Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells
9. Mai 2020
In diesem Protokoll präsentieren wir ein experimentelles Design mit einem bedingten Knockdown-System und einem angepassten Kugelbildungstest, um die Wirkung von Clusterin auf die Stängel von patientenabgeleiteten GCSCs zu untersuchen. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um sowohl die In-vitro- als auch die In-vivo-Funktion von Stammgenen in verschiedenen CSCs-Typen zu untersuchen.
Krebsstammzellen sind an krebsverfälligen Metastasen an der Arzneimittelresistenz beteiligt. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Methode zur Untersuchung der Funktionen von Schlüsselgenen in Krebsstammzellen. Mit hilfe eines bedingten Knockdown-Systems und angepasstem Kugelbildungstest lässt sich diese Methode leicht anpassen, um In-vitro- und In-vivo-Funktionen an Stammgenen in verschiedenen Krebsstammzellen zu untersuchen.
Demonstrieren das Verfahren, werden Yuting Li und Xiangyu Tan, wissenschaftliche Assistenten aus meinem Labor. Zur Erzeugung von Lentivirus-Partikeln samen vier Millionen 293T lentivirale Verpackungszellen in eine 100-Millimeter-Petrischale mit 10 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10%FBS. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um sicherzustellen, dass die Zellen am Tag der Transfektion zu 50 bis 80% konfluent sind.
Reduzierens Serummedium auf Raumtemperatur bringen und Rohre A und B nach Manuskriptanweisungen vorbereiten. Fügen Sie den Inhalt der Tube A zu Tube B.Mix gut und inkubieren Sie die Röhre für 15 Minuten bei Raumtemperatur, um Lipid-DNA-Komplexe vorzubereiten. Entfernen Sie fünf Milliliter Medium aus der Zellkulturschale.
Dann fügen Sie fünf Milliliter des Lipid-DNA-Komplexes in die Zellkulturschale tropfen weise und wirbeln sie sanft. Inkubieren Sie das Kulturgericht für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Entfernen Sie nach der Inkubation vorsichtig das Transfektionsmedium und ersetzen Sie es durch 10 Milliliter vorgewärmtes DMEM, ergänzt durch 10%FBS.
Inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Etwa 48 Stunden nach der Transfektion ernten 10 Milliliter Lentivirus, das Überstände enthält, und filtern sie mit einem 0,45 Mikrometer-Gießfilter, um Zellablagerungen zu entfernen. Alle Zellkulturgefäße, Spitzen, Filter und Spritzen können Lentivirus enthalten und sollten vor der Entsorgung mit 10% Bleichmittel behandelt werden.
Übertragen Sie einen geklärten Überstand in einen sterilen Behälter. Lenti-X Konzentrator hinzufügen und mit sanfter Umkehrung vermischen. Inkubieren Sie die Mischung bei vier Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Tag zentrieren Sie die Probe bei 1500 mal G für 45 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, wobei Darauf geachtet wird, das Pellet am Boden nicht zu stören. Das Pellet in einem Milliliter DMEM, ergänzt mit 10%FBS, vorsichtig wieder aufhängen und bei minus 80 Grad Celsius lagern.
Samen 6 Millionen Magenkrebs Stammzellen oder GCSc es in eine 100-Millimeter-Petrischale mit 10 Milliliter DMEM ergänzt mit 10%FBS. Kultur die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Wenn die Zellen 70 bis 80 % Konfluenz erreichen, saugen Sie das Medium aus der Schale und fügen Sie die konzentrierten lentiviralen Partikel hinzu, die mit vier Millimetern komplettem DMEM-Medium verdünnt sind und Polybrene-Reagenz enthalten.
Geben Sie die Zellen für 18 Stunden in den Inkubator zurück. Polybren sollte unter verschiedenen Bedingungen getestet werden, um die effektive Konzentration zu bestimmen, die in der Regel im Bereich von zwei bis 10 Milligramm pro Milliliter liegt. Ersetzen Sie das Medium nach 18 Stunden durch 10 Milliliter DMEM durch 10%FBS und geben Sie die Zellen für 24 Stunden in den Inkubator zurück.
Dann, aspirieren Sie den Überstand mit den Zellablagerungen und fügen Sie frische DMEM ergänzt mit 10%FBS und 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Puromycin. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Dann ändern Sie das Medium wieder auf frische DMEM mit 10%FBS und fünf Mikrogramm pro Milliliter Puromycin ergänzt.
