Langstrecken-Channelrhodopsin-unterstützte Schaltungszuordnung von minderwertigen Colliculus-Neuronen mit blauen und rot verschiebten Channelrhodopsinen
7. Februar 2020
Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) ist eine Präzisionstechnik zur funktionellen Kartierung von neuronalen Langzeitprojektionen zwischen anatomisch und/oder genetisch identifizierten Gruppen von Neuronen. Hier beschreiben wir, wie man CRACM nutzt, um auditive Hirnstammverbindungen zu kartieren, einschließlich der Verwendung eines rot verschobenen Opsins, ChrimsonR.
Channelrhodopsin-unterstützte Schaltungszuordnung ist eine Präzisionstechnik für die funktionelle Kartierung von langräumigen neuronalen Projektionen. Hier zeigen wir, wie man diesen Ansatz nutzt, um Schaltkreise im auditiven Hirnstamm zu untersuchen. In Gehirnscheiben werden Axone aus mehreren Quellen oft vermischt, was es schwierig macht, einzelne Eingänge mittels elektrischer Stimulation zu isolieren.
Durch die Verwendung von CRACM kann diese Einschränkung überwunden werden. Lambda zu finden und das stereotaxic-Koordinatensystem konsequent zu definieren, ist ebenso schwierig wie die Dauer des Verfahrens kurz zu halten. Wenn alle Schritte sorgfältig abgebildet werden, erhöht sich Ihre Erfolgsquote.
Beginnen Sie mit dem Sprühen des Operationsbereichs mit 70% Ethanol, um zu desinzipieren und sterile Handtuchvorhänge zu platzieren, um den Operationsbereich abzudecken. Entfernen Sie Käfigbetten, um das Erstickungsrisiko aus dem Bergungskäfig zu begrenzen. Als nächstes legen Sie ein Heizkissen unter den Käfig und stellen Sie eine Nahrungs- und Wasserquelle zur Verfügung.
Als nächstes übertragen Sie das Tier in einen stereotaxic Rahmen und setzen Sie die Anästhesie fort. Setzen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein und schalten Sie den hausostatischen Temperaturregler ein. Wenden Sie dann die ophthalmologische Salbe an, um zu verhindern, dass die Augen austrocknen.
Präemptive analgetisch verabreichen. Schließlich rasieren Sie die Kopfhaut mit elektrischen Clippers. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei abwechselnden Tupfern Povidonjod und 70%Ethanol.
Beginnen Sie die Operation, indem Sie einen Schnitt in der Kopfhaut entlang der Mittellinie machen, beginnend zwischen den Ohren und weiter rostral zu den Augen, die Lambda und Bregma Nähte aussetzen. Schieben Sie die Haut zur Seite und entfernen Sie bei Bedarf Periost aus dem exponierten Knochen. Als nächstes markieren Sie die Lambda-Nähte mit einem chirurgischen Marker, positionieren Sie die Spitze des Nano-Injektors so, dass sie nur Lambda berührt und die Mikromanipulator-Koordinaten null.
Verwenden Sie die Nano-Injektorspitze und den Mikromanipulator, um den Höhenunterschied zwischen Lambda- und Bregma-Nähten zu messen. Passen Sie die Höhe der Palettenbalken an, um Lambda und Bregma auf einen Höhenunterschied von plus oder minus 100 Mikrometer zu bringen. Ordnen Sie die Injektionsstelle mit dem Nano-Injektor-Spitzen- und Mikromanipulator-Koordinatensystem zu und markieren Sie die Stelle mit einem chirurgischen Marker.
Verwenden Sie dann einen Mikromotorbohrer mit einem 0,5-Millimeter-Bohrgrat, um eine Kraniotomie über der Injektionsstelle durchzuführen. Um eine breite Transfektion von Neuronen im Zielkern zu gewährleisten, verwenden Sie einen Nano-Injektor, um Injektionen in verschiedenen Tiefen des Gewebes zu machen und im Falle größerer Hirnregionen, wie des unteren Colliculus, Injektionen im Laufe von zwei oder mehr Penetrationen an verschiedenen X- und Y-Koordinaten zu machen. Um den minderwertigen Colliculus zu injizieren, lagern Sie 20 Nanoliter Virus in den Intervallen von 250 Mikrometern entlang der Z-Achse zwischen 2, 250 Mikrometern und 1, 750 Mikrometer Tiefe ab.
Bei Injektionen in den dorsalen Cochlea-Kern 20 Nanoliter Virus in einer Tiefe von 4, 750 Mikrometern bzw. 4, 550 Mikrometern ablagern. Nach der Injektion an jeder Z-Koordinate warten Sie zwei bis drei Minuten, bevor Sie den Injektor auf die nächste Z-Koordinate verschieben, um Zeit für die Verbreitung des Virus von der Injektionsstelle zu lassen, wodurch die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass das Virus im Injektionstrakt angesaugt wird, wenn der Nanoinjektor neu positioniert wird. Dann, nach der letzten Injektion, warten Sie drei bis fünf Minuten, bevor Sie den Nanoinjektor aus dem Gehirn zurückziehen.
