Name: Quantifizierung des Ethanolgehalts in Zebrafisch-Embryonen mittels Head Space Gas Chromatographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Ethanol in Zebrafisch-Embryonen mittels Headspace-Gaschromatographie quantifizieren. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Messungen der Ethanol-Pharmakokinetik während der Embryonalentwicklung.

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Die in diesem Artikel vorgestellte Forschung wurde durch frühere Stipendien der National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 an J.K.E. unterstützt. und National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. and by the current grant from National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Wir danken Rueben Gonzales für die Bereitstellung und Unterstützung bei der Analyse von Gaschromatographen. Wir danken Tiahna Ontiveros und Dr. Gina Nobles beim Schreiben.

Alle zebrafischen Embryonen, die in diesem Verfahren verwendet wurden, wurden nach den etablierten IACUC-Protokollen27aufgezogen und gezüchtet. Diese Protokolle wurden von der University of Texas at Austin und der University of Louisville genehmigt.
HINWEIS: Die Zebrafischlinie Tg (fli1:EGFP)y1 wurde in dieser Studie verwendet28. Bei allem Wasser, das in diesem Verfahren verwendet wird, ist steriles Umkehrosmosewasser. Alle statistischen Analysen wurden mit Graphpad Prism v8.2.1 durchgeführt.
1. Herstellung von Embryomedien
<ol><li>Um einen 20-fachen Vorrat an Embryomedien zu machen, lösen Sie 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g K2HPO4, 0,142 g NA2HPO4und 4,9 g MgSO4,7H2O in 1 L Wasser auf. Ignorieren Sie den weißen Niederschlag, der sich bildet; dies wirkt sich nicht auf die Medien aus. Filter sterilisieren die Lagerlösung und lagern bei 4 °C.</li>
	<li>Um die funktionierende Embryo-Medienlösung zu schaffen, lösen Sie 1,2 g NaHCO3 in 1 L 20x Embryomedienbestand auf und fügen Sie 19 L Wasser hinzu. Halten Sie die funktionierende Embryo-Medienlösung bei 28 °C.</li>
</ol>2. Messung des embryonalen Volumens durch Wasserverschiebung
HINWEIS: In diesem Protokoll werden 24 h Postfertilisation (hpf) Embryonen verwendet (Abbildung 1). Die bei den Volumenmessungen verwendeten Embryonen werden in der Ethanolanalyse nicht verwendet.
<ol><li>Platzieren Sie 10 Embryonen und extraembryonale Flüssigkeit in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das mit einem Volumen von 250 l markiert ist (Abbildung 2A). Fügen Sie der 250-L-Fülllinie Wasser hinzu (siehe Probe mit gefärbtem Wasser in Abbildung 2B).</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.1, um Behälter für Embryonen einzurichten, deren Kränzen entfernt wurden.<ol>
<li>Um die Chorion zu entfernen, legen Sie die Embryonen in ihre Krähen in eine 100 mm Petrischale mit 2 mg/ml Protease-Cocktail in Embryomedien bei Raumtemperatur (RT) für 10 min. Alle paar Minuten die Embryonen sanft wirbeln, um den Chor ion zu brechen.</li>
		<li>Sobald alle Embryonen frei von ihrem Chorion sind, entfernen Sie die dechorionierten Embryonen aus protease Cocktail/Embryo-Medien und legen Sie sie in eine neue 100 mm Petrischale mit frischen Embryomedien, um die Embryonen zu waschen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 1 weitere Zeit (für insgesamt 2 Waschungen). Übertragen Sie die Embryonen in eine frische 100 mm Petrischale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit der kleinsten Spitze möglich und ohne die Embryonen zu beschädigen, entfernen Sie sorgfältig alle Flüssigkeit aus der Umgebung der Embryonen mit einem p200 Mikropipettor (Abbildung 2C) und wiegen Sie das Wasser mit einer Skala mit &lt;0,1 mg Präzision. Um das Volumen der Probe von 10 Embryonen zu bestimmen, subtrahieren Sie das Gewicht/Volumen des Wassers (1 ml Wasser = 1 g Wasser.) entfernt von 250 l. Um das Volumen eines einzelnen Embryos zu bestimmen, teilen Sie die Differenz zwischen 250 l und dem Gewicht des entfernten Wassers durch 10.</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ01.jpg">
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ02.jpg">
3. Behandlung von Embryonen mit Ethanol
<ol><li>Sammeln Sie Embryonen aus Paarungstanks und legen Sie sie in eine Standard 100 mm Petrischale. Zählen Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro einzelne Petrischale aus und brüten Sie bei 28,5 °C. HINWEIS: Wenn die Chorion entfernt werden soll (Schritt 2.2), muss sie vor dem Hinzufügen von Ethanol entfernt werden.</li>
	<li>Bei 6 hpf, addieren Sie bis zu 100 Embryonen zu einer neuen Standard 100 mm Petrischale entweder mit Embryo-Medien oder Embryo-Medien + 1% Ethanol (v/v). Bedecken Sie, aber versiegeln Sie NICHT die Petrischale. Stellen Sie die Embryonen in einen Temperatur-Inkubator mit niedriger Temperatur einstellung bei 28,5 °C für 18 h, oder bis die Embryonen den Entwicklungszeitpunkt von 24 hpf erreichen.</li>
