Name: Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Erfahren Sie, wie CRISPR/Cas9-Genom-Screens zur Identifizierung von Zelloberflächenrezeptor-Ligand-Interaktionen eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht unvoreingenommene Erkenntnisse für therapeutische Anwendungen.

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Diese Arbeit wurde durch das Wellcome Trust-Stipendium Nr. 206194 unterstützt, das GJW zugesprochen wurde. Wir danken der Cytometry Core Einrichtung Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson und Christopher Hall für die Hilfe bei FACS.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Eine CRISPR-basierte Screening-Strategie zur Identifizierung von Genen, die zelluläre Komponenten kodieren, die an der zellulären Erkennung beteiligt sind, wird beschrieben. Ein ähnlicher Ansatz mit CRISPR-Aktivierung bietet auch eine genetische Alternative, um direkt interagierende Rezeptoren von rekombinanten Proteinen zu identifizieren, ohne große Proteinbibliotheken erzeugen zu müssen26. Ein großer Vorteil dieses Ansatzes ist jedoch, dass er auf Wechselwirkungen anwendbar ist, die von Oberflächenmolekülen vermittelt werden, die nativ auf der Zelle angezeigt werden, und nicht von der Überexpression von Rezeptoren abhängt, die die Bindungs-Avidität des Rezeptors beeinflussen können. Im Gegensatz zu anderen Methoden macht diese Technik daher keine Annahmen über die biochemische Natur oder Zellbiologie der Rezeptoren und bietet die Möglichkeit, Wechselwirkungen zu untersuchen, die durch Proteine vermittelt werden, die normalerweise schwierig zu untersuchen sind, indem sie biochemische Ansätze verwenden, wie z. B. sehr große Proteine, oder solche, die die Membran mehrmals durchqueren oder Komplexe mit anderen Proteinen bilden, und Molekülen außer Proteinen wie Glyklyans, Glycolipiden und Phospholipiden. Angesichts der genomskaligen Natur der Methode hat dieser Ansatz auch den Vorteil, nicht nur den Rezeptor zu identifizieren, sondern auch zusätzliche zelluläre Komponenten, die für das Bindungsereignis benötigt werden, und so Einblicke in die Zellbiologie des Rezeptors zu geben.
Eine der hauptwichtigsten Einschränkungen dieser Methode bei der Verwendung von ihm, um den Rezeptor eines verwaisten Proteins zu identifizieren, ist die anfängliche Anforderung, zuerst eine Zelllinie zu identifizieren, die an das Protein bindet. Dies ist nicht immer einfach, und die Identifizierung einer Zelllinie, die einen Bindungsphänotyp anzeigt, der auch für genetische Bildschirme zulässig ist, kann der zeitbegrenzende Schritt für die Bereitstellung dieses Assays sein. Einige Zelllinien neigen dazu, an mehr Proteine zu binden als andere. Dies ist besonders relevant für Proteine, die HS binden, da diese Proteine dazu neigen, an jede Zelllinie zu binden, die HS-Seitenketten anzeigt, unabhängig vom nativen Bindungskontext. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass die Upregulation von Syndecanen (d. h. Proteoglykanen, die HS enthalten) in Zelllinien zu einer erhöhten Bindung von HS-bindenden Proteinen führt26. Dies könnte ein Faktor sein, der bei der Auswahl der Zelllinie für das Screening berücksichtigt werden sollte. Wichtig ist jedoch auch, dass die additive Bindung von HS die Bindung an einen bestimmten Rezeptor nicht beeinträchtigt. Dies bedeutet, dass bei der Bindung es möglich ist, dass es ausschließlich durch HS vermittelt wird, weil die von HS in diesem Test vermittelte Bindung additiv und nicht koabhängig ist19. In einem solchen Szenario kann der beschriebene Heparin-Blockierungsansatz solche Verhaltensweisen identifizieren, ohne einen vollständigen genetischen Bildschirm durchführen zu müssen.
Eine nützliche Ressource für die Auswahl von Zelllinien ist Cell Model Passport, das Genomik, Transkriptomik und Kulturzustandsinformationen für 1.000 Krebszelllinien27enthält. Je nach biologischem Kontext können Zellen anhand ihrer Ausdrucksprofile ausgewählt werden. Um die Auswahl von Zelllinien zu unterstützen, haben wir in Cell Model Passport 1.000 Zellenlinien nach dem Ausdruck von 1.500 vorannotierten menschlichen Zelloberflächenglykoproteinen28 gruppiert (Ergänzende Abbildung 2; Clusterinformationen für jede Zelllinie zusammen mit Wachstumsbedingungen sind in der Ergänzenden Tabelle 2enthalten). Beim Testen der Bindung eines Proteins mit unbekannter Funktion ist es sinnvoll, aus jedem Cluster ein Panel mit repräsentativen Zelllinien auszuwählen, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, eine breite Palette von Rezeptoren abzudecken. Bei der Wahl wird empfohlen, Zelllinien zu wählen, die leicht zu beschaffen und leicht zu transduzieren sind. Da diese Zelllinien im Genom-Skalen-Screening verwendet werden, ist es vorzuziehen, dass sie leicht in großen Mengen angebaut werden können und für die lentivirale Transduktion freisind, da es die am häufigsten verfügbare Methode zur Bereitstellung von sgRNA für DAS CRISPR-basierte genetische Screening in den späteren Schritten ist.