Wenn der Nano-Injektor zwischen Penetrationen und zwischen Tieren aus dem Gehirn entfernt wird, werfen Sie ein kleines Virusvolumen aus der Spitze aus, um zu überprüfen, ob die Spitze nicht verstopft ist. Nach Injektionen verwenden Sie steriles PBS, um die Schnittkanten der Kopfhaut zu befeuchten und dann die Haut sanft zurück in Richtung Mittellinie zu bewegen. Schließen Sie die Wunde mit einfachen unterbrochenen Nähten mit 6-0 Nylon Nähte.
Dann 0,5 bis einen Milliliter 2%Lidocain-Gelee auf die Wunde auftragen. Entfernen Sie die Ohrstangen und Temperatursonde, drehen Sie Isofluran, und entfernen Sie das Tier aus der Palettenleiste und übertragen Sie es in den Erholungskäfig. Überwachen Sie schließlich die Wiederherstellung genau.
Sobald das Tier vollständig wach ist, sich bewegt und keine Anzeichen von Schmerz oder Bedrängnis zeigt, überträgt es es zurück in seinen Käfig und gibt den Käfig ins Vivarium zurück. Verwenden Sie Standard-Patch-Clamp-Methoden, um Aufnahmen zu machen. Beginnen Sie, indem Sie die Scheibe in einer Aufnahmekammer unter einem festen Bühnen-Upright-Mikroskop platzieren und kontinuierlich mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit bei zwei Millilitern pro Minute überschwängen.
Als nächstes patchen Neuronen unter visueller Kontrolle mit einem geeigneten Patch Klemmverstärker. Schließlich aktivieren Sie Chronos während der Großhandelsaufnahmen, indem Sie kurze Impulse von 470 Nanometer Licht oder ChrimsonR durch kurze Impulse von 580 Nanometer Licht durch handelsübliche LEDs liefern. Die Ergebnisse zeigten, dass die ChrimsonR-Injektion zu einer starken Expression im DCN mit tdTomato-Fluoreszenz führte, die in Zellen und Fasern sichtbar ist.
Im kontralateralen ICC waren Fasern, die stark mit tdTomato gekennzeichnet waren, nach drei Wochen deutlich sichtbar, was die Fähigkeit des ChrimsonR-tdTomato-Konstrukts demonstriert, wenn es in auditive Hirnstammkerne injiziert wird. Optische Aktivierung von ChrimsonR elicted EPSPs in IC VIP Neuronen, was darauf hindeutet, dass ChrimsonR ein nützliches Werkzeug für langstreckende CRACM-Experimente ist, wenn die experimentellen Parameter die Verwendung von rotem Licht anstelle von blauem Licht erfordern. Wir stellten jedoch fest, dass ChrimsonR problemlos mit blauem Licht aktiviert wurde, was die gleiche Schwelle für die Aktivierung des Blaulichts wie Chronos anzeigte.
Für dieses Protokoll ist es am wichtigsten, sicherzustellen, dass die stereotaxic Koordinaten korrekt sind und zu bestätigen, dass das Virus nur in Ihrer Zielhirnregion exprimiert wurde. Durch den Austausch des Chronos ChrimsonR viroconstruct mit einem anderen Virus, z.B. einem zellspezifischen Flex-Virus, können Sie mehrere anatomische oder physiologische Fragen beantworten, ohne das Operationsprotokoll zu ändern.
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Übersicht
Die kanalrhodopsinunterstützte Schaltkreisabbildung (CRACM) ist eine präzise Technik zur funktionellen Kartierung langreichweitiger neuronaler Projektionen, insbesondere im auditorischen Hirnstamm. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Verbindungen und Dynamiken durch gezielte optogenetische Ansätze unter Verwendung rotverschobener Opsine wie ChrimsonR.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Neuroanatomie
- Optogenetik
Hintergrund
- Herkömmliche elektrische Stimulationsmethoden stehen aufgrund gemischter axonaler Eingänge vor Herausforderungen.
- CRACM ermöglicht die präzise Abbildung neuronaler Schaltkreise.
- Die Verwendung rotverschobener Opsine erhöht die Vielseitigkeit der optogenetischen Steuerung.
- Das Verständnis der Mechanismen auditorischer Hirnstammverbindungen ist entscheidend für die Erforschung der auditorischen Verarbeitung.
Zweck der Studie
- Aufzeigen, wie CRACM effektiv auditorische Hirnstammverbindungen kartieren kann.
- Herausstellung der Vorteile der Verwendung von ChrimsonR für die Aktivierung über größere Distanzen.
- Bereitstellung eines detaillierten chirurgischen Protokolls zur Erzielung einer präzisen Zielgenauigkeit im Gehirn.
Verwendete Methoden
- Ex vivo-Gehirnschnitte werden zur Aufzeichnung und Durchführung von Experimenten verwendet.
- Das biologische Modell beinhaltet die gezielte Ansteuerung von Neuronen in den auditorischen Hirnstammkernen.
- Der detaillierte chirurgische Protokollablauf wird für erfolgreiche CRACM-Verfahren beschrieben.
- Mikromanipulator-Koordinaten sind präzise definiert, um genaue virale Injektionen sicherzustellen.
