Name: Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Färbemethode für die multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeschnitten. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Detektion und Ko-Lokalisierung mehrerer Biomarker in einer Kryosektion.

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Die Anleitung zur Bildgebung und Analyse wurde vom Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core an der University of Illinois at Chicago mit Unterstützung des Büros des Vizekanzlers für Forschung bereitgestellt. Die Arbeit wurde von NIH/NCI RO1CA191317 an CLP, von NIH/NIAMS (SBDRC Grant 1P30AR075049-01) an Dr. A. Paller und mit Unterstützung des Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center an den Immunotherapy Assessment Core an der Northwestern University unterstützt.

Mausmilz und HLF16 Maustumorgewebe23 wurden aus unserem Labor gewonnen. Menschliches Mandelgewebe wurde von einem kommerziellen Anbieter gekauft. Einzelheiten finden Sie in der Tabelle der Materialien.
1. Gewebeeinbettung
<ol><li>Einbetten von frischem Gewebe in OCT (optimale Schnitttemperatur) Lösung und Schnappgefrieren mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Gewebe bei -80 °C lagern.</li>
</ol>2. Kryosektion
<ol><li>Schneiden Sie die Abschnitte in einem Kryostat mit Temperaturen von -25 °C. HINWEIS: Die bevorzugte Schnittdicke kann angepasst werden, um gestochen scharfe Bilder zu erzeugen.</li>
	<li>Platzieren Sie Abschnitte auf geladenen Glasgletten.</li>
	<li>Die Abschnitte für 1 h bei Raumtemperatur (RT) vor der Fixierung in der Histologie für eiskaltes Aceton für 10 min. HINWEIS: Aceton verursacht die Gerinnung von wasserlöslichen Proteinen und extrahiert Lipide, wirkt sich aber nicht auf kohlenhydrathaltige Bestandteile aus. Im Gegensatz dazu, formalin konserviert die meisten Lipide und hat wenig Einfluss auf Kohlenhydrate24. Die Wahl des Fixativs ist wichtig, abhängig von der Wahl des Markers, der erkannt wird.</li>
	<li>Bewahren Sie die Dias bei -20 °C auf.</li>
</ol>3. Auswahl von Antikörpern und Fluorophoren
HINWEIS: Vor der Gewebefärbung müssen Antikörperklone validiert werden, die ihre Antigene, die sie interessieren, innerhalb sequenzieller Abschnitte aus acetonfestem Gewebe robust und gezielt färben. Einige Antikörper können eine andere Fixierung erfordern, und ihre Kompatibilität mit anderen Antikörpern im Panel muss ebenfalls empirisch bestimmt werden. Das Ziel ist auch, Fluorophore mit minimalen Überlappungen zu identifizieren, die mit den Epifluoreszenzfiltern für DAPI, FITC, Cy3, Texas Red und Cy5 nachgewiesen werden können.
<ol><li>Bestätigen Sie die Färbung durch konventionellen IHC- oder Immunfluoreszenz-Nachweis (IF) in Gewebeabschnitten mit bekanntem Expressionszielantigen.</li>
	<li>Bereiten Sie mit den am halbautomatischen Bildgebungssystem verfügbaren Anregungs- und Emissionsfiltersätzen und nach dem Testen verschiedener Kombinationen fluorophorkonjugierter Primärantikörper Fluorophore vor, die minimale spektrale Überlappung haben (siehe Tabelle 1).</li>
</ol>4. Färbung
HINWEIS: Die Geweberehydratation und Diawaschachen wurden in einem Coplin-Glas durchgeführt. Die Blockier- und Antikörperinkubationsschritte wurden in einer befeuchteten Diabox durchgeführt.