Im Allgemeinen werden die Phänotyp-Auswahlen in einer einzigen Sorte durchgeführt. Dies wird jedoch durch die Helligkeit der gefärbten Zellpopulation im Vergleich zur Steuerung bestimmt. Iterative Auswahlrunden könnten für Szenarien angenommen werden, in denen das Signal-Rausch-Verhältnis des gewünschten Phänotyps niedrig ist, oder wenn das Ziel des Bildschirms darin besteht, Mutanten mit starken Phänotypen zu identifizieren. Bei der Verwendung eines iterativen Auswahlansatzes für FACS-basierte Bildschirme ist es wichtig zu berücksichtigen, dass der Sortierprozess zum Zelltod führen kann, hauptsächlich aufgrund der schieren Kraft des Sortierers. Somit werden nicht alle gesammelten Zellen in der nächsten Sortierrunde dargestellt.
Die Komplexität der Bibliothek ist ein sehr wichtiger Faktor bei der Durchführung erfolgreicher genetischer Bildschirme, insbesondere bei negativen Selektionsbildschirmen, da das Ausmaß der Erschöpfung in diesen nur durch einen Vergleich der Ergebnisse mit dem, was in der Startbibliothek vorhanden war, bestimmt werden kann. Bei negativen Auswahlbildschirmen ist es üblich, Bibliotheken mit einer Komplexität von 500-1.000 x zu verwalten. Positive Auswahlbildschirme sind jedoch robuster für Bibliotheksgrößen, da in solchen Bildschirmen nur eine geringe Anzahl von Mutanten für einen bestimmten Phänotyp ausgewählt werden soll. Daher kann im hier beschriebenen positiven Auswahlbildschirm die Bibliotheksgröße auf 50-100x Komplexität reduziert werden, ohne die Qualität des Bildschirms zu beeinträchtigen. Darüber hinaus ist es in diesen Bildschirmen auch möglich, eine Steuerbibliothek für eine bestimmte Zellzeile an einem bestimmten Tag als "allgemeine Kontrolle" für alle Proben zu verwenden, die am Tag für diese angegebene Zelllinie sortiert sind. Dadurch wird die Anzahl der Steuerelementbibliotheken verringert, die erstellt und sequenziert werden müssen.
Eine weitere wichtige Überlegung für die Verwendung dieses Ansatzes sind die Grenzen von Funktionsverlust-Screens bei der Identifizierung von Genen, die für das In-vitro-Zellwachstum unerlässlich sind. Der Zeitpunkt der Bildschirme ist in dieser Hinsicht entscheidend, da je länger die mutierten Zellen in der Kultur gehalten werden, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass Zellen mit Mutationen in essentiellen Genen nicht mehr lebensfähig werden und nicht mehr in der mutierten Bibliothek dargestellt werden. Die jüngsten genetischen Screens, die im Rahmen der Project Score-Initiative in über 300 Zelllinien durchgeführt wurden, zeigen, dass mehrere Gene in der KEGG-kommentierten Proteinsekretion und dem N-Glykosylierungsweg oft als wesentlich für eine Reihe von Zelllinien identifiziert werden (Ergänzende Abbildung 3)29. Dies kann bei der Gestaltung von Bildschirmen berücksichtigt werden, wenn die Wirkung von Genen, die für die Proliferation und Lebensfähigkeit erforderlich sind, im Kontext des zellulären Erkennungsprozesses untersucht werden soll. In diesem Fall wäre es generell angemessen, Bildschirme zu einem frühen Zeitpunkt (z. B. Tag 9 Nachtransduktion) durchzuführen. Wenn der Ansatz jedoch verwendet wird, um einige Ziele mit starken Größeneffekten anstelle von allgemeinen zellulären Bahnen zu identifizieren, kann es sinnvoll sein, Bildschirme zu einem späteren Zeitpunkt durchzuführen (z. B. Tag 15-16 Posttransduktion).
Die Ergebnisse des Screenings sind sehr robust; in acht rekombinanten Proteinbindungssieben, die in der Vergangenheit durchgeführt wurden, war der Zelloberflächenrezeptor in jedem Fall der Top-Hit19. Bei der Identifizierung des Interaktionspartners mit diesem Ansatz sollte man daher erwarten, dass der Rezeptor und die Faktoren, die zu seiner Darstellung auf der Oberfläche beitragen, mit einem hohen statistischen Vertrauen identifiziert werden. Sobald der Bildschirm durchgeführt und ein Treffer mit einem einzigen gRNA-Knockout validiert wurde, können weitere Nachuntersuchungen mit vorhandenen biochemischen Methoden wie AVEXIS4 und der direkten sättigungsfähigen Bindung von gereinigten Proteinen mit Oberflächenplasmonresonanz durchgeführt werden. Der hier beschriebene Ansatz gilt für alle Proteine, für die eine lösliche rekombinante Bindungssonde erzeugt werden kann.
Zusammenfassend ist dies ein CRISPR-Knockout-Ansatz im Genommaßstab, um Wechselwirkungen zu identifizieren, die durch Zelloberflächenproteine vermittelt werden. Diese Methode ist allgemein anwendbar, um zelluläre Bahnen zu identifizieren, die für die Zelloberflächenerkennung in einer Vielzahl unterschiedlicher biologischer Kontexte erforderlich sind, einschließlich zwischen den eigenen Zellen eines Organismus (z. B. neuronale und immunologische Erkennung) sowie zwischen Wirtszellen und Pathogenproteinen. Diese Methode bietet eine genetische Alternative zu biochemischen Ansätzen, die für die Identifizierung von Rezeptoren entwickelt wurden, und da sie keine vorherigen Annahmen in Bezug auf die biochemische Natur oder Zellbiologie der Rezeptoren erfordert, hat sie großes Potenzial, völlig unerwartete Entdeckungen zu machen.