</ol>4. Vorbereitung des Arbeitsablaufs vor der Verarbeitung der Embryonen für die Kopfraumgaschromatographie
<ol><li>Machen Sie eine Lösung von 5 M NaCl in Wasser (450 l wird pro Probenröhrchen benötigt), um alle Proteine zu denaturieren und den Ethanolstoffwechsel zu verhindern. Herstellung des Protease-Cocktails (Table of Materials) in einer Konzentration von 2 mg/ml in Embryomedien.</li>
	<li>Etikettieren Sie ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und eine 2 ml Gaschromatographendurchstechs für jede Probe. Etikettieren Sie zusätzliche 2 ml Gaschromatographen-Fläschchen für die unten beschriebenen Ethanol-Standards sowie Luft, Wasser und die 5 M NaCl/Protease-Cocktailrohlinge.</li>
	<li>Richten Sie drei p200 Mikropipettors zwei auf 50 l und der dritte auf 200 l; ein p1000-Mikropipettor auf 450 l und ein p2-Mikropipettor auf 2 L. Für die Glaspipetten, die verwendet werden, um Embryonen von den Petrischalen auf die 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre zu übertragen, passieren Sie schnell die Pipettenspitze durch eine Flamme, um die Ränder zu glätten, um die Embryonen nicht zu beschädigen, wenn sie in die Pipette gezogen werden.</li>
</ol>5. Verarbeitung von Embryonen für die Kopfraumgaschromatographie
HINWEIS: Sowohl Embryonen in ihren Krämungen als auch solche, die zuvor aus ihren Kränzen entfernt wurden, werden für die Konsistenz bei der Berechnung von Verdünnungsfaktoren gleich behandelt.
<ol><li>Mit den beiden auf 50 l eingestellten mikropipetten p200 ziehen Sie 50 l der Protease-Cocktail-Lösung in einen und ziehen Sie 50 l Wasser in den zweiten.</li>
	<li>Mit der Glaspipette und dem Mikropipettor schnell 10 Embryonen (ab Schritt 3.2) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr legen und die Kappe schließen (wie in Abbildung 2Abeschrieben). Wiederholen Sie dies für alle zu prüfenden, zu kontrollierenden und mit Ethanol behandelten Embryonen.</li>
	<li>Mit dem auf 200 l eingestellten Mikropipettor p200 öffnen Sie schnell die Kappe und entfernen Sie alle verbleibenden Embryomedien (wie in Abbildung 2Cbeschrieben). Legen Sie die Pipette mit 50 l Wasser schnell in das Rohr und schnell, aber schonend (um die Embryonen nicht zu beschädigen) hinzufügen, dann entfernen Sie das Wasser. Fügen Sie schnell 50 l der Protease-Cocktail-Lösung aus dem wartenden Pipettor hinzu und schließen Sie die Rohrkappe (Abbildung 2D). HINWEIS: Führen Sie diesen Prozess jeweils ein Beispiel durch.</li>
	<li>Lassen Sie die Probe 10 min bei RT sitzen, damit der Protease-Cocktail die Chorion abbauen kann. Dann schnell 450 l von 5 M NaCl hinzufügen und die Rohrkappe schließen (Abbildung 2E). Wirbel n. Chr. die Proben für 10 min. Um den Prozess zu beschleunigen, richten Sie den Mischer so ein, dass mehrere Samples gleichzeitig ausgewirbelt werden. HINWEIS: Fügen Sie eine kleine Menge (ca. 100 l) eines Kieselsäure-Perlengemisches (2 Größen, 0,5 mm und 1 mm Perle) zu einem Beliebigen Rohr mit Embryonen hinzu, die älter als 24 hpf sind. Bei älteren Embryonen bleibt der Notochord intakt, unabhängig davon, wie lange sie homogenisiert sind.</li>
	<li>Nach der Homogenisierung für 10 min, schnell entfernen 2 l homogenisierten Embryo Überstand und fügen Sie zu einem Gaschromatograph durchstechfum. Versiegeln Sie die Durchstechflasche schnell mit der Polytetrafluorethylenkappe.</li>
</ol>6. Vorbereitung von Medien- und Ethanolstandards
<ol><li>Um die Medienstandards vorzubereiten, verdünnen Sie die Medien um den Faktor 10 mit einer 5 M NaCl/Protease-Cocktaillösung. Fügen Sie 2 l jeder Probe in eine Gaschromatographen-Durchstechflasche und versiegeln Sie sie mit einer Polytetrafluorethylenkappe.</li>
	<li>Zur Herstellung der Ethanolstandards eine serielle Verdünnung von 100% Ethanol in 5 M NaCl/Protease-Cocktaillösung in folgenden Konzentrationen zu erstellen: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 und 40 mM. Fügen Sie 2 l jedes Standards zu einer Gaschromatographen-Durchstechflasche hinzu und versiegeln Sie sie mit einer Polytetrafluorethylenkappe.</li>
</ol>7. Vorbereitung des Kopfraum-Gaschromatographen
HINWEIS: Dieses Setup und Protokoll müssen möglicherweise je nach verwendetem Gaschromatographgeändert werden. Die Kopfraumgaschromatographie wird zur Quantifizierung des Ethanolgehalts und nicht zur Trennung verwendet.
<ol><li>Stellen Sie die Heizung für den Autosampler auf 58 °C ein und schalten Sie sie ein. Lassen Sie die Heizung 58 °C erreichen und schalten Sie die Luft- und Wasserstoffgasleitungen ein, die den Gaschromatographen einspeisen (für die Flammenionisierung zur Quantifizierung des Ethanols). HINWEIS: Der psi sollte so eingestellt sein, dass der Chromatograph gemäß den Spezifikationen des Herstellers ordnungsgemäß betrieben wird. Stellen Sie sicher, dass die Heliumlinie eingeschaltet ist und auf den richtigen psi eingestellt ist.</li>