Nach einer weiteren 24-stündigen Inkubation spülen Sie die anhaftenden GCSCs zweimal mit fünf Millilitern DPBS ohne Kalzium und Magnesium ab. Dissoziieren Sie die Zellen mit einem Milliliter vorgewärmter Zelldissoziationslösung und inkubieren Sie sie für zwei bis drei Minuten bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann fünf Milliliter frisch vorgewärmtes GCSC-Gesamtkulturmedium in die Zellsuspension ein.
Geben Sie drei Milliliter dieser Suspension in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr zur Kryokonservierung und die anderen drei Milliliter in ein anderes Rohr zur Induktion mit Doxycyclin. Zentrifugieren Sie beide Rohre bei 800 mal G für fünf Minuten. Dann aspirieren Sie den Überstand aus Tube B und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischer vorgewärmter GCSC-Gesamtkulturmedium.
Säen Sie eine angemessene Anzahl von Zellen in eine neue 100-Millimeter-Petrischale mit 10 Millilitern frisch vorgewärmtem GCSC-Gesamtkulturmedium und 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin. Dann inkubieren Sie das Gericht für 48 Stunden. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die Dichte einer 10-Mikroliter-Probe von Zellen zu bestimmen.
Passen Sie dann das Volumen mit vorgewärmten GCSC-Gesamtkulturmedium an, um eine Konzentration von 20.000 lebensfähigen Zellen pro Milliliter zu erhalten. Geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in jeden Brunnen einer neuen, ultra niedrigen Befestigung 96 Well-Kulturplatte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Die Kugelbildung sollte innerhalb von drei bis zehn Tagen erfolgen. Bild die Tumorkugelbildung alle zwei Tage. Magenkrebs-Stammzellen aus primären menschlichen Magenadenokarzinom wurden in Serum-freie Kultur Medium kultiviert.
Nach sechs Tagen dehnten sich die Zellen vom einzelzelligen phänotypigen zu großen Kugeln aus. Um die Funktion von Clusterin in GCSCs zu bewerten, wurden kurze Haarnadel-RNA-Sequenzen gegen Clusterin in den Tet-GV307-RFP-Puro-Vektor geklont. Zellen, die mit dem Expressionsvektor transfiziert wurden, wurden 48 Stunden lang mit Doxycyclin behandelt.
Dann wurde die Clusterin-Expression durch Western Blot verifiziert und durch Densitometrie quantifiziert. Das Vorhandensein von Doxycyclin und Knockdown von Clusterin in GCSCs hemmten die Tumorkugelbildung. Während keine Hemmung der Tumorkugelbildung in Zellen beobachtet wurde, die mit den scrambled shRNA-Kontrollen transduziert wurden, was darauf hindeutet, dass Doxycyclin allein die Tumorkugelbildung nicht hemmte.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass GCSCs nach Clusterin-Silencing langsam wachsen und keine Tumorsphären bilden können. Basierend auf diesen Daten spielt Clusterin eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Selbsterneuerungsaktivität von GCSCs, was darauf hindeutet, dass es ein vielversprechendes Wirkstoffziel für die Unterdrückung von Krebsstammzellen bei Magenkrebspatienten sein könnte. Die Tumorkugeln sollten feste runde Strukturen auf einzelnen oder aggregierten Zellen sein, sollten nicht als Tumorsphären betrachtet werden.
Einige Krebsstammzellen bilden jedoch möglicherweise keine typischen Tumorkugelstrukturen. Dieses Verfahren kann mit anderen Methoden zur Untersuchung von Krebsstammzellen auf erneuerbarePotenziale in vitro befolgt werden. Beispielsweise kann der Ausdruck von stammbedingten Markern untersucht werden.
Das Protokoll kann erweitert werden, um die Funktionen der kritischen Gene in Krebsstammzellen wie Stammfähigkeit auf Überleben zu untersuchen.
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Überblick
Dieses Protokoll präsentiert ein experimentelles Design unter Verwendung eines bedingten Knockdown-Systems und eines angepassten Sphäre-Bildungs-Assays zur Untersuchung der Wirkung von Clusterin auf die Stammzelligkeit von patientenabgeleiteten GCSCs. Es kann leicht für In-vitro- und In-vivo-Studien von Stammzelligkeits-assoziierten Genen in verschiedenen Arten von Krebsstammzellen angepasst werden.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Krebsbiologie
- Stammzellenforschung
- Genfunktionsanalyse
Hintergrund
- Krebsstammzellen (CSCs) tragen zu Krebsrückfällen und Metastasen bei.
- Das Verständnis der Rolle spezifischer Gene in CSCs ist entscheidend für die Entwicklung zielgerichteter Therapien.
- Dieses Protokoll konzentriert sich auf das Gen clusterin und dessen Auswirkungen auf die Stammzelligkeit.
- Die Methode ermöglicht eine flexible Anwendung bei verschiedenen Krebsarten.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Rolle von Clusterin in der Stammzelligkeit von patientenabgeleiteten GCSCs.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zum Studium von Stammzelligkeits-assoziierten Genen.
- Verbesserung des Verständnisses der CSC-Biologie und potenzieller therapeutischer Ziele.
Verwendete Methoden
- Bedingtes Knockdown-System für Gensilencing.
- Anpassung des Sphäre-Bildungs-Assays zur Bewertung der Stammzelligkeit.
- In-vitro- und In-vivo-Experimentdesigns.
- Verwendung von lentiviralen Partikeln für die Genlieferung.
Hauptergebnisse
- Demonstrierte das Verfahren zur Erzeugung von Lentivirus-Partikeln.
- Bereitete Einblicke in die Auswirkungen von Clusterin auf GCSCs.
- Zeigte die Anpassungsfähigkeit der Methode für verschiedene CSC-Typen.
- Unterstrich die Bedeutung der Untersuchung von Stammzelligkeits-assoziierten Genen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ist effektiv für die Untersuchung der Rolle von Clusterin in Krebsstammzellen.
- Es kann für verschiedene Arten von Krebsstammzellen angepasst werden.
- Diese Forschung kann zu neuen Erkenntnissen in Krebsbehandlungsstrategien führen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of stemness-associated genes in patient-derived gastric cancer stem cells, supporting target validation in oncology discovery. By combining conditional knockdown with an adapted sphere formation assay, it provides quantitative, reproducible readouts for assessing gene function in cancer stemness pathways. The approach enhances predictive confidence in early-stage target selection and portfolio prioritization for gastric cancer therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking clusterin knockdown to reduced sphere formation, clarifying its role in GCSC self-renewal.
- Operational Value: Enables functional target validation through inducible, reversible gene silencing in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports preclinical go/no-go decisions by demonstrating that clusterin inhibition impairs tumorigenic potential in vitro.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable sphere formation metrics suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Uses lentiviral delivery and puromycin selection to ensure consistent knockdown efficiency across experiments.
- Scalability: Compatible with 96-well ultra-low attachment plates, enabling parallel testing of multiple genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses patient-derived gastric cancer stem cells, maintaining phenotypic fidelity to human tumor biology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro stemness assessment with potential in vivo validation of clusterin as a therapeutic target.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic evidence to prioritize clusterin in preclinical pipelines targeting cancer stem cell-driven relapse and resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling target validation after initial hit identification and before lead optimization in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking gene knockdown to functional stemness outcomes via sphere formation.
- Screening: Generates quantitative, imaging-based readouts that can be automated for compound or genetic suppressor screens.
- Analytics: Enables densitometric analysis of Western blots and sphere quantification for objective comparison of genetic conditions.
- Translational Research: Connects in vitro stemness phenotypes to potential in vivo models through conserved assay adaptability.
- Enterprise Reuse: The conditional knockdown-sphere formation platform is reusable across stemness-associated genes and cancer types beyond gastric cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stemness gene function through inducible, reversible knockdown in primary-derived cells.
- Operational Value: Standardizes stemness assessment via sphere formation, improving inter-lab reproducibility and assay transferability.
- Strategic Value: Increases confidence in target selection by providing causal evidence linking gene suppression to loss of tumorigenic potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets like clusterin based on functional validation in patient-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral production, cell culture, and molecular biology techniques including transfection and selection.
- Depends on access to ultra-low attachment plates, automated cell counters, and Western blotting infrastructure for validation.
- Necessitates standardization of doxycycline induction and puromycin selection timing across laboratories for consistent knockdown.
- Requires optimization of polybrene concentration and lentiviral titer for efficient transduction of primary gastric cancer stem cells.
- Limited by the dependency on sphere formation as a stemness readout, which may not capture all stemness phenotypes in heterogeneous cultures.