Extrazelluläre Wechselwirkungen durch Zelloberflächenrezeptorproteine leiten wichtige biologische Prozesse wie Gewebeorganisation, Wirtspathogenerkennung und Immunregulation. Die Untersuchung dieser Wechselwirkungen ist für die breitere biomedizinische Gemeinschaft von Interesse, da Membranrezeptoren umsetzbare Ziele systematisch gelieferter Therapeutika wie monoklonale Antikörper sind. Trotz ihrer Bedeutung bleibt das Studium dieser Wechselwirkungen technisch anspruchsvoll. Dies liegt vor allem daran, dass membranintegrierte Rezeptoren amphipathisch sind, was sie schwierig macht, von biologischen Membranen für biochemische Manipulation zu isolieren, und ihre Wechselwirkungen werden durch die schwachen Wechselwirkungen(KDs im M-mM-Bereich)1typisiert. Folglich sind viele häufig verwendete Methoden ungeeignet, um diese Klasse von Proteinwechselwirkungen zu erkennen1,2.
Eine Reihe von Methoden wurde entwickelt, um speziell extrazelluläre Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen zu untersuchen, die ihre einzigartigen biochemischen Eigenschaften berücksichtigen3. Eine Reihe dieser Ansätze beinhaltet die Expression der gesamten Ektodomäne eines Rezeptors als lösliches rekombinantes Protein in Säugetier- oder Insektenzellsystemen, um sicherzustellen, dass diese Proteine posttranslationale Modifikationen enthalten, die strukturell wichtig sind, wie Glykane und Disulfidbindungen. Um die Bindung mit geringer Affinität zu überwinden, werden die Ectodomains oft oligomerisiert, um ihre Bindungssucht zu erhöhen. Avid Protein-Ectodomains wurden erfolgreich als Bindungssonden eingesetzt, um Interaktionspartner in direkten rekombinanten Protein-Protein-Interaktionsbildschirmen4,5,6,7zu identifizieren. Obwohl im Großen und Ganzen erfolgreich, erfordern rekombinante proteinbasierte Methoden, dass die Ectodomain eines Membranrezeptors als lösliches Protein produziert wird. Daher ist es nur allgemein anwendbar auf Proteine, die eine zusammenhängende extrazelluläre Region enthalten (z. B. Single-Pass Typ I, Typ II oder GPI-verankert) und ist im Allgemeinen nicht für Rezeptorkomplexe und Membranproteine geeignet, die die Membran mehrfach überspannen.
Expressionsklonierungstechniken, bei denen eine Bibliothek komplementärer DNAs (cDNAs) in Zellen transfiziert und auf einen Gain-of-Binding-Phänotyp getestet wurde, wurden auch verwendet, um extrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren8. Die Verfügbarkeit großer Sammlungen von geklonten und sequenzierten cDNA-Expressionsplasmiden in den letzten Jahren hat Methoden erleichtert, bei denen Zelllinien, die cDNAs kodieren, zellzelloberflächenrezeptoren kodiert, auf die Bindung rekombinanter Proteine untersucht werden, um Wechselwirkungen9,10zu identifizieren. Die cDNA-Überexpressions-basierten Ansätze bieten im Gegensatz zu rekombinanten proteinbasierten Methoden die Möglichkeit, Wechselwirkungen im Kontext der Plasmamembran zu identifizieren. Der Erfolg der Verwendung von cDNA-Expressionskonstrukten hängt jedoch von der Fähigkeit der Zellen ab, das Protein in der korrekt gefalteten Form zu überexprimieren, aber dies erfordert oft zelluläre Zubehörfaktoren wie Transporter, Chaperones und korrekte oligomere Baugruppe. Die Transfikierung einer einzelnen cDNA reicht daher möglicherweise nicht aus, um eine Zelloberflächenexpression zu erreichen.
Screening-Techniken mit cDNA-Konstrukten oder rekombinanten Proteinsonden sind ressourcenintensiv und erfordern große Sammlungen von cDNA- oder rekombinanten Proteinbibliotheken. Speziell entwickelte Massenspektrometrie-basierte Methoden wurden in letzter Zeit verwendet, um extrazelluläre Interaktionen zu identifizieren, die nicht die Zusammenstellung großer Bibliotheken erfordern. Diese Techniken erfordern jedoch eine chemische Manipulation der Zelloberfläche, die die biochemische Natur der moleküle verändern kann, die auf der Oberfläche der Zellen vorhanden sind, und derzeit nur für Wechselwirkungen anwendbar sind, die durch glykosylierte Proteine vermittelt werden11,12. Die meisten der derzeit verfügbaren Methoden konzentrieren sich auch stark auf die Wechselwirkungen zwischen Proteinen, während weitgehend ignoriert den Beitrag der Membran Mikroumgebung, einschließlich Moleküle wie Glykane, Lipide, und Cholesterin.