<ol><li>Lassen Sie die Dias für 5-10 min auf RT erwärmen.</li>
	<li>Rehydrat in Phosphat gepufferter Saline (PBS) für 5 min.</li>
	<li>Führen Sie einen Blockierungsschritt vor der Färbung von Geweben mit Antikörpern durch. Verwenden Sie für Mausabschnitte eine spezielle Blockierlösung (siehe Materialtabelle) für 10 min bei RT. Für menschliche Abschnitte verwenden Sie 10% normales gepooltes menschliches Serum (NHS), das in PBS für 15 min bei RT verdünnt wird. HINWEIS: Je nach den zu verwendenden Folgeverfahren können bei Bedarf verschiedene Blockierpuffer getestet werden, um die spezifischen Eigenschaften der Abschnitte beizubehalten.</li>
	<li>Waschen Sie die Dias für 5 min in PBS nach der Blockierung.</li>
	<li>Für Multiplex-Färbung, bereiten Sie einen Cocktail von Antikörpern mit kompatiblen Fluorophoren bei vorgegebenen optimalen Verdünnungen.</li>
	<li>Fügen Sie den Cocktail von fluorophor-konjugierten Antikörpern zu den Dias hinzu. Für die Einmarkerfärbung nur den primär konjugierten Antikörper zum Dia hinzufügen.</li>
	<li>Schließen Sie eine Kontrollrutsche ein, die dem gleichen Färbeverfahren unterzogen wird, ohne dass ein primär konjugierter Antikörper zufügnet.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Dias für 1 h bei RT im Dunkeln und waschen Sie dann die Dias 2x mit PBS für jeweils 5 min. Von hier aus wird die resultierende Folie als Multiplex-befleckt bezeichnet.</li>
	<li>Um der Folie entgegenzuwirken, fügen Sie DAPI dem Multiplex-befleckten Dia hinzu, brüten Sie 7 min im Dunkeln bei RT und waschen Sie die Dias 2x mit PBS für jeweils 5 min. Nicht eingefärbte und ungefärbte Dias gegenstainen.</li>
	<li>Um den Deckel abzudecken, fügen Sie einen Tropfen des Montagemediums hinzu und legen Sie den Glasdeckel vorsichtig über das Gewebe.</li>
</ol>5. Vorbereiten einer Spektralbibliothek
<ol><li>
Bildaufnahme
	<ol>
<li>Stellen Sie die Lampenleistung auf 100 % ein. Normalerweise ist die Leistung auf 10% eingestellt, da die Fluoreszenzdetektion auf FFPE-Geweben einen Signalverstärkungsschritt enthält.</li>
		<li>Beginnen Sie mit dem Öffnen der Mikroskop-Betriebssoftware (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Wählen Sie Protokoll bearbeiten und dann Neues Protokollaus.</li>
		<li>Geben Sie einen "Protokollnamen" an, und wählen Sie Fluoreszenz unter Imaging-Modusaus, und geben Sie einen "Studiennamen" an.</li>
		<li>Legen Sie die eingefärbten Dias auf die Bühne und untersuchen Sie jeden Marker in seinem entsprechenden Fluoreszenzkanal, um die Färbung zu gewährleisten. Wählen Sie einen Bereich auf dem Gewebe aus, der das stärkste Signal für den Marker ausdrückt.</li>
		<li>Passen Sie die Belichtungszeiten mit den Optionen Autofokus und Autoexpose an.</li>
		<li>Erfassen Sie Snapshots für die eingefärbten und ungefärbten Folien, und speichern Sie das Protokoll. HINWEIS: Die folgenden Schritte werden in Machine Learning-Software (siehe Tabelle der Materialien) durchgeführt, indem die einzelnen gebeizten und ungefärbten Dias verwendet werden, um bestimmte Färbungen zu überprüfen und Antikörper-Cross-Talk zu bestimmen.</li>
		<li>Laden Sie unter der Registerkarte Bibliotheken erstellen in der Software jedes einzelne Diabild, wählen Sie den entsprechenden Fluor aus, und klicken Sie auf Extrahieren. Die Software extrahiert automatisch das fluoreszenzsignal, das im Fluor ausgewählt wurde.</li>
		<li>Um die extrahierte Farbe zu speichern, klicken Sie auf Speichern im Speicher. Eine "Neue Gruppe" kann erstellt oder die extrahierte Farbe in einer vorhandenen Gruppe gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Überprüfen der Spektralbibliothek
	<ol>
<li>Überprüfen Sie für jeden Filtersatz das Fenster der Emissionsspektralkurve, das sich rechts neben dem extrahierten Bild befindet. HINWEIS: Das extrahierte Signal ist korrekt, wenn die Spektralkurve nur in den Filtersätzen beobachtet wird, in denen das Fluorophor nachgewiesen wird. Wenn eine Spektralkurve im falschen Filtersatz beobachtet wird, kann dies bedeuten, dass entweder das im Filtersatz erwartete primärsignal nicht stark genug ist, oder die Software ein anderes Signal erkennt, das zu hoch ist, möglicherweise aufgrund spektraler Überlappung. Versuchen Sie in diesem Fall zunächst, mit dem Werkzeug Verarbeitungsbereiche zeichnen Bereiche um Bereiche zu zeichnen, die den Fluoreszenzmarker und die Autofluoreszenz im Bild ausdrücken. Dies trainiert die Software, um das wahre Signal zu erkennen und alle störenden Signale zu entfernen. Wenn dies nicht funktioniert, wiederholen Sie den Färbevorgang für den eingefärbten Schlitten, um verschiedene Antikörpertitrationen zu testen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Multispektrale Bildgebung
HINWEIS: Nachdem die Spektralbibliothek erstellt und überprüft wurde, führen Sie die folgenden Schritte für die Multiplex-befleckte Folie aus.
<ol><li>
Ganzer Dia-Scan
	<ol>
<li>Passen Sie fokussieren und Belichtungszeiten auf dem Multiplex-befleckten Schlitten anpassen, wie unter Abschnitt 5.1erwähnt.
