEC and SDS-PAGE enable reproducible quality control across detergent conditions.
- Scalability: Optimized conditions from small-scale screening inform large-scale production for crystallization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Deglycosylation strategy (EndoF1) yields homogeneous N-glycosylation, reducing heterogeneity that impedes crystallogenesis.
- Mechanistic De-risking: Validates complex formation under near-physiological conditions with defined stoichiometry (1:1 rhodopsin:mini-Go).
- Preclinical Relevance: Stabilized active-state complex supports structure-guided design of biased ligands or allosteric modulators.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by delivering structurally characterized, functional GPCR complexes.
- Discovery Biology: UV-Vis spectroscopy tracks ligand binding and isomerization, providing functional readouts for receptor activation state.
- Screening: SEC profiles enable comparison of complex stability and monodispersity across detergent screens.
- Analytics: SDS-PAGE confirms 1:1 stoichiometry and assesses purity, supporting go/no-go decisions in complex preparation.
- Translational Research: Homogeneous glycosylation via EndoF1 treatment enhances structural readiness for preclinical target engagement studies.
- Enterprise Reuse: The detergent screening and characterization pipeline is adaptable to other GPCRs and membrane protein complexes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through stabilized, active-state complex preparation.
- Operational Value: Standardized workflow with automated SEC and quantitative spectroscopy ensures reproducibility.
- Strategic Value: Informs lead identification by providing structural insights into GPCR-effector specificity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on complex tractability and structural feasibility.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein biochemistry, fluorescence spectroscopy, and chromatographic techniques.
- Dependent on access to ultracentrifuges, HPLC systems with auto-samplers, and quartz cuvettes for UV-Vis measurements.
- Necessitates cross-team standardization for detergent screening, complex formation, and deglycosylation protocols.
- Adaptation to other models requires optimization of ligand (e.g., retinal) concentration and light exposure conditions.
- Practical limitation: Heterogeneous glycosylation may require empirical screening of deglycosylation enzymes (e.g., EndoF1 vs. PNGase F) to achieve homogeneity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Cell Membrane Solubilization and Protein Extraction
3:53
UV-VIS Spectroscopy
4:33
Automated Size-Exclusion Chromatography of Rhodopsin and Rhodopsin Mini-Go Complex
6:44
Results: UV-VIS Spectroscopy, SEC, and SDS-PAGE
8:34
Conclusion
6:04
Deglycosylation
