Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Die Detektion von Zelloberflächenwechselwirkungen mit derzeit verfügbaren biochemischen Ansätzen stellt noch technische Herausforderungen dar. Dieses Protokoll bietet eine genetische Alternative mit dem Genom-Skala-Zell-Screening-Ansatz, um die Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen an der Zelloberfläche zu identifizieren. Im Gegensatz zu den meisten anderen existierenden Methoden macht diese Methode keine Annahmen über die Biologie der Rezeptoren.

Es bietet Möglichkeiten, die Wechselwirkungen zu identifizieren, die durch eine breite Palette von Zelloberflächenmolekülen vermittelt werden. Zelloberflächenmoleküle sind für Medikamente wie monoklonale Antikörper direkt zugänglich. Daher kann die Identifizierung von Wechselwirkungen, die durch diese Moleküle vermittelt werden, wichtige therapeutische Implikationen haben.

Diese Methode ist allgemein anwendbar für Forscher, die an der Erforschung der zellulären Signal- und Erkennungsprozesse interessiert sind, in einer Vielzahl von biologischen Kontexten, einschließlich neuronaler und immunologischer Wechselwirkungen sowie Wirtspathogen-Wechselwirkungen. Das Protokoll erfordert eine Zellensortiermaschine mit hohem Durchsatz und Sequenzierungsmaschinen der nächsten Generation. Stellen Sie sicher, dass diese Funktionen verfügbar sind, bevor Sie das Protokoll starten.

Beginnen Sie mit acht seriellen Verdünnungen der biotinylierten Proteinproben in einer 96-Well-Platte, die sicherstellt, dass das Endvolumen jeder Verdünnung mindestens 200 Mikroliter beträgt und eine reine Tag-Kontrolle enthalten ist. Machen Sie eine doppelte Platte der Proben, indem Sie 100 Mikroliter aus jedem Brunnen entfernen und in eine neue 96-Well-Platte übertragen. Fügen Sie eine reine Tag-Proteinsteuerung ein, die als Kontrollsonde in allen bindungden Essays verwendet wird.

Fügen Sie 100 Mikroliter 0,1 Mikrogramm pro Milliliter Streptavidin-PE in die Brunnen in einer der Platten und 100 Mikroliter Verdünnungspuffer zu den Brunnen der anderen Platte hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 20 Minuten bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit die Brunnen der streptavidin kodierten Platte mit dem Verdünnungspuffer für 15 Minuten blockieren.

Achten Sie nach dem Waschen darauf, dass er trocken ist. Dann übertragen Sie das Gesamtvolumen der Probe von beiden Platten auf einzelne Brunnen der Streptavidin-kodierten Platte und inkubieren Sie es für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation die Platte dreimal mit 200 Mikroliter Waschpuffer waschen.

Fügen Sie 100 Mikroliter Maus Anti-Ratten-Cd4d3+4 IgG und inkubieren Sie die Platte für eine weitere Stunde. Wiederholen Sie die Wässer. 100 Mikroliter eines Anti-Maus-Alkaliphosphatase-Konjugats hinzufügen und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur lassen.

Dann waschen Sie die Brunnen dreimal mit Waschpuffer und einmal mit Verdünnungspuffer. P-Nitrophenylphosphat mit einem Milligramm pro Milliliter im Farbstoff Ethanolaminpuffer vorbereiten und 100 Mikroliter zu jedem Brunnen hinzufügen. Messen Sie nach einer 15-minütigen Inkubation die Absorption samt Well bei 405 Nanometern.

Verwenden Sie die minimale Verdünnung, bei der kein Signal auf der Platte als geeigneter Verdünnungsfaktor vorhanden ist, um Tetramere zu erzeugen. Inkubieren Sie Streptavidin-PE und die entsprechende biotinylierte Proteinverdünnung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Dann bewahren Konjugierte Proteine in einer lichtgeschützten Röhre bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung auf.

Drehen Sie die konischen Rohre mit den behandelten und Kontrollproben bei 200 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und frieren Sie eines der Rohre bei minus 20 Grad Celsius für den späteren Gebrauch ein. Setzen Sie das Pellet in der anderen Röhre in 10 Milliliter PBS mit 1%BSA wieder auf und legen Sie 100 Mikroliter Zellen als Negativkontrolle auf einer 96-Well-Platte beiseite.

Dann fügen Sie das vorkonjugierte rekombinante Protein in die Zellsuspension in der konischen Röhre und in der 96-Well-Platte hinzu. Führen Sie die Zellfärbung für mindestens eine Stunde bei vier Grad Celsius auf einem Tischrotor mit sanfter Rotation durch. Dann pellet die Zellen bei 200 mal G für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand.