- Elektrophysiologische Ableitungen werden mithilfe von Patch-Clamp-Techniken durchgeführt.
Hauptergebnisse
- ChrimsonR-Injektionen führten zu einer starken Expression in gezielt adressierten neuronalen Populationen.
- Die optische Aktivierung löst erregende postsynaptische Potentiale (EPSPs) in spezifischen Neuronentypen aus und bestätigt damit die Eignung von ChrimsonR.
- Die Studie bestätigt die Wirksamkeit einer präzisen Zielgerichtetheit neuronaler Schaltkreise bei gleichzeitig zuverlässigen und reproduzierbaren Ergebnissen.
- Der langstreckige Transport des Konstrukts untermauert anschließend die experimentellen Befunde.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie verdeutlicht die Fähigkeit der CRACM, komplexe neuronale Schaltkreisdynamiken im auditiven Hirnstamm aufzudecken.
- Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung sorgfältiger chirurgischer Verfahren für eine erfolgreiche optogenetische Experimentierung.
- Die gewonnenen Erkenntnisse tragen wesentlich zum Verständnis der auditorischen Verarbeitung und neuronaler Konnektivität bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die kanalrhodopsinunterstützte Schaltkreisabbildung (CRACM) löst eine zentrale Herausforderung bei der Zielvalidierung in der Neurowissenschaft: die Isolierung funktioneller Eingaben aus spezifischen neuronalen Populationen inmitten komplexer axonaler Durchmischung. Indem sie eine zelltypspezifische Abbildung langreichweitiger Projektionen ermöglicht, unterstützt CRACM die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase, insbesondere für Ziele, die eine präzise Validierung auf Schaltkreisebene erfordern. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Bewertung neuromodulatorischer Zielstrukturen oder pfadspezifischer Interventionen in präklinischen Entwicklungsstufen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem synaptische Eingänge von definierten präsynaptischen Kernen zu postsynaptischen Zielstrukturen isoliert werden.
- Operativer Wert: Bietet zelltypspezifische Genauigkeit bei der Abbildung funktioneller Konnektivität und verringert Mehrdeutigkeiten in Studien zur Zielstrukturenbindung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative elektrophysiologische Messgrößen (z. B. EPSPs), um die synaptische Stärke und Plastizität als Reaktion auf optogenetische Stimulation zu bewerten.
- Operativer Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays durch reproduzierbare virale Expression und Lichtaktivierungsparameter in Gehirnschnitten.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Kartiert aufsteigende und kommissurale Eingänge zu Neuronen des unteren Hügels und bietet ein krankheitsrelevantes System für die Forschung zur auditorischen Verarbeitung.
- Operativer Wert: Demonstriert den Langstreckentransport von ChrimsonR und unterstützt dessen Anwendung bei der Abbildung ausgedehnter Schaltkreise, wo die Durchdringung durch rotes Licht von Vorteil ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
CRACM fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis hin zu präklinischen mechanistischen Studien ein, insbesondere für Targets im Bereich der Neuromodulation und sensorischen Verarbeitung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen, indem Eingaben aus spezifischen Kerngebieten des Hirnstamms zu definierten neuronalen Populationen im unteren Hügel isoliert werden.
- Screening: Ermöglicht die quantitative Beurteilung der synaptischen Funktion über lichtinduzierte EPSPs und unterstützt so die Evaluierung von Substanzeffekten auf die Schaltkreisaktivität.
- Analytik: Liefert elektrophysiologische Messungen, die den Vergleich der synaptischen Stärke unter verschiedenen Bedingungen oder genetischen Modellen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung mit der präklinischen Kontinuität, indem auditorische Hirnstamm-Schaltkreise kartiert werden, die für Modelle der sensorischen Informationsverarbeitung relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Abbildung langreichweitiger Projektionen, die auch in anderen Gehirnregionen außerhalb des auditorischen Systems Anwendung finden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung durch direkte funktionelle Abbildung neuronaler Eingänge.
- Operationaler Wert: Reproduzierbarkeit durch standardisierte stereotaktische Koordinaten und virale Injektionsprotokolle.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem mechanistische Signalwege geklärt und Effekte in nichtzielgerichteten Schaltkreisen reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf Validierungsdaten auf Schaltkreisebene.
Durchführungsüberlegungen
- Es sind Fachkenntnisse in stereotaktischer Chirurgie und viraler Neuroanatomie erforderlich, um eine genaue Zielgenauigkeit zu gewährleisten.
- Zur Ausrüstung gehören Mikromanipulatoren, Nano-Injektoren und Patch-Clamp-Elektrophysiologiesysteme.
- Die Standardisierung zwischen verschiedenen Teams hängt von konsistenten Koordinatensystemen und Kontrollen der viralen Titer ab.
- Die Übertragung auf andere Modelle erfordert die Validierung des Opsin-Transportes und der Expression in den Zielregionen.
- Der Erfolg hängt davon ab, dass eine begrenzte virale Expression bestätigt wird, um eine Aktivierung außerhalb des Zielbereichs zu vermeiden, wie im Protokoll beschrieben.
