Entwicklung eines Larval Zebrafish Infection Model für Clostridioides difficile

Diese Methode kann die Schlüsselfrage über die Rolle des angeborenen Immunsystems bei der Clostridium-Infektion beantworten, wie ob und wie Makrophagen diesen Erreger erkennen oder phagozytose. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass es auf viele verschiedene anaerobe Bakterien angewendet werden kann, dass die Infektionszeit manipuliert werden kann, und dass die orale Verabreichung die normale menschliche Infektion viel näher darstellt. Nach der Kultivierung einen Milliliter der Kultur in eine Spektralphotometer-Küvette übertragen und den OD600 messen.

Übertragen Sie die benötigte Menge in ein frisches 1,5-Milliliter-Rohr, um eine endgültige OD von ein bis 1,2 in einem Milliliter Endvolumen zu erreichen. Einmal mit einem Milliliter 1X PBS waschen und Zentrifuge bei 5.000 mal g drei Minuten bei Raumtemperatur waschen. In einem Milliliter 1X PBS resuspendieren.

Fügen Sie drei Mikroliter Arbeitslösung des vorbereiteten Fluoreszenzfarbstoffs in die einMilliliter bakterielle Suspension ein. Inkubieren Sie die Probe für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Danach waschen Sie die gefärbten Clostridioides difficile einmal mit 1X PBS, um Restfarbstoff zu entfernen, und resuspendieren In einem Milliliter 1X PBS, um eine OD600 von 1,0 zu erreichen.

Zuerst legen Sie einen Tropfen von 0,8% niedrigschmelzende Agarose auf die Zebrafischlarven in einer Petrischale zu decken. Stellen Sie die Larven vorsichtig auf eine seitliche Position ein. Legen Sie die Petrischale 30 bis 60 Sekunden auf Eis, damit sich die schmelzende Agarose erstarren lässt.

Fügen Sie 30%Danieaus Medium mit 0,02% bis 0,04%Tricain e,- um die Agarose abzudecken. Zur Herstellung der Injektionslösung einen Mikroliter 0,5% Phenolrot in PBS-Lösung in neun Mikroliter des gefärbten Clostridioides difficile inoculum geben. Laden Sie eine kalibrierte Mikroinjektionsnadel mit der Injektionslösung mit einem Microloader.

Montieren Sie die geladene Nadel in einen Mikromanipulator und positionieren Sie sie unter einem Stereomikroskop. Stellen Sie den Einspritzdruck zwischen 600 und 900 Hektopascal ein. Stellen Sie die Injektionszeit auf 0,1 bis 0,3 Sekunden ein, um 0,5 bis 1,0 Nanoliter zu erhalten.

Stellen Sie die Nadel im Mikromanipulator in einem Winkel von etwa 45 Grad ein und zeigen Sie auf die eingebetteten Larven. Legen Sie die Nadelspitze über den Magen-Darm-Trakt, in der Nähe der Urogenitalpore. Durchbohren Sie die Agarose, dann den Muskel mit der Nadelspitze.

Dann setzen Sie es in das Darmlumen, und injizieren 0,5 bis 1,0 Nanoliter Clostridioides difficile. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die injizierten Larven zu überwachen, und verwenden Sie eine flexible Microloader-Spitze, um die richtig injizierten Larven für die konfokale Bildgebung aufzunehmen. In einer 1,5%agarose Platte mit Rillen, legen Sie einen Tropfen von 0,8%niedrigschmelzende Agarose auf die Zebrafischlarven zu decken.

Stellen Sie die Larven vorsichtig mit Köpfen an, die aufrecht in 45-Grad-Winkeln in der Nut und Schwänze an der Wand der Nut. Betätigen Sie die Nadel vorsichtig durch die Agarose, dann in den Mund von Zebrafischlarven, durch die Speiseröhre. Sobald sich die Spitze der Nadel in der vorderen Darmkugel befindet, drücken Sie das Injektionspedal, um 0,5 bis ein Nanoliter Bakterienkultur freizusetzen.

Füllen Sie das Lumen des Darms. Lassen Sie es nicht von der Speiseröhre oder Kloake überlaufen. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus dem Mund des Zebrafisches.

Nach dem Gavage die infizierten Zebrafischlarven mit einer flexiblen Mikroladerspitze aus der Agarose retten, indem Sie zuerst die Agarose wegschneiden und dann die Larven anheben. Diese Larven in steriles 30%Danieaus Medium übertragen und zweimal ausspülen. Nach der Anästhesisierung der Zebrafischlarven 200 bis 300 Mikroliter 1%niedrigschmelzender Agarose hinzufügen, um die anästhesierten Larven zu bedecken.

Den infizierten Bereich der Larven so nah wie möglich gegen eine Glasrutsche stellen. Lassen Sie die Agarose 30 bis 60 Sekunden auf Eis erstarren. Tauchen Sie die Agarose in 30%Danieaus Medium mit 0,02% bis 0,04%Tricain.

Fahren Sie fort, die Larven mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop abzubilden. Nach der Einschlässe der infizierten Zebrafischlarven, legen Sie eine Nadel in den dorsalen Stamm der Zebrafischlarven in der Nähe des Kopfes, um den Zebrafisch zu immobilisieren. Entfernen Sie den Kopf hinter den Kiemen mit einer Lanze.

Setzen Sie eine zweite Nadel in die Mitte des Rückenstamms ein. Legen Sie eine dritte Nadel in den Bauch des Zebrafisches, und ziehen Sie den Darm aus der Körperhöhle. Verwenden Sie eine Mikroinjektionsnadel, um 10 bis 15 Darme in eine 1,5-Milliliter-Röhre mit 200 Mikroliter sterilen 1X PBS zu übertragen.

Homogenisieren Sie den Darm mit einem Stößel, um das Gewebe zu stören und Homogenate vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass der Stößel den Boden des Rohres erreicht, um alle Eingeweide vollständig zu stören. In die Homogenate fügen Sie Clostridioides difficile Aufzuchtmedium mit D-Cycloserin und Cefoxitin, mit oder ohne Taurochoat, und in einer anaeroben Kammer brüten.

In dieser Studie, sowohl Neutrophile und Makrophagen erreichen die Infektionsstellen. Das Beispiel eines aktivierten Makrophagenphagozytisierens von zwei Bakterien zeigt die Reinigung durch Phagozytose und Die Verdauung der markierten Clostridioides difficile. Die Mikrogavage, um fluoreszenzmarkierte Clostridioides zu liefern, difficile in das Darmlumen von Makrophagen und neutrophilen Reporterlinien an fünf Tagen nach der Befruchtung imitiert den natürlichen Weg der Clostridioides difficile Infektion.

Neutrophile und Makrophagen zeigten jedoch bis zu 12 Stunden nach der Mikrogavage keine offensichtliche Migration in den Magen-Darm-Trakt. In der Zwischenzeit verschwand die Fluoreszenz der markierten Clostridioides difficile nach etwa fünf Stunden nach der Mikrogavage. Darmproben 24 Stunden nach der Infektion wurden seziert und zeigten bakterielles Wachstum.

In der Kontrollgruppe wuchsen keine Bakterien. Zu späteren Zeitpunkten wuchsen inkubierte Proben nur in dem Medium, das TCA enthielt, was darauf hindeutet, dass die Gesamt-Clostridioides-Difficile im Darm Sporen gebildet hatten. 16S rDNA PCR identifizierte das angebaute Bakterium als Clostridioides difficile, die spezifische PCR-Amplicons von vorhersehbarer Größe um 800 Basenpaare produzieren.

Bakterienkulturen, die auf eine CHROMID-Platte angebaut wurden, erschienen als typische schwarze Kolonien, was weiter darauf hindeutete, dass Bakterien aus dem Zebrafischdarm Clostridioides difficile waren. Die Arbeit mit anaeroben Bakterien erfordert, dass die aeroben Schritte kurz gehalten werden, weil dies natürlich die Biologie der Bakterien beeinflusst. Angeborene Immunzellen in Zebrafischen können manipuliert werden.

Zum Beispiel können sie den Mechanismus der angeborenen Immunzellreaktionen auf die Infektion entschlüsseln. Unsere Methode zeigte, dass Zebrafische ein Werkzeug sein können, um anaerobe Krankheitserreger aus dem menschlichen Darm zu untersuchen. Die Arbeit mit multiresistenten Krankheitserregern erfordert, dass geeignete Sicherheitsmaßnahmen getroffen werden.