	<li>Stellen Sie für das Septum sicher, dass die Anzahl der injizierten Proben nicht &gt;100 ist. Stellen Sie bei der Injektionsfaser sicher, dass die Anzahl der injizierten Proben nicht &gt;500 beträgt. HINWEIS: Wenn eine der beiden Injektionen über steigt, müssen sie vor dem Ausführen der Testproben geändert werden.</li>
	<li>Schalten Sie die Analysesoftware ein, und stellen Sie sicher, dass die Arbeitsstation ordnungsgemäß eingerichtet ist. Speichern Sie alle Daten gemäß labor-/abteilungsstandards. Erstellen Sie eine neue Beispielliste für die auszuführenden Beispiele.</li>
	<li>Initiieren Sie die Startmethode, und warten Sie, bis sich der Flammenionisationsdetektor stabilisiert hat, bevor die Proben ausgeführt werden. Sobald stabil, führen Sie die Software-Startmethode aus, um die Faser zu reinigen.</li>
</ol>8. Probenmessungen mittels Kopfraumgaschromatographie
<ol><li>Sobald die Startmethode abgeschlossen ist, erstellen Sie 1 neue Zeile pro Beispiel in der Beispielliste. Aus dem Methoden-Menü in der Analyse-Software, last 436 Current spme Ethanol 2013 3min absorbieren 2_5min rg laufen. METH für jede Probe in der Stichprobenliste.<ol>
<li>Füllen Sie die Probenliste aus, beginnend mit der Luft, Wasser, 5 M NaCl/Protease Cocktail-Rohlinge. Geben Sie dann die Standards in der Reihenfolge von 0,3125 bis 40 mM ein. Folgen Sie den Standards mit einer zweiten Runde luft-, wasser- und 5 M NaCl/Protease-Cocktailrohlinge.</li>
		<li>Geben Sie alle zu testenden homogenisierten Embryo-Überstandproben ein, von der niedrigsten bis zur höchsten vorhergesagten Ethanolkonzentration. Zum Ende eine dritte und letzte Runde der Luft, des Wassers und der 5 M NaCl/Protease-Cocktailrohlinge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie die Gaschromatographen-Fläschchen in der Reihenfolge, in der die Proben eingegeben wurden, zum Autosampler hinzu. Lassen Sie Proben für 10-15 min erwärmen. Starten Sie die Probeläuft in der Software.</li>
	<li>Nachdem alle Samples und die letzten Leerzeichen ausgeführt wurden, aktivieren Sie die Shutdown-Methode in der Software, indem Sie ein endgültiges Beispiel in der Beispielliste hinzufügen und den Standby-Vorgang ausführen. METH. Sichern Sie alle Daten, die während der Beispielläufe erfasst wurden. Schalten Sie das Gerät in der folgenden Reihenfolge aus: Autosampler-Heizung, Wasserstofftank und erst nach erreichen die Chromatographentemperatur 30 °C, den Lufttank. Lassen Sie den Heliumtank an, um die Wachssäule zu erhalten.</li>
</ol>9. Proben-Ethanol-Spitzenintegration und Probenkonzentrationsanalyse
HINWEIS: Alle Werte ab 9.3 wurden in einer Excel-Datei berechnet, die alle Gleichungen vorgefüllt haben.
<ol><li>Sobald die Herunterfahrmethode abgeschlossen ist, klicken Sie auf Chromatogramm öffnen. Öffnen Sie den Ordner mit den Ergebnissen. Samples werden automatisch in dieses Programm integriert.</li>
	<li>Stellen Sie in den Ergebnissen sicher, dass die richtigen Spitzen integriert wurden (Ethanolspitzen zwischen 2 und 2,5). Sobald alle Proben bestätigt wurden, drucken oder exportieren Sie die Ergebnisse.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Spitzenhöhe der Ethanolstandards auf einem Diagramm. Berechnen Sie die Steigungs-, Y-Abfang- undR2-Werte für die Ethanol-Standards (R2 sollte &gt;0,99) sein. HINWEIS: Diese Werte werden verwendet, um die Ethanolkonzentration aus der Probenspitzenhöhe zu bestimmen.</li>
	<li>Subtrahieren Sie für jede Probe die Spitzenhöhe der Probe vom Y-Abfang der Ethanolstandards. Dividieren Sie diesen Wert durch die Steigung der Ethanolstandards, um den Ethanolwert für jede Probe in den GC-Fläschchen zu erhalten.</li>
</ol><img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ03.jpg">
<ol start="5"><li>Um die Ethanolkonzentration in den Embryonen zu berechnen, berechnen Sie zunächst den Verdünnungsfaktor für jede Probe. Nehmen Sie die in Schritt 2.3 dieses Protokolls berechnete Volumenmessung und dividieren Sie sie durch die Volumenmessung plus 500 l. Dies entspricht der 5 M NaCl/Protease-Cocktaillösung, die jeder Probe während der Embryoverarbeitung zugesetzt wird (Schritte 5.3 und 5.4).</li>
</ol><img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ04.jpg">
<ol start="6"><li>Multiplizieren Sie diesen Probenverdünnungsfaktor mit dem Ethanolwert der Probe für jede Probe. Die Ergebnisse werden in mM-Konzentration sein. Berechnen Sie Medienreferenzproben, indem Sie den Ethanolwert des Mediums mit dem Verdünnungsfaktor 10 multiplizieren.</li>
</ol><img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ05.jpg">
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ06.jpg">