Nachdem Sie die Zellen zweimal gewaschen haben, setzen Sie sie in fünf Milliliter PBS wieder aus. Dehnen Sie die Zellen durch ein 30-Mikrometer-Sieb, um Zellcluster zu entfernen. Dann analysieren Sie sie mit einem Flow Sodor.

Verwenden Sie die negative Kontrollprobe zum Gate für BFP-positive und PE-negative Zellen. Sortieren Sie dann die Probe und sammeln Sie 500, 000 bis 1 Million BFP-positive und PE-negative Zellen in einem 1,5 Milliliter Zentrifugationsrohr. Der wunde Käfig hängt von der Bindung der Zellen an das Protein ab, aber normalerweise werden ein bis 5% der PE-negativen Proben gesammelt.

Lassen Sie nun die sortierten Zellen durch Zentrifugieren für 500 mal G für fünf Minuten, dann vorsichtig entfernen Sie den Überstand. Das Pellet kann bis zu sechs Monate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Verwenden Sie die Zählfunktion von magic, um Sequenzen aus der unsortierten und sortierten Grundgesamtheit der Referenzbibliothek zuzuordnen, die eine Rohzähldatei ergibt.

Führen Sie die Testfunktion der Magie mit Rohzählungen aus der unsortierten Kontrollprobe als Kontrolle und die Anzahlen aus der sortierten Probe als Behandlung aus. Öffnen Sie die generierte Genzusammenfassungsdatei, und ordnen Sie die Spalte "Pause-Rang" in aufsteigender Reihenfolge ein. Identifizieren Sie dann Treffer mit einer falschen Erkennungsrate von weniger als Punkt 0,05.

Der Rezeptor wird in der Regel sehr oft in der ersten Position gereiht. Verwenden Sie schließlich R oder eine gleichwertige Software, um den robusten Ranking-Algorithmus-Score für eine positive Auswahl darzustellen. Genomskalenkton-Knockdown-Screens zur Identifizierung des Bindungspartners menschlicher TNFSF9 und P falciparum oder H5 des menschlichen TNFSF9 und P falciparum Rh5 wurden in NCI-SNU-1 bzw. HEC-293 Zellen durchgeführt.

Das Bindungsverhalten von Rh5 wurde sowohl durch Heparansulfat als auch durch seinen bekannten Rezeptor BSG beeinflusst, während TN-FRSF-9 nicht an seinen bekannten Rezeptor TN-FSF-9 gebunden wurde. Nach der Vorinkubation mit löslichem Heparin. Die GNA-Verteilung in der Steuerelement-Mutantenbibliothek zeigte, dass die Bibliothekskomplexität während des gesamten Experiments beibehalten wurde.

Die technische Qualität der Screens wurde bewertet, indem die Verteilung der beobachteten Faltenveränderungen von G-RNA-Zielen untersucht wurde, die auf einen Referenzsatz nicht-essentieller Gene abzielen, verglichen mit der Verteilung für einen Referenzsatz wesentlicher Gene. Darüber hinaus ergab die Anreicherung des Signalwegniveaus, dass die erwarteten wesentlichen Pfade identifiziert und in der Abbrecherpopulation erheblich bereichert wurden. Beim Vergleich der Kontrollprobe mit der ursprünglichen Plasmidbibliothek.

Der robuste Rangalgorithmus oder RRA-Score liefert ein Maß dafür, dass G-NAs konsequent höher eingestuft werden als erwartet. Auf dem Bildschirm für TNFRSF9 war tNFSF9 der Top-Hit, ein bekannter Bindungspartner. Darüber hinaus wurden eine Reihe von Genen im Zusammenhang mit dem TP53-Signalweg identifiziert.

Im Falle von RH5 wurde neben dem bekannten Rezeptor und dem gen, das für die Herstellung von sulfatierten Gags benötigt wird, auch das SLC16A1-Gen identifiziert. Der Screening-Ansatz ist in der Regel sehr robust und der direkt interagierende Rezeptor sollte auf der Liste der Gene, die in dieser Reihenfolge der Bevölkerung angereichert sind, hoch eingestuft werden. Es ist wichtig, die Treffer vom Bildschirm zu validieren.

Wenn die Wechselwirkung durch Proteine vermittelt wird, könnten biochemische Ansätze, die beispielsweise zur Untersuchung binärer Proteinprotein-Wechselwirkungen entwickelt wurden, für weitere Validierungsstudien verwendet werden. Aufgrund der unvoreingenommenen Genomskala dieses Ansatzes gehen wir davon aus, dass er bei der Erforschung der Wechselwirkungen helfen wird, die durch schwer zu untersuchende Zellmoleküle wie Lipide, Multipass-Membranproteine und Glykane vermittelt werden. Es kann auch neue Wege aufzeigen, die für den Rezeptorhandel und die Biologie erforderlich sind.