</li>
		<li>Erstellen Sie unter Folien scanneneine neue Aufgabe, und wählen Sie das oben gespeicherte Protokoll aus.</li>
		<li>Führen Sie einen ganzen Diascan auf der Multiplex-befleckten Folie durch.</li>
		<li>Öffnen Sie mit der gesamten Folienscansoftware das gesamte Diascanbild. Dieses Bild wurde nicht spektral ungemischt.</li>
		<li>Wählen Sie mit dem Stamp- oder ROI-Tool Bereiche von Interesse (ROI) für das gesamte Folienscanbild aus. Diese ROIs werden mit den belichtungszeiten in 6.1.1 gescannt, die für die spektrale Unmischung und Analyse verwendet werden.</li>
		<li>Klicken Sie auf Prozessfolie, um ROIs mit 20-facher Vergrößerung zu erwerben</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spektrales Unmixing
	<ol>
<li>Sobald die ROIs erworben wurden, laden Sie in der Machine Learning-Software unter der Registerkarte Manuelle Analyse die multiplexen gebeizten Bilder, indem Sie unter Dateiöffnen klicken.</li>
		<li>Klicken Sie im Dropdown-Menü Spektralbibliotheksquelle auf Fluors auswählen.</li>
		<li>Ein neues Fenster wird geöffnet. Wählen Sie hier die obige Spektralbibliothek oder -gruppe aus.</li>
		<li>Laden Sie das unbefleckte Folienbild. Klicken AF Sie auf das AF-Farbmarkierungssymbol oberhalb der ausgewählten Spektralbibliothek, und zeichnen Sie eine Linie oder region auf der unbefleckten Folie, um die Autofluoreszenz im Gewebe zu identifizieren.</li>
		<li>Weisen Sie auf der Registerkarte Marker und Farben bearbeiten Namen für jede Markierung zu. In diesem Schritt können Pseudofarben zugewiesen werden. HINWEIS: Die Farbe für das Autofluoreszenzbild ist standardmäßig DarkSlateGray. Ändern Sie dies in Schwarz.</li>
		<li>Klicken Sie auf Alle vorbereiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Überprüfen spektral ungemischter Bilder HINWEIS: Wenn der Spektral-Unmixing-Schritt abgeschlossen ist, wird ein zusammengesetztes Bild erstellt, das aus allen Farben besteht.<ol>
<li>Klicken Sie auf das Symbol "Auge bearbeiten". Hier kann jede Farbe im "Komponentendisplay" ausgeschaltet oder eingeschaltet werden, um die Färbung jedes einzelnen Markers anzuzeigen.</li>
		<li>Überprüfen Sie visuell die Färbung und die Morphologie der Zellen, um sicherzustellen, dass es keine Überlappung des Markers gibt, es sei denn, er ist biologisch relevant. Ein Pathologe kann auch helfen, die Färbung zu überprüfen. HINWEIS: Die Färbung auf dem Multiplex-Dia sollte validiert werden, indem jeweils ein Fluorophor weggelassen und das Färbemuster überprüft wird. Darüber hinaus wird die Validierung auch dazu beitragen, starke Fluorophore zu identifizieren, die in benachbarten Spektren aufgrund von Antikörper-Cross-Talk oder Durchblutung auftreten.</li>
		<li>Klicken Sie für Pathologieansichten, die Hellfeldbilder für jeden Fluoreszenzmarker simulieren, auf die Schaltfläche Komponentenbild auswählen. Wählen Sie hier einen Marker aus, um ein simuliertes Hellfeldbild anzuzeigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Analysieren von multispektralen Bildern über Zellsegmentierung und Phenotypisierung
HINWEIS: Nach der Überprüfung des spektral ungemischten Bildes kann die Zellsegmentierung mit der Machine Learning-Software durchgeführt werden, die Schritt-für-Schritt-Anleitungen liefert. Die Gewebesegmentierung wurde hier nicht durchgeführt. Wenn das Panel einen oder mehrere gewebespezifische Marker enthält und insbesondere, wenn das Gewebe chaotisch ist, sollte eine Gewebesegmentierung durchgeführt werden.