Die jüngste Entwicklung eines hocheffizienten bialleleischen Targetings mit CRISPR-basierten Ansätzen hat es ermöglicht, genombasierte Bibliotheken von Zellen ohne definierte Gene in einem einzigen Pool zu identifizieren, die systematisch und unvoreingenommen untersucht werden können, um zelluläre Komponenten zu identifizieren, die in verschiedenen Kontexten beteiligt sind, einschließlich der Zerlegung zellulärer Signalisierungsprozesse, der Identifizierung von Störungen, die Resistenzen gegen Medikamente, Toxine und Krankheitserreger verleihen, und der Bestimmung der Spezifizität von Antikörpern13,14,, 16 ,,1616. Hier beschreiben wir einen CRISPR-basierten Knockout-Zell-Screening-Assay im Genommaßstab, der eine Alternative zu den aktuellen biochemischen Ansätzen zur Identifizierung extrazellulärer Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen bietet. Dieser Ansatz zur Identifizierung von Wechselwirkungen, die von Membranrezeptoren durch genetische Screens vermittelt werden, eignet sich besonders für Forscher, die ein konzentriertes Interesse an einzelnen Liganden haben, da sie die Notwendigkeit vermeidet, große Bibliotheken von cDNAs oder rekombinanten Proteinen zusammenzustellen.
Dieser Test besteht aus drei Hauptschritten: 1) Hochgradig aviante rekombinante Proteinbindungssonden, die aus den extrazellulären Regionen eines Rezeptors von Interesse bestehen, werden produziert und in fluoreszenzbasierten Flusszytometrie-basierten Bindungstests verwendet; 2) Die Bindungstests werden verwendet, um eine Zelllinie zu identifizieren, die den Interaktionspartner der rekombinanten Proteinsonde ausdrückt; 3) Es wird eine Cas9-exättige Version der Zelllinie erzeugt, die mit dem Protein von Interesse interagiert, und es wird ein CRISPR/Cas9-basierter Knockout-Bildschirm im Genommaßstab durchgeführt (Abbildung 1). In diesem genetischen Screen wird die Bindung eines rekombinanten Proteins an Zelllinien als messbarer Phänotyp verwendet, bei dem Zellen innerhalb der Knockout-Bibliothek, die die Fähigkeit verloren haben, die Sonde zu binden, mit fluoreszenzbasierter aktivierter Zellsortierung (FACS) und den Genen sortiert werden, die den Verlust des durch Sequenzierung identifizierten Bindungsphänotyps verursacht haben. Grundsätzlich werden die Gene identifiziert, die für den Rezeptor kodieren, der für die Bindung der Avianssonde verantwortlich ist, und die Gene, die für die Zelloberflächenanzeige erforderlich sind.
Der erste Schritt dieses Protokolls beinhaltet die Produktion von avianen rekombinanten Proteinsonden, die die Ectodomain der membrangebundenen Rezeptoren darstellen. Diese Rezeptoren sind dafür bekannt, häufig ihre extrazellulären Bindungsfunktionen zu behalten, wenn ihre Ektodomänen als rekombinantes löslichesProtein1 exprimiert werden. Für ein Protein von Interesse können lösliche rekombinante Proteine in jedem geeigneten eukaryotischen Proteinexpressionssystem in jedem Format hergestellt werden, vorausgesetzt, dass es für erhöhte Bindungsavidität oligomerisiert werden kann, und es enthält Tags, die in fluoreszenzbasierten Flusszytometrie-basierten Bindungstests verwendet werden können (z. B. FLAG-Tag, Biotin-Tag). Detaillierte Protokolle zur Herstellung von löslichen Ektodomains von Membranrezeptoren mit dem HEK293-Proteinexpressionssystem sowie verschiedene Multimerisierungstechniken und die Proteinexpressionskonstrukte für die Produktion sowohl pentamerischer Proteine als auch monomerer Proteine wurden zuvor beschrieben1,17. Das Protokoll beschreibt hier die Schritte zur Erzeugung fluoreszierender avider Sonden aus monomerer biotinylierter Proteine, indem sie zu Streptavidin konjugiert werden, das zu einem Fluorchrom konjugiert wird (z. B. Phycoerythrin oder PE), das direkt in zellbasierten Bindungstests verwendet werden kann und den Vorteil hat, dass kein sekundärer Antikörper zum Nachweis benötigt wird. Allgemeine Protokolle zur Durchführung genombezogener Screens wurden bereits20,21beschrieben, daher konzentriert sich das Protokoll hauptsächlich auf die Besonderheiten der Durchführung von Strömungszytometrie-basierten rekombinanten Proteinbindungssieben mit dem CRISPR/Cas9 Knockout Screening System mit der Human V1 ("Yusa") Bibliothek18.