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Als Entwicklungsmodellsystem sind Zebrafische ideal geeignet, um die Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die Entwicklung zu untersuchen. Sie produzieren eine große Anzahl von extern befruchteten Embryonen, was präzise Timing- und Dosierungsparadigmen in Ethanolstudien ermöglicht. Zusammen mit den Live-Bildgebungsfunktionen und der genetischen und Entwicklungserhaltung mit Menschen machen Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modellsystem für teratologische Studien. Described ist ein Protokoll zur Messung embryonaler Etha...

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) beschreibt eine breite Palette von neurologischen Beeinträchtigungen und craniofacial Dysmorphologien im Zusammenhang mit embryonalen Ethanol-Exposition1. Mehrere Faktoren, einschließlich Timing und Dosierung der Ethanol-Exposition und genetischen Hintergrund, tragen zur Variation von FASD2,3. Beim Menschen macht die komplexe Beziehung dieser Variablen das Studium und Verständnis der Ätiologie der FASD schwierig. Tiermodelle haben sich als entscheidend für die Entwicklung unseres Verständnisses der mechanistischen Grundlage der Ethanol-Teratogenität erwiesen. Eine Vielzahl von Tiermodellsystemen wurde verwendet, um mehrere Aspekte der FASD zu untersuchen, und die Ergebnisse stimmten bemerkenswert mit dem überein, was bei der Exposition beim Menschen gefunden wird4. Nagetiermodellsysteme werden verwendet, um viele Aspekte von FASD zu untersuchen, wobei Mäuse die häufigsten5,6,7sind. Der Großteil dieser Arbeit konzentrierte sich auf Entwicklungsdefekte bei früher Ethanol-Exposition8, obwohl sich eine spätere Exposition gegenüber Ethanol als Entwicklungsanomalien sowie9erwiesen hat. Darüber hinaus haben die genetischen Fähigkeiten von Mäusen in unserer Fähigkeit, die genetischen Grundlagen von FASD10,11zu erforschen, stark unterstützt. Diese Studien an Mäusen deuten stark darauf hin, dass es Gen-Ethanol-Wechselwirkungen mit dem Schall-Igel-Signalweg, Retinsäure-Signalisierung, Superoxid-Dismutase, Stickoxid-Synthase I, Aldh2 und Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19,20,21. Diese Studien zeigen, dass Tiermodelle entscheidend sind, um unser Verständnis von FASD und seinen zugrunde liegenden Mechanismen zu fördern.
Der Zebrafisch hat sich als ein leistungsfähiges Modellsystem entwickelt, um viele Aspekte der Ethanolteratogenese22,23zu untersuchen. Aufgrund ihrer externen Befruchtung, hohen Fruchtbarkeit, genetischen Traktionsfähigkeit und Live-Bildgebung sind Zebrafische ideal geeignet, um Faktoren wie Timing, Dosierung und Genetik der Ethanol-Teratogenese zu untersuchen. Ethanol kann präzise inszenierten Embryonen verabreicht werden und die Embryonen können dann abgebildet werden, um die direkte Wirkung von Ethanol während der Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Diese Arbeit kann direkt mit dem Menschen in Verbindung gebracht werden, da die genetischen Entwicklungsprogramme zwischen Zebrafischen und Menschen stark konserviert sind und daher helfen können, FASD-Humanstudien zu leiten24. Während Zebrafische verwendet wurden, um Ethanol-Teratogenese zu untersuchen, macht ein Mangel an Konsens bei der Meldung embryonaler Ethanolkonzentrationen den Vergleich mit Menschen schwierig25. In Säugetiersystemen korrelieren Blutalkoholwerte direkt mit dem Ethanolspiegel des Gewebes26. Viele der Zebrafisch-Studien behandeln Embryonen vor der vollständigen Bildung ihres Kreislaufsystems. Da keine mütterliche Probe zu untersuchen ist, ist ein Verfahren zur Bewertung der Ethanolkonzentrationen erforderlich, um den Ethanolgehalt im Embryo zu quantifizieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Quantifizierung der Ethanolkonzentrationen in einem sich entwickelnden Zebrafisch-Embryo mittels Kopfraumgaschromatographie.