<ol><li>Wählen Sie "Zytoplasma" und "Membran" unter der Option 'Segment'. HINWEIS: "Nuclei" ist standardmäßig ausgewählt.</li>
	<li>Wählen Sie einen Marker aus dem Bedienfeld aus. Konfigurieren Sie den Marker, um entweder Kerne, Zytoplasma oder Membran zu erkennen. Beispielsweise kann DAPI ausgewählt werden, um Kerne und CD3 für die Membran zu erkennen.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Auslassungsschaltfläche ('...'), um eine Option unter "Verwenden Sie dieses Signal zu finden" auszuwählen. Beispiel: 'nuclei' für DAPI. Für die Segmentierung können mehrere Marker aus dem Bedienfeld ausgewählt werden. HINWEIS: Wählen Sie für Zytoplasma- oder Membranmarker die Option "Verwenden Sie dieses Signal, um die nukleare Segmentierung zu unterstützen".</li>
	<li>Die Software erkennt und erstellt automatisch eine Maske für den Kern, das Zytoplasma und die Membran im Bild.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass alle Zellen für die Segmentierung "maskiert" sind. Um das anzupassen, wechseln Sie zur Pathologieansicht für den in 7.3ausgewählten Marker. und verwenden Sie die Konfigurationsoptionen in der Software.</li>
	<li>Klicken Sie auf "Segment Alle", um Zellen zu segmentieren.</li>
	<li>Fahren Sie nach der Zellsegmentierung mit Phänotypisierungszellen fort. Wählen Sie in diesem Schritt die Marker aus, die für die Phänotypisierung benötigt werden, und wählen Sie manuell mindestens fünf Zellen aus, die mit dem ausgewählten Marker hell befleckt sind. Dadurch wird die Software so trainiert, dass alle Zellen, die mit dem gewählten Marker im Bild befleckt sind, automatisch erkannt werden.</li>
	<li>Es wird eine Phänotypzuordnung erstellt. Analysieren Sie, um sicherzustellen, dass die mit dem Marker befleckte Zelle korrekt phänotypisiert ist. HINWEIS: Zellphänotypisierung kann ein iterativer Prozess sein. Wenn die Software nicht in der Lage ist, die Zellen richtig zu phänotypisieren, bedeutet dies, dass das Training unzureichend oder falsch ist. In diesem Fall muss der Benutzer manuell mehr Zellen auswählen und die Software neu trainieren und diesen Schritt wiederholen, bis der Benutzer mit dem Training zufrieden ist.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Gruppe mit dem Namen "Andere" und schließen Sie Zellen ein, die für keinen der Marker befleckt sind. HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um die Software zu trainieren, um alle ungefärbten Zellen von der Phänotypisierung auszuschließen.</li>
</ol>8. Exportieren von Bildern und Analysetabellen
<ol><li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren, um das Bedienfeld "Exporteinstellungen" anzuzeigen.</li>
	<li>Klicken Sie im "Export-Verzeichnis" auf Durchsuchen, um einen Speicherort zum Exportieren der Bilder auszuwählen.</li>
	<li>Wählen Sie in den "Bildexportoptionen" das Bildausgabeformataus.</li>
	<li>Wählen Sie in der Liste "Bilder zum Exportieren" die zu exportierenden Bilder aus. "Composite image" ist das letzte pseudofarbene ungemischte Bild. "Pathology Views" sind die einzelnen simulierten Hellfeldbilder und die "Component Images (Multi-Image TIFF)" ist eine Multi-Image-TIFF-Datei mit Komponentendaten, die von Drittanbieter-Analysesoftware verwendet werden kann.</li>
	<li>Klicken Sie auf "Export for All", um die Bilder zu exportieren. HINWEIS: Tabellen aus der Analyse können in diesem Schritt auch ausgewählt und exportiert werden.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Gefrorene Gewebe wurden ausgiebig für die mIF-Bildgebung verwendet, um traditionell drei bis vier Marker31 auf einem Gewebe mit der direkten und indirekten Methode32zu erkennen. Bei der direkten Methode werden Antikörper mit fluoreszierenden Farbstoffen oder Quantenpunkten33 konjugiert, um das Gewebe zu kennzeichnen, während bei der indirekten Methode ein unkonjugierter Primärantikörper verwendet wird, um das Gewebe zu kennzeichnen, gefolgt von einem...

Jüngste Fortschritte bei mikroskopischen Bildgebungstechniken haben unser Wissen und Verständnis von biologischen Prozessen und Krankheitszuständen deutlich verbessert. Der In-situ-Nachweis von Proteinen in Geweben über die chromogene Immunhistochemie (IHC) wird routinemäßig in der Pathologie durchgeführt. Der Nachweis mehrerer Marker mit chromogener IHC-Färbung ist jedoch eine Herausforderung1 und neuere Methoden zur Verwendung von Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbeansätzen (mIF), bei denen mehrere biologische Marker auf einer einzigen Gewebeprobe gekennzeichnet sind, werden entwickelt. Der Nachweis mehrerer biologischer Marker ist nützlich, da Informationen zur Gewebearchitektur, zur räumlichen Verteilung von Zellen und zur Antigen-Co-Expression alle in einer einzigen Gewebeprobe erfasst werden2. Der Einsatz multispektraler Fluoreszenz-Bildgebungstechnologie hat den Nachweis mehrerer biologischer Marker ermöglicht. In dieser Technologie können die Fluoreszenzspektren jedes einzelnen Fluorophors durch spezifische Optik getrennt oder "ungemischt" werden, was die Detektion mehrerer Marker ohne Spektralüberlaufermöglicht 3. Multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung wird zu einem kritischen Ansatz in der Zellbiologie, präklinischen Arzneimittelentwicklung, klinischen Pathologie und Tumorimmunprofilierung4,5,6. Wichtig ist, dass die räumliche Verteilung von Immunzellen (speziell CD8-T-Zellen) als prognostischer Faktor für Patienten mit bestehenden Tumoren dienen kann7.