<table><tbody><tr><td>Anti-Maus-Alkalische Phosphatase</td><td>Sigma</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Chem-Cruz</td><td>SC-204655</td><td></td></tr><tr><td>Blut & Zellkultur DNA Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Diethanolamin</td><td>Sigma</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blut- und Gewebekit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Seitenmagnet</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Verpackung Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX mit PLUS Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP Zellsortierer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2+-NTA Agarosekügelchen</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>OX-68 Antikörper</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>p-Nitrophenylphosphat</td><td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Entsalzungssäulen</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Röhrchen mit 5 mL Bettvolumen</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, rekombinant, PCR-Qualität</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Heißstart High-Fidelity 2&fach; Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SCFA-Filter</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Sony Zellsortierer</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI-Kügelchen (Agencourt AMPure XP Kügelchen)</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>Biolegend</td><td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung von zelloberflächenrezeptoren mit genom-scale crispr/cas9 genetic screens

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Die interzelluläre Kommunikation, die durch direkte Wechselwirkungen zwischen membraneingebetteten Zelloberflächenrezeptoren vermittelt wird, ist entscheidend für die normale Entwicklung und Funktionsweise multizellulärer Organismen. Die Erkennung dieser Wechselwirkungen bleibt jedoch technisch anspruchsvoll. Dieses Manuskript beschreibt einen systematischen CRISPR/Cas9-Knockout-Genscreening-Ansatz im Genommaßstab, der zelluläre Pfade aufzeigt, die für bestimmte Zelloberflächenerkennungsereignisse erforderlich sind. Dieser Test nutzt rekombinante Proteine, die in einem Säugetierprotein-Expressionssystem produziert werden, als aviane Bindungssonden, um Interaktionspartner in einem zellbasierten genetischen Screen zu identifizieren. Diese Methode kann verwendet werden, um die Gene zu identifizieren, die für Zelloberflächeninteraktionen notwendig sind, die von rekombinanten Bindungssonden nachgewiesen werden, die den Ektodomänen von Membran-eingebetteten Rezeptoren entsprechen. Wichtig ist, dass dieser Ansatz angesichts des genomskaligen Charakters dieses Ansatzes nicht nur den direkten Rezeptor identifiziert, sondern auch die zellulären Komponenten, die für die Darstellung des Rezeptors an der Zelloberfläche benötigt werden, und somit wertvolle Einblicke in die Biologie des Rezeptors liefert.