<table><tbody><tr><td>Luft</td><td></td><td></td><td>Im Auftrag der Universität zur Verfügung gestellt</td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>AutoSampler, CP-8400</td><td>Varian</td><td></td><td>Gaschromatograph Autosampler</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Gaschromatographen-Fläschchen mit Polytetrafluorethylen/Silikon-Septum und Kunststoffkappe 2 mL</td><td>Agilent</td><td>8010-0198</td><td>Kann die Fläschchen nach der Reinigung wiederverwenden, jedoch nicht die Kappen/Septen</td></tr><tr><td>Gaschromatograph, CP-3800</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helium</td><td></td><td></td><td>Im Auftrag der Universität</td></tr><tr><td>HP Innowax Kapillarsäule</td><td>Agilent</td><td>19095N-123I</td><td>30 m x 0,53 mm x 1,0 &mu; m Film dickes</td></tr><tr><td>Hyrdogen</td><td></td><td></td><td>Im Auftrag der Universität zur Verfügung gestellt</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (Heptahydrat)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682002</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen 10 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen 1000 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen 200 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L Mikropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L Mikropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L Mikropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Polytetrafluorethylen/Silikon-Septum und Kunststoffkappe</td><td>Agilent</td><td>5190-7021</td><td>Ersatzkappen/Septen für Gaschromatographenfläschchen</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat (dibasisch)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>VWR</td><td>97062-916</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumdioxidperlen .5 mm</td><td>Biospec Products</td><td>11079105z</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumdioxidperlen 1,0 mm</td><td>Biospec Products</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat (zweibasisch)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Festphasen-Mikroextraktionsfaserbaugruppe Carboxen/Polydimethylsiloxan</td><td>Millipore Sigma</td><td>57343-U</td><td>Ersatzfasern</td></tr><tr><td>Star Chromatography Workstation</td><td>Varian</td><td></td><td>Chromatographie-Software</td></tr><tr><td>Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septen</td><td>Millipore Sigma</td><td>23154</td><td>Ersatz-Einlasssepten</td></tr></tbody></table>

quantifizierung des ethanolgehalts in zebrafisch-embryonen mittels head space gas chromatographie

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Fetale Alkoholspektrumsstörungen (FASD) beschreiben ein hochvariables Kontinuum von Ethanol-induzierten Entwicklungsfehlern, einschließlich Gesichtsdysmorphologien und neurologischen Beeinträchtigungen. Bei einer komplexen Pathologie betrifft FASD etwa 1 von 100 Kindern, die jedes Jahr in den Vereinigten Staaten geboren werden. Aufgrund der sehr variablen Natur von FASD haben sich Tiermodelle in unserem aktuellen mechanistischen Verständnis von ethanolinduzierten Entwicklungsfehlern als kritisch erwiesen. Immer mehr Laboratorien konzentrieren sich auf die Verwendung von Zebrafischen zur Untersuchung von Ethanol-induzierten Entwicklungsfehlern. Zebrafische produzieren eine große Anzahl von extern befruchteten, genetisch befruchtbaren, durchscheinenden Embryonen. Dies ermöglicht es Forschern, Timing und Dosierung der Ethanol-Exposition in mehreren genetischen Kontexten präzise zu steuern und die Auswirkungen der embryonalen Ethanol-Exposition durch Live-Bildgebungstechniken zu quantifizieren. Zusammen mit dem hohen Grad an Erhaltung sowohl der Genetik als auch der Entwicklung beim Menschen hat sich der Zebrafisch als ein starkes Modell erwiesen, um die mechanistische Grundlage der Ethanol-Teratogenität zu untersuchen. Die Ethanolexpositionsschemas unterscheiden sich jedoch zwischen verschiedenen Zebrafischstudien, was die Interpretation von Zebrafischdaten in diesen Studien verwirrt hat. Hier ist ein Protokoll zur Quantifizierung der Ethanolkonzentrationen in Zebrafischembryonen mittels Kopfraumgaschromatographie.