Verschiedene Ansätze zur Multiplexfluoreszenzfärbung wurden entwickelt und können entweder gleichzeitig oder sequenziell durchgeführt werden. Bei der gleichzeitigen Färbemethode werden alle Antikörper als Cocktail in einem einzigen Schritt zusammengefügte, um das Gewebe zu kennzeichnen. Die UltraPlex-Technologie verwendet einen Cocktail von haptenkonjugierten Primärantikörpern, gefolgt von einem Cocktail fluorophor-konjugierter antihapten sekundärer Antikörper. Die InSituPlex-Technologie8 verwendet einen Cocktail aus einzigartigen DNA-konjugierten Primärantikörpern, die dem Gewebe gleichzeitig zugesetzt werden, gefolgt von einem Amplifikationsschritt und schließlich fluorophorkonjugierten Sonden, die jede einzigartige DNA-Sequenz am primären Antikörper ergänzen. Beide Technologien ermöglichen den Nachweis von vier Markern plus 4',6-Diamino-2-Phenylindole (DAPI) für die kerntechnische Färbung. Zwei weitere Ansätze zur simultanen Multiplexfärbung basieren auf der sekundären Ionenmassenspektrometrie9. Das Hyperion Imaging System verwendet bildgebende Massenzytometrie10, um bis zu 37 Marker zu erkennen. Diese Technologie verwendet einen Cocktail aus metallkonjugierten Antikörpern, um das Gewebe zu färben, und bestimmte Bereiche des Gewebes werden durch einen Laser ablated und auf ein Massenzytometer übertragen, wo die Metallionen nachgewiesen werden. Eine weitere ähnliche Technologie ist der IONPath, der Multiplex-Ionen-Strahl-Bildgebungstechnologie11verwendet. Diese Technologie verwendet ein modifiziertes Massenspektrometrieinstrument und eine Sauerstoffionenquelle anstelle von Laser, um die metallkonjugierten Antikörper abzuschleifen. Während all diese simultanen Multiplex-Färbeansätze den Nachweis mehrerer Marker ermöglichen, sind die Kosten für die Konjugation von DNA, Hapten oder Metallen zu Antikörpern, der Gewebeverlust durch Ablation und die umfangreiche Bildverarbeitung zum Entmischen nicht zu unterschätzen. Darüber hinaus sind Kits und Färbeprotokolle derzeit nur für FFPE-Gewebe verfügbar, und die Entwicklung von kundenspezifischen Panels erfordert zusätzlichen Zeit- und Aufwand.
Die sequenzielle Multiplex-Färbungsmethode hingegen umfasst die Kennzeichnung des Gewebes mit einem Antikörper auf einen Marker,, um den Antikörper zu entfernen, gefolgt von sequenziellen Wiederholungen dieses Prozesses, um mehrere Marker12zu beschriften. Die Tyramidsignalverstärkung (TSA) ist die am häufigsten verwendete sequenzielle Multiplexing-Methode. Zwei weitere Multiplexing-Technologien verwenden eine Kombination aus simultanen und sequentiellen Färbemethoden. Die CODEX-Plattform13 verwendet einen Cocktail von Antikörpern, die zu einzigartigen DNA-Oligonukleotidsequenzen konjugiert sind, die schließlich mit einem Fluorophor mit einem indizierten Polymerisationsschritt gekennzeichnet werden, gefolgt von Bildgebung, Abisolieren und Wiederholen des Prozesses, um bis zu 50 Marker zu erkennen. Der MultiOmyx Multiplex-Färbungsansatz14 ist eine Iteration der Färbung mit einem Cocktail von drei bis vier fluorophorkonjugierten Antikörpern, bildgebend, das Abschrecken der Fluorophore und die Wiederholung dieses Zyklus, um bis zu 60 Marker auf einem einzigen Abschnitt zu erkennen. Ähnlich wie bei der gleichzeitigen Multiplex-Färbungsmethode, während eine breite Palette von Markern erkannt werden kann, ist die Zeit, die mit Färbung, Bildaufnahme, Verarbeitung und Analyse verbunden ist, umfangreich. Der Stripping/Quenching-Schritt beinhaltet das Erhitzen und/oder Bleichen der Gewebeprobe und somit wird der sequenzielle Multiplex-Färbungsansatz häufig an FFPE-Geweben durchgeführt, die die Gewebeintegrität beim Erhitzen oder Bleichen erhalten.
Formalin Fixierung und nachfolgende Paraffin-Einbettung wird leicht in einer klinischen Umgebung durchgeführt, Gewebeblöcke sind einfach zu lagern, und mehrere Multiplex-Färbung Protokolle sind verfügbar. Die Verarbeitung, Einbettung und Deparaffinisierung von FFPE-Geweben sowie Antigenabruf15, ein Prozess, bei dem Antikörper besser auf Epitope zugreifen können, ist jedoch zeitaufwändig. Darüber hinaus trägt die Verarbeitung in FFPE-Geweben zur Autofluoreszenz16 bei und maskiert Zielepitope, was zu der Variabilität und dem Mangel an Antikörperklon führt, die zum Nachweis von Antigenen in FFPE-Geweben17,18,19zur Verfügung stehen. Ein Beispiel ist die menschliche Leukozytenantigen (HLA) Klasse I Allele20. Im Gegensatz dazu beinhaltet das Einfrieren von Geweben keine umfangreichen Verarbeitungsschritte vor oder nach der Fixierung, wodurch die Notwendigkeit eines Antigenabrufs21,22umgangen wird und es für die Erkennung einer breiteren Palette von Zielen von Vorteil ist. Daher kann die Verwendung von gefrorenem Gewebe für die multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung wertvoll sein, um Ziele für präklinische und klinische Studien zu detektieren.