Dieses Manuskript beschreibt einen zellbasierten Screening-Ansatz im Genommaßstab zur Identifizierung extrazellulärer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen.

Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Die Detektion von Zelloberflächenwechselwirkungen mit derzeit verfügbaren biochemischen Ansätzen stellt noch technische Herausforderungen dar. Dieses Protokoll bietet eine genetische Alternative mit dem Genom-Skala-Zell-Screening-Ansatz, um die Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen an der Zelloberfläche zu identifizieren. Im Gegensatz zu den meisten anderen existierenden Methoden macht diese Methode keine Annahmen über die Biologie der Rezeptoren.Es bietet Möglichkeiten, die Wechselwirkungen zu identifizieren, die durch eine breite Palette von Zelloberflächenmolekülen vermittelt werden. Zelloberflächenmoleküle sind für Medikamente wie monoklonale Antikörper direkt zugänglich. Daher kann die Identifizierung von Wechselwirkungen, die durch diese Moleküle vermittelt werden, wichtige therapeutische Implikationen haben.Diese Methode ist allgemein anwendbar für Forscher, die an der Erforschung der zellulären Signal- und Erkennungsprozesse interessiert sind, in einer Vielzahl von biologischen Kontexten, einschließlich neuronaler und immunologischer Wechselwirkungen sowie Wirtspathogen-Wechselwirkungen. Das Protokoll erfordert eine Zellensortiermaschine mit hohem Durchsatz und Sequenzierungsmaschinen der nächsten Generation. Stellen Sie sicher, dass diese Funktionen verfügbar sind, bevor Sie das Protokoll starten.Beginnen Sie mit acht seriellen Verdünnungen der biotinylierten Proteinproben in einer 96-Well-Platte, die sicherstellt, dass das Endvolumen jeder Verdünnung mindestens 200 Mikroliter beträgt und eine reine Tag-Kontrolle enthalten ist. Machen Sie eine doppelte Platte der Proben, indem Sie 100 Mikroliter aus jedem Brunnen entfernen und in eine neue 96-Well-Platte übertragen. Fügen Sie eine reine Tag-Proteinsteuerung ein, die als Kontrollsonde in allen bindungden Essays verwendet wird.Fügen Sie 100 Mikroliter 0,1 Mikrogramm pro Milliliter Streptavidin-PE in die Brunnen in einer der Platten und 100 Mikroliter Verdünnungspuffer zu den Brunnen der anderen Platte hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 20 Minuten bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit die Brunnen der streptavidin kodierten Platte mit dem Verdünnungspuffer für 15 Minuten blockieren.Achten Sie nach dem Waschen darauf, dass er trocken ist. Dann übertragen Sie das Gesamtvolumen der Probe von beiden Platten auf einzelne Brunnen der Streptavidin-kodierten Platte und inkubieren Sie es für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation die Platte dreimal mit 200 Mikroliter Waschpuffer waschen.Fügen Sie 100 Mikroliter Maus Anti-Ratten-Cd4d3+4 IgG und inkubieren Sie die Platte für eine weitere Stunde. Wiederholen Sie die Wässer. 100 Mikroliter eines Anti-Maus-Alkaliphosphatase-Konjugats hinzufügen und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur lassen.Dann waschen Sie die Brunnen dreimal mit Waschpuffer und einmal mit Verdünnungspuffer. P-Nitrophenylphosphat mit einem Milligramm pro Milliliter im Farbstoff Ethanolaminpuffer vorbereiten und 100 Mikroliter zu jedem Brunnen hinzufügen. Messen Sie nach einer 15-minütigen Inkubation die Absorption samt Well bei 405 Nanometern.Verwenden Sie die minimale Verdünnung, bei der kein Signal auf der Platte als geeigneter Verdünnungsfaktor vorhanden ist, um Tetramere zu erzeugen. Inkubieren Sie Streptavidin-PE und die entsprechende biotinylierte Proteinverdünnung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Dann bewahren Konjugierte Proteine in einer lichtgeschützten Röhre bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung auf.Drehen Sie die konischen Rohre mit den behandelten und Kontrollproben bei 200 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und frieren Sie eines der Rohre bei minus 20 Grad Celsius für den späteren Gebrauch ein. Setzen Sie das Pellet in der anderen Röhre in 10 Milliliter PBS mit 1%BSA wieder auf und legen Sie 100 Mikroliter Zellen als Negativkontrolle auf einer 96-Well-Platte beiseite.Dann fügen Sie das vorkonjugierte rekombinante Protein in die Zellsuspension in der konischen Röhre und in der 