Der Ethanolgehalt im Blut kann bei frühen embryonalen Zebrafischen nicht bestimmt werden, da es an einem voll ausgebildeten Kreislaufsystem fehlt. Um die Ethanolkonzentration in den Zebrafischembryonen zu bestimmen, werden die Ethanolwerte direkt aus homogenisiertem embryonalem Gewebe gemessen. Um die embryonalen Ethanolkonzentrationen richtig messen zu können, muss das embryonale Volumen berücksichtigt werden. Der Embryo (Dotter befestigt) sitzt in der Chorion (Eierschale) umgeben von extraembryonaler Flüssigkeit (<stro...

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung des Ethanolgehalts in einem Zebrafisch-Embryo mithilfe der Kopfraumgaschromatographie von geeigneten Expositionsmethoden für die Embryoverarbeitung und Ethanolanalyse.

Quantifizierung des Ethanolgehalts in Zebrafisch-Embryonen mittels Head Space Gas Chromatographie

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es hilft, die Pharmakokinetik von Ethanol bei der Entwicklung von Zebrafischembryonen zu verstehen, und dies wird dazu beitragen, Ethanol-Expositionsregime in Zebrafischstudien zu standardisieren. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass sie es Forschern ermöglicht, den Ethanolspiegel während der embryonalen Entwicklung schnell und reproduzierbar zu messen, insbesondere in Embryonen, in denen keine Blutversorgung verfügbar ist. Diese Methode kann leicht auf andere Modellsysteme sowie andere Umweltfaktoren angewendet werden, die eine ordnungsgemäße Technik und Ausrüstungseinrichtung voraussetzt.Ich würde erwarten, dass Personen, die dieses Protokoll zum ersten Mal durchführen, mit der Geschwindigkeit kämpfen, die notwendig ist, um die Verdunstung von Ethanol während der Embryoverarbeitung zu verhindern. Beginnen Sie mit der Übertragung von 10 Embryonen mit extra embryonaler Flüssigkeit in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren, die mit einer Linie bei einem Volumen von 250 Mikrolitern markiert sind. Fügen Sie der Fülllinie Wasser hinzu.Bereiten Sie zusätzliche Mikrozentrifugenröhrchen für dechorionierte Proben vor. Um die Chorion zu entfernen, inkubieren Sie die Embryonen in einer 100-Millimeter-Petrischale mit zwei Milligramm pro Milliliter Protease-Cocktail in Embryomedien für 10 Minuten. Mischen Sie das Gericht alle paar Minuten, um den Chorion zu brechen.Sobald alle Embryonen frei von der Chorion sind, entfernen Sie sie aus dem Protease-Cocktail und waschen Sie sie zweimal mit frischen Medien. Dann die Embryonen in eine frische 100-Millimeter-Schale übertragen. Wenn alle Proben zur Volumenmessung bereit sind, verwenden Sie eine P200-Mikropipette mit der kleinsten Spitze, um sorgfältig alle Flüssigkeiten aus der Umgebung der Embryonen zu entfernen.Wiegen Sie das Wasser mit einer Skala mit einer Skala von weniger als 0,1 Milligramm Genauigkeit, und bestimmen Sie dann das Volumen der 10 Embryonen, indem Sie das Gewicht des entfernten Wassers von 250 Mikrolitern subtrahieren. Um das Volumen eines einzelnen Embryos zu bestimmen, dividieren Sie die Differenz durch 10. Sammeln Sie die Embryonen aus den Paarungstanks und legen Sie sie in eine Standard 100 Millimeter Petrischale und bebrüten die Schale dann bei 28,5 Grad Celsius.Nach sechs Stunden nach der Befruchtung bis zu 100 Embryonen in eine neue Schale mit Embryomedien und 1% Ethanol oder Medien allein übertragen. Bedecken, aber nicht versiegeln Sie die Petri-Gerichte und legen Sie sie in einem 28,5 Grad Celsius Inkubator für 18 Stunden oder bis sie 24 Stunden nach der Düngung erreichen. Verwenden Sie zwei P200-Mikropipetten, die auf 50 Mikroliter eingestellt sind, und aspirieren Sie die Protease-Cocktail-Lösung in eine und gießen Sie sie in die zweite.Dann legen Sie schnell 10 Embryonen in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit einer Glaspipette und schließen Sie die Kappe. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle zu prüfenden, kontrollierenden Proben und mit Ethanol behandelten Embryonen. Wenn Sie mit jeweils einer Probe arbeiten, öffnen Sie schnell die Kappe und aspirieren Sie alle verbleibenden Embryomedien mit einer P200-Mikropipette, die auf 200 Mikroliter eingestellt ist.Schnell aber schonend die 50 Mikroliter Wasser hinzufügen und entfernen, dann die 50 Mikroliter Protease-Cocktail hinzufügen und die Rohrkappe schließen. Lassen Sie die Probe für 10 Minuten bei Raumtemperatur sitzen, dann schnell 450 Mikroliter von fünf Mol-Natriumchlorid hinzufügen und die Rohrkappe schließen. Homogenisieren Sie die Probe durch Wirbeln für 10 Minuten und übertragen Sie zwei Mikroliter Überstand auf eine Gaschromatographie-Durchstechflasche.Versiegeln Sie die Durchstechflasche mit einer Polytetrafluorethylenkappe. Nach Abschluss der Startmethode 436 aktuelle SPME Ethanol zwei bis fünf Minuten RG-Lauf laden. Meth aus dem Methodenmenü in der Analysesoftware für jedes Beispiel in der Beispielliste.Füllen Sie die Probenliste ab, beginnend mit der Luft, Wasser und fünf Molar-Natriumchlorid-Protease-Cocktail-Rohlinge. Geben Sie dann die Ethanol-Standards in der Reihenfolge von 0,3125 bis 40 Millimolar ein. Folgen Sie den Standards mit der zweiten Runde der Rohlinge.Geben Sie alle homogenisierten Embryo-Überstandproben ein, die von der niedrigsten bis zur höchsten vorhergesagten Ethanolkonzentration getestet werden sollen, und beenden Sie sie, indem Sie in eine dritte Runde von Rohlingen eintreten. Fügen Sie die Gaschromatographie-Fläschchen in der Reihenfolge, in der die Proben eingegeben wurden, zum Autosampler hinzu und lassen Sie sie 10 bis 15 Minuten erwärmen. Starten Sie dann die Beispielläufe mit der Software.Nachdem alle Ausführungen abgeschlossen sind, aktivieren Sie die Shutdown-Methode, indem Sie ein endgültiges Beispiel in der Beispielliste hinzufügen und Standby.meth ausführen. Sichern Sie alle Daten, die während des Beispiellaufs erfasst wurden. Sobald die Herunterfahrmethode abgeschlossen ist, klicken Sie auf Chromatogramm öffnen und öffnen Sie den Ordner mit den Ergebnissen.Samples werden automatisch in dieses Programm integriert. Stellen Sie in den Ergebnissen sicher, dass die richtigen Spitzen integriert wurden. Sobald alle Proben bestätigt wurden, drucken oder exportieren Sie die Ergebnisse.Zeichnen Sie die Spitzenhöhe der Ethanolstandards in einem Diagramm und berechnen Sie dann die Neigungs-, y-Abfang- und r-Quadratwerte. Erhalten Sie den Ethanolwert für jede Probe, indem Sie die Spitzenhöhe der Probe vom y-Abfang der Standards subtrahieren und diesen Wert durch die Steigung der Standards dividieren. Um die Ethanolkonzentration in den Embryonen zu berechnen, berechnen Sie den Verdünnungsfaktor für jede Probe und multiplizieren Sie den Ethanolwert der Probe mit diesem Verdünnungsfaktor.Berechnen Sie schließlich Medienreferenzproben, indem Sie den Ethanolwert der Medien mit einem Verdünnungsfaktor von 10 multiplizieren. Um die embryonalen Ethanolkonzentrationen richtig zu berechnen, wurden die Mengen der Embryonen sowohl in ihrem Chorion als auch in ihrem Chorion gemessen. In dieser Analyse machte der Embryo 56% des Gesamtvolumens innerhalb der Chorion aus.Basierend auf zuvor veröffentlichten Arbeiten wurden 73,6 % als embryonaler Wassergehalt für alle vorgestellten Analysen verwendet. Daraus resultierte Wasser mit 0,82 Mikrolitern der 1,1 Mikroliter embryonalen Volumens. Vom gesamten Wasservolumen sind 49 % im Embryo und 51 % in der extraembryonalen Flüssigkeit enthalten.Für die Gaschromatographie-Analyse wurden zwei Gruppen von 15 Proben und die Medien, mit denen sie behandelt wurden, fünfmal pro Gruppe gemessen. Der Ethanolgehalt der Medien war 143,6 Millimolar für Gruppe eins und 133,6 Millimolar für Gruppe zwei. Die Ethanolkonzentrationen der Embryonen betrugen durchschnittlich 63,5 Millimolar bzw. 53,1 Millimolar für die Gruppen eins und zwei.Für jede Probe wurde ein Verhältnis der embryonalen Ethanolkonzentration zu den Mediaspiegeln von Ethanol berechnet. Gruppe eins hatte 44% der Media-Ethanol-Werte, während Gruppe 40% der Medien-Ethanol-Werte hatte. Unbehandelte Kontrollembryonen wurden mit einer Ethanolkonzentration von null Millimolaren Medien gemessen.Das Wichtigste, was man beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollte, ist, dass die richtige Verarbeitung der Embryonen für die GC-Analyse entscheidend ist, da Ethanol flüchtig ist und schnell verdampft. Der beste Weg, um diesen Schritt durchzuführen, wird beschrieben, aber es muss geübt werden, um richtige Muskelgedächtnis zu entwickeln. Dieses Verfahren wird dazu beitragen, Ethanol-Behandlungssysteme in Zebrafischen zu standardisieren und zukünftige Arbeiten zu ermöglichen, um die genetischen und zellulären Mechanismen der ethanalen Teratogenität zu sezieren.