Angesichts der oben genannten Einschränkungen bei der Verwendung von FFPE-Geweben haben wir gefragt, ob multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung an gefrorenen Geweben durchgeführt werden kann. Um diese Frage zu beantworten, testeten wir eine simultane Multiplex-Färbungsmethode mit einem Panel von fluorophorkonjugierten Antikörpern, um mehrere Antigene zu erkennen, und analysierten die Färbung mit einem semiautomatisierten multispektralen Bildgebungssystem. Wir konnten innerhalb von 90 min bis zu sechs Marker in einem einzigen Gewebeabschnitt färben.

<table><tbody><tr><td>Aceton (histologische Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16F-1GAL</td><td>Fixiergewebe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Maus</td><td>CD3 BioLegend 100212</td><td></td><td>Klon - 17A2; primärer konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, eBioscience anti-humaner CD20</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>53-0202-82</td><td>Klon - L26; primärer konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Maus anti-Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>558617</td><td>Primärer konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anti-Human-CD3</td><td>BioLegend</td><td>300446-Klon</td><td>- UCHT1; primärer konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anti-Maus-CD8a</td><td>BioLegend 100758</td><td></td><td>Klon - 53-6.7; Primärer konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Human-CD8a</td><td>BioLegend 372906</td><td></td><td>Klon - C8/144B; primärer konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Maus CD206 (MMR)</td><td>BioLegend</td><td>141711</td><td>Klon - C068C2; primärer konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Maus CD4 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>100426</td><td>Klon - GK1.5; primärer konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>C57BL/6 Maus</td> Charles <td>River Laboratories</td><td>27</td><td>Gefrorenes Mausgewebe für das multispektrale Training</td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6016-6EA</td><td>Rehydrieren und Waschen von Objektträgern</td></tr><tr><td>DAPI Solution</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>Nukleinsäurefleck</td></tr><tr><td>Diamond White Glass Charged Slides</td><td>DOT Scientific</td><td>DW7590W</td><td>Anhaftende Gewebeschnitte</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung 1x (ohne Ca und Mg)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21031CV</td><td>Wasch- und Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>Gold Seal Cover Slips</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3306</td><td>Schutz von gefärbtem Gewebe</td></tr><tr><td>Menschliche normale Mandeln OCT gefrorener Gewebeblock</td><td>AMSBio</td><td>AMS6023</td><td>Menschliches gefrorenes Gewebe für die multispektrale Färbung</td></tr><tr><td>Menschliches Serum 1x</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-512</td><td>Blockierungs- und Verdünnungsmittel für menschliches Gewebe</td></tr><tr><td>inForm</td><td>Akoya Biosciences</td><td>Version 2.4.1</td><td>Software für maschinelles Lernen</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanin5.5 Anti-Human-CD4</td><td>BioLegend</td><td>300529</td><td>Klon - RPA-T4; primärer konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>PerCP-Cy 5.5 Ratte Anti-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Klon - M1/70; primärer konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>Phänochart</td><td>Akoya Biosciences</td><td>Version 1.0.8</td><td>Software für den gesamten Objektträger</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Eindeckmittel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36965</td><td>Eindeckmedium</td></tr><tr><td>Forschung Kryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Gewebe</td></tr><tr><td>schneiden Superblock 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37515</td><td>Blockieren von Mausgewebe</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T Lösung</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Einbetten von Geweben</td></tr><tr><td>Vectra 3.0 Automatisiertes quantitatives Bildgebungssystem für die Pathologie, 6 Objektträger</td><td>Akoya Biosciences</td><td>CLS142568</td><td>Halbautomatische multispektrale Bildgebung System</td></tr><tr><td>Vectra Software</td><td>Akoya Biosciences</td><td>Version 3.0.5</td><td>Software zum Bedienen des Mikroskops</td></tr></tbody></table>

eine schnelle methode zur multispektralen fluoreszenz-bildgebung von tiefgefrorenen gewebeabschnitten

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung auf formalinfixiertem Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Gewebe ermöglicht den Nachweis mehrerer Marker in einer einzigen Gewebeprobe, die Informationen über Antigenkoexpression und räumliche Verteilung der Marker liefern können. Ein Mangel an geeigneten Antikörpern für formalfixierte Gewebe kann jedoch die Art der Marker einschränken, die nachgewiesen werden können. Darüber hinaus ist die Färbemethode zeitaufwändig. Hier beschreiben wir eine schnelle Methode zur Multispektralfluoreszenz-Bildgebung an gefrorenen Geweben. Die Methode umfasst die verwendeten Fluorophorkombinationen, detaillierte Schritte zur Färbung von Maus- und menschlichen gefrorenen Geweben sowie die Scan-, Erfassungs- und Analyseverfahren. Für die Färbeanalyse wird ein handelsübliches multispektrales Fluoreszenz-Bildgebungssystem eingesetzt. Durch diese Methode wurden bis zu sechs verschiedene Marker in einem einzigen gefrorenen Gewebeabschnitt gebeizt und nachgewiesen. Die Machine Learning-Analysesoftware kann Zellen phänotypieren, die für die quantitative Analyse verwendet werden können. Die hier beschriebene Methode für gefrorene Gewebe ist nützlich für den Nachweis von Markern, die in FFPE-Geweben nicht nachgewiesen werden können oder für die Antikörper für FFPE-Gewebe nicht verfügbar sind.