96-Well-Platte hinzu. Führen Sie die Zellfärbung für mindestens eine Stunde bei vier Grad Celsius auf einem Tischrotor mit sanfter Rotation durch. Dann pellet die Zellen bei 200 mal G für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand.Nachdem Sie die Zellen zweimal gewaschen haben, setzen Sie sie in fünf Milliliter PBS wieder aus. Dehnen Sie die Zellen durch ein 30-Mikrometer-Sieb, um Zellcluster zu entfernen. Dann analysieren Sie sie mit einem Flow Sodor.Verwenden Sie die negative Kontrollprobe zum Gate für BFP-positive und PE-negative Zellen. Sortieren Sie dann die Probe und sammeln Sie 500, 000 bis 1 Million BFP-positive und PE-negative Zellen in einem 1,5 Milliliter Zentrifugationsrohr. Der wunde Käfig hängt von der Bindung der Zellen an das Protein ab, aber normalerweise werden ein bis 5% der PE-negativen Proben gesammelt.Lassen Sie nun die sortierten Zellen durch Zentrifugieren für 500 mal G für fünf Minuten, dann vorsichtig entfernen Sie den Überstand. Das Pellet kann bis zu sechs Monate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Verwenden Sie die Zählfunktion von magic, um Sequenzen aus der unsortierten und sortierten Grundgesamtheit der Referenzbibliothek zuzuordnen, die eine Rohzähldatei ergibt.Führen Sie die Testfunktion der Magie mit Rohzählungen aus der unsortierten Kontrollprobe als Kontrolle und die Anzahlen aus der sortierten Probe als Behandlung aus. Öffnen Sie die generierte Genzusammenfassungsdatei, und ordnen Sie die Spalte "Pause-Rang" in aufsteigender Reihenfolge ein. Identifizieren Sie dann Treffer mit einer falschen Erkennungsrate von weniger als Punkt 0,05.Der Rezeptor wird in der Regel sehr oft in der ersten Position gereiht. Verwenden Sie schließlich R oder eine gleichwertige Software, um den robusten Ranking-Algorithmus-Score für eine positive Auswahl darzustellen. Genomskalenkton-Knockdown-Screens zur Identifizierung des Bindungspartners menschlicher TNFSF9 und P falciparum oder H5 des menschlichen TNFSF9 und P falciparum Rh5 wurden in NCI-SNU-1 bzw. HEC-293 Zellen durchgeführt.Das Bindungsverhalten von Rh5 wurde sowohl durch Heparansulfat als auch durch seinen bekannten Rezeptor BSG beeinflusst, während TN-FRSF-9 nicht an seinen bekannten Rezeptor TN-FSF-9 gebunden wurde. Nach der Vorinkubation mit löslichem Heparin. Die GNA-Verteilung in der Steuerelement-Mutantenbibliothek zeigte, dass die Bibliothekskomplexität während des gesamten Experiments beibehalten wurde.Die technische Qualität der Screens wurde bewertet, indem die Verteilung der beobachteten Faltenveränderungen von G-RNA-Zielen untersucht wurde, die auf einen Referenzsatz nicht-essentieller Gene abzielen, verglichen mit der Verteilung für einen Referenzsatz wesentlicher Gene. Darüber hinaus ergab die Anreicherung des Signalwegniveaus, dass die erwarteten wesentlichen Pfade identifiziert und in der Abbrecherpopulation erheblich bereichert wurden. Beim Vergleich der Kontrollprobe mit der ursprünglichen Plasmidbibliothek.Der robuste Rangalgorithmus oder RRA-Score liefert ein Maß dafür, dass G-NAs konsequent höher eingestuft werden als erwartet. Auf dem Bildschirm für TNFRSF9 war tNFSF9 der Top-Hit, ein bekannter Bindungspartner. Darüber hinaus wurden eine Reihe von Genen im Zusammenhang mit dem TP53-Signalweg identifiziert.Im Falle von RH5 wurde neben dem bekannten Rezeptor und dem gen, das für die Herstellung von sulfatierten Gags benötigt wird, auch das SLC16A1-Gen identifiziert. Der Screening-Ansatz ist in der Regel sehr robust und der direkt interagierende Rezeptor sollte auf der Liste der Gene, die in dieser Reihenfolge der Bevölkerung angereichert sind, hoch eingestuft werden. Es ist wichtig, die Treffer vom Bildschirm zu validieren.Wenn die Wechselwirkung durch Proteine vermittelt wird, könnten biochemische Ansätze, die beispielsweise zur Untersuchung binärer Proteinprotein-Wechselwirkungen entwickelt wurden, für weitere Validierungsstudien verwendet werden. Aufgrund der unvoreingenommenen Genomskala dieses Ansatzes gehen wir davon aus, dass er bei der Erforschung der Wechselwirkungen helfen wird, die durch schwer zu untersuchende Zellmoleküle wie Lipide, Multipass-Membranproteine und Glykane vermittelt werden. Es kann auch neue Wege aufzeigen, die für den Rezeptorhandel und die Biologie erforderlich sind.