quantification-ethanol-levels-zebrafish-embryos-using-head-space-gas

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Um die molekularen Mechanismen des Ethanol-induzierte Entwicklungsstörungen verstehen, haben wir einen Zebrafisch-Modell von Ethanol Exposition entwickelt und erforschen die physikalischen, zellulären und genetischen Veränderungen, die nach der Exposition auftreten...

Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure

Zebrafisch stellen eine leistungsstarke Wirbeltier-Modell, das schon für metabolische Studien nicht ausreichend genutzt hat. Hier beschreiben wir eine schnelle Methode, um die...

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

Dieses Video zeigt die Verwendung von Headspace-Gaschromatographie zur Bestimmung der Ethanolkonzentrationen in Zebrafischembryonen. Diese Methode stellt ein nützliches Werkzeug für die qualitative und quantitative Analyse flüchtiger organischer Verbindungen dar.

Headspace-Gaschromatographie: Eine Technik zur Bestimmung der Ethanolkonzentration in Zebrafischembryonen

Eine neuartige Methode zur Verringerung der Variabilität bei der Exposition von Fischen gegenüber Drogen wird erläutert.  Bei Fischen, die verschiedenen Mustern der Ethanolexposition ausgesetzt waren, wurde in einem Hell/Dunkel-Scototaxie-Assay festgestellt, dass sie während des Entzugs ein verändertes Angstniveau aufwiesen.

Eine neue Methode der Drug Administration auf mehrere Zebrafisch ( Danio rerio) Und die Quantifizierung der Widerrufs

Anhaltende Fibrose mit Ablagerung von übermäßigen extrazellulären Matrixproteinen führt zu Zirrhose. Alkoholmissbrauch ist eine der Hauptursachen für schwere Lebererkrankungen. Wir haben ein Ethanol-induziertes Zebrafisch-Modell für fibrotische Lebern etabliert, um die Mechanismen und Strategien zur Förderung der Hepatozytenregeneration nach alkoholinduzierten Verletzungen zu untersuchen.

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Dieses Protokoll beschreibt histologische Analysen der Leber aus Zebrafisch-Larven, die mit 2% Ethanol für 24 Stunden behandelt wurden. Eine solche akute Ethanolbehandlung führt zu einer hepatischen Steatose und einer Schwellung des Lebergefäßsystems.

Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch

Gen-Editing-Technologien haben es Forschern ermöglicht, Zebrafischmutanten zu generieren, um die Genfunktion relativ einfach zu untersuchen. Hier bieten wir einen Leitfaden zur parallelen Embryo-Genotypisierung und Quantifizierung von In-situ-Hybridisierungssignalen in Zebrafischen. Dieser unvoreingenommene Ansatz bietet eine höhere Genauigkeit bei phäotypischen Analysen auf der Grundlage der In-situ-Hybridisierung.

Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen.

Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen

Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, die notwendigen Schritte zur Etablierung und Verwendung eines Assays für soziale Präferenzen für adulte Zebrafische zu skizzieren und zu zeigen, dass er zur Charakterisierung von Ethanol-induzierten sozialen Defekten verwendet werden kann.

Modellierung fetaler Alkoholspektrumstörungen beim Zebrafisch, um den Einfluss einer ungünstigen embryonalen Umgebung auf das Sozialverhalten von Erwachsenen zu charakterisieren

Hier stellen wir eine Methode vor, mit der mehrere Zebrafisch-Larvenproben (Danio rerio) ausgerichtet und kryosektioniert und auf einem einzigen Objektträger für die räumliche transkriptomische Analyse gesammelt werden können.

Räumlich kompakte Anordnung von Zebrafischlarvenschnitten für die räumliche Transkriptomanalyse

Wir haben eine modifizierte QuEChERS-HPLC-Methode entwickelt, um die internen Spiegel von 16 PAK in Zebrafischembryonen zu bestimmen.

Ein modifiziertes QuEChERS-HPLC-Verfahren zum Nachweis von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in Zebrafischembryonen, die Feinstaub ausgesetzt waren

Erfahren Sie, wie Sie Ethanol in Zebrafisch-Embryonen mittels Headspace-Gaschromatographie quantifizieren. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Messungen der Ethanol-Pharmakokinetik während der Embryonalentwicklung.

Quantifizierung des Ethanolgehalts in Zebrafisch-Embryonen mittels Head Space Gas Chromatographie

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