Nachweis von einscheinigten Markern auf gefrorenen Milzabschnitten Da das halbautomatische Bildgebungssystem ein Flüssigkristall-Tunable-Filter-System (LCTF) verwendet, das einen größeren Bereich der Wellenlängendetektion25ermöglicht und hier keine Signalverstärkungsschritte durchgeführt wurden, haben wir zunächst die Detektion unserer primär konjugierten Antikörper für jeden Marker auf dem Mikroskop optimiert. Ein Beispiel ist in Abbildung 1darges...

Wir beschreiben eine schnelle Färbemethode zur multispektralen Bildgebung an gefrorenen Geweben.

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Diese Methode ist hilfreich, um mehrere Biomarker in einem einzigen Kryoabschnitt zu erkennen und gemeinsam zu lokalisieren, einschließlich Markern, die normalerweise in Paraffinabschnitten nicht nachweisbar sind. Mit dieser experimentellen Färbemethode wird die Färbezeit deutlich reduziert und das Verfahren kann in jedem Labor durchgeführt werden. Demonstriert diese Methode wird Dinesh Jaishankar sein.Er ist ein erfahrener Postdoc aus dem Labor, und auch der Immunotherapy Assessment Core, Facility Manager. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl von Antikörpern für die Analyse die Auffgungs- und Emissionsfiltersätze, die auf dem halbautomatischen Bildgebungssystem verfügbar sind. Und nach dem Testen verschiedener Kombinationen von fluorophor konjugierten Primärantikörpern bereiten Sie Fluorophore so vor, dass Sie eine minimale spektrale Überlappung haben, wie in der Tabelle vorgeschlagen.Für Multiplex-Färbung, bereiten Sie einen Cocktail von Antikörpern mit kompatiblen Fluorophoren bei vorgegebenen optimalen Wahnvorstellungen, und fügen Sie den Cocktail zu den Gewebeabschnitten von Interesse. Für die Einzelmarkerfärbung fügen Sie den primären konjugierten Antikörper nur dem Dia hinzu. Für alle Färbungen, enthalten eine Kontrolle ungefärbt Dia, die die gleiche Färbung Verfahren ohne die Zugabe eines primären konjugierten Antikörper unterzogen wird.Nach einer einstündigen Inkubation bei Lichtschutz bei Raumtemperatur die Dias zwei Mal mit PBS für fünf Minuten pro Waschgang waschen. Nach der zweiten Wäsche, Gegenfärbung der Multiplex-Buntschlitten mit DAPI für sieben Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt, gefolgt von zwei fünfminütigen Wäschen in PBS. Um eine Spektralbibliothek zu erstellen, stellen Sie die Lampenleistung des multispektralen Bildgebungssystems auf 100 % ein und öffnen Sie die Betriebssystemsoftware des Mikroskops.Wählen Sie Protokoll bearbeiten und neues Protokoll aus. Geben Sie einen Protokollnamen ein, und wählen Sie Fluoreszenz im Bildverarbeitungsmodus aus. Geben Sie dann einen Studiennamen an, und laden Sie die einzelnen gebeizten Dias auf die Bühne.Klicken Sie auf Belichtung bearbeiten, und verwenden Sie die Optionen für den automatischen Fokus und die automatische Belichtung, um die Belichtungszeiten anzupassen und Snapshots für die einzelnen gebeizten Folien zu erfassen. Speichern Sie nach der Abbildung der einzelnen gebeizten Dias das Protokoll. Und laden Sie in der Machine Learning-Software unter der Registerkarte Build Library jedes einzelne gebeizte Bild.Wählen Sie die entsprechende Etage aus, und klicken Sie auf Extrahieren. Die Software extrahiert automatisch das im Boden ausgewählte Fluoreszenzsignal. Um die extrahierte Farbe zu speichern, klicken Sie auf Speichern, um sie zu speichern.Eine neue Gruppe kann erstellt oder die extrahierte Farbe in einer vorhandenen Gruppe gespeichert werden. Passen Sie für die multispektrale Bildgebung nach der Erstellung und Überprüfung der Spektralbibliothek den Fokus und die Belichtungszeiten auf dem Multiplex-Buntdia wie gezeigt an und öffnen gescannte Dias, um eine neue Aufgabe zu erstellen. Geben Sie eine Folien-ID an, und wählen Sie ein Protokoll aus.Wählen Sie unter Aufgabe den gesamten Folienscan aus, um einen ganzen Diascan auf der Multiplex-Buntfolie durchzuführen. Wählen Sie im gesamten Folienscanbild Bereiche aus, die für das gesamte Bild von Interesse sind. Diese Bereiche werden mit den zuvor festgelegten Belichtungszeiten auf dem Multiplex-Dia gescannt, die für die spektrale Unmischung und Analyse verwendet werden sollen.Wählen Sie in der Mikroskop-Betriebssystemsoftware MSI-Felder unter Aufgabe aus, und klicken Sie dann auf Prozessfolie, um Interessenbereiche mit einer 20-fachen Vergrößerung zu erfassen. Sobald die Bereiche von Interesse erworben wurden, klicken Sie in der Machine Learning-Software unter der Registerkarte manuelle Analyse auf Datei und Öffnen, um die multiplexen gebeizten Bilder zu laden. Wählen Sie die Spektralbibliotheksquelle aus, und klicken Sie auf Flächen auswählen, um die zuvor gespeicherte Spektralbibliothek auszuwählen.Klicken Sie auf Datei und Öffnen, um das unbefleckte Bild zu laden. Klicken Sie dann auf das Symbol für die Autofluoreszenz-Farbmarkierung, und zeichnen Sie eine Linie oder einen Bereich auf der ungefleckten Folie, um die Autofluoreszenz im Gewebe zu identifizieren. Weisen Sie dann unter der Registerkarte Marker und Farben bearbeiten Namen für jeden Marker zu, und klicken Sie auf Alle vorbereiten.Nachdem Sie das spektral ungemischte Bild überprüft haben, wählen Sie in der Machine Learning-Software die Zytoplasmamembran- und Markeroptionen aus dem Panel aus. Und wählen Sie mit der Auslassungstaste dieses Signal aus, um den Marker zu finden, um entweder die Kerne, das Zytoplasma oder die Membran zu erkennen. Wenn ein Zytoplasma- oder Membranmarker ausgewählt ist, wählen Sie die Option Signal verwenden, um die Kernspaltungsoption zu unterstützen.Die Software erkennt und erstellt automatisch individuelle Masken für Den Kern, das Zytoplasma und die Membran. Verwenden Sie die Pathologieansicht für einen bestimmten Marker und die Konfigurationsoptionen in der Software, um die Masken anzupassen, und klicken Sie auf Segment Alle, um eine Zellsegmentierungszuordnung zu erstellen. Wählen Sie nach der Zellsegmentierung die Marker aus, um die positiven Zellen zu phäphieren.Wählen Sie außerdem mindestens fünf Zellen aus, die nicht mit dem ausgewählten Marker befleckt sind, um die negativen Zellen zu phänotypieren. Klicken Sie dann auf Klassifier trainieren, um die Software zu trainieren, um automatisch alle Zellen zu erkennen, die mit den ausgewählten Markern im Bild befleckt sind. Es wird eine Phänotypkarte erstellt.Wie diese Bilder zeigen, könnten Antikörper, die für die Durchflusszytometrie validiert wurden, verwendet werden, um Gewebefärbung mit dem Flüssigkristall-Abstimmfilter im halbautomatischen Bildgebungssystem zu visualisieren. Hier kann ein spektral ungemischtes Bild von gefrorenen menschlichen Mandeln beobachtet werden, das die Kennzeichnung von B-Zellen und Proliferierenden Zellen innerhalb des follikulären Keimzentrums und der interfollikulären T-Zell-Region umfasst. Die Pathologie-Ansichtsoption ermöglicht die Visualisierung des einzelnen Färbemusters für jeden Marker innerhalb des Gewebes von Interesse, was darauf hindeutet, dass die Multiplex-Färbungsmethode und die spektrale Bildgebung auf gefrorenem Gewebe wirken.Wie auf einem gefrorenen Maustumorabschnitt gezeigt, kann multispektrale Bildgebung auch verwendet werden, um Tumor infiltrierende T-Zellen und andere myeloische Zelllinien einschließlich tumorassoziierter Makrophagen zu visualisieren. Zellsegmentierung und Phänotypkarten sowie die Anzahl der von der Software analysierten Fleckenzellen für jeden von der Software analysierten Marker können generiert werden, was zeigt, dass die Software für die Quantifizierung der multispektralen Färbung auf gefrorenen Geweben verwendet werden kann. Für jemanden, der die Technik neu hat, ist es wichtig, die spezifischen Merkmale Ihrer Fluorchrome kennen zu lernen und Qualitätsbibliotheksdias für das spektrale Unmixen mit minimaler spektraler Überlappung vorzubereiten.Es ist auch wichtig, Antikörper-Titration durchzuführen. Unserer Meinung nach kann diese Methode am Krankenbett Informationen über die Wirksamkeit der Immuntherapie bei Krebs und anderen therapeutischen Anwendungen liefern, insbesondere wenn Timing von entscheidender Bedeutung ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Bild fluoreszenzmarkierten Zellen in semi-dicken Hirnschnitten. Durch die Fixierung, Schneiden und optisch Clearing Hirngewebe beschreiben wir, wie Standard-epifluoreszenten oder konfokale Bildgebung verwendet werden, um einzelne Zellen und neuronalen Netzwerken im intakten Nervengewebe zu visualisieren.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

Dieses Video beschreibt das Verfahren zum Einfrieren von Muskelgewebe und zum Gewinnen seiner Dünnschnitte. Die Technik kann helfen, krebsbedingte Kachexie in Darmkrebs-Mausmodellen zu untersuchen.