cell-surface-receptor-identification-using-genome-scale-crisprcas9

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die Genotypisierung hier beschriebene Technik, die Paare fluoreszierende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Kapillare ermöglicht eine Hochdurchsatz-Genotypisierung von Nuklease-vermittelte knockout-Klone. Es umgeht die von anderen Genotypisierung Techniken konfrontiert Einschränkungen und kostengünstiger als Sequenzierungsverfahren ist.

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zum Entwerfen und ausführen gemultiplexten Ausrichtung der Enhancer mit deaktivieren Fusionsproteins SID4X-dCas9-KRABBE, auch bekannt als Enhancer Störungen (Enhancer-i). Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Enhancer, die Genexpression regulieren und erleichtert das Sezieren von Beziehungen zwischen Enhancer Regulierung ein gemeinsames Zielgen.

Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Optimierung der CRISPR-Cas9 um eine höhere Spezifität verlustfrei auf-Aktivität zu erreichen. Wir verfolgen einen gerichteten Evolution genannt Sniper-Bildschirm, um einen Mutant Cas9 mit den gewünschten Eigenschaften zu finden. Sniper-Cas9 ist kompatibel mit gekürzten Single-Guide RNAs und Lieferung in einem Ribonucleoprotein Format, bekannte Strategien zur Erreichung höherer Besonderheiten.

Verwendung von Sniper-Cas9, Off-Target Auswirkungen von CRISPR-Cas9 ohne den Verlust der Zielaktivität durch gerichtete Evolution

Eine CRISPR/SgRNA-Bibliothek wurde zur Vernehmung Protein-kodierenden Gene angewandt. Die Machbarkeit einer SgRNA Bibliothek um die Funktion einer CTCF Grenze in Genregulation zu entdecken bleibt jedoch unerforscht. Hier beschreiben wir eine HOX Loci spezifische SgRNA Bibliothek um die Funktion von CTCF Grenzen in HOX Loci zu erhellen.

HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

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Isolierung subzellulärer Ribosom-Subpopulationen basierend auf rekombinanten, peptid-tag-spezifischer, ortsbeschränkter Beleuchtungsverstärkter Biotinylierung

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Durchführung eines genomweiten In-vitro-CRISPR-Knockout-Screenings in chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

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Verbesserung von CRISPR-Cas9-Bildschirmen in CAR-T-Zellen: Eine verfeinerte Methode zur Bibliotheksvorbereitung

Erfahren Sie, wie CRISPR/Cas9-Genom-Screens zur Identifizierung von Zelloberflächenrezeptor-Ligand-Interaktionen eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht unvoreingenommene Erkenntnisse für therapeutische Anwendungen.

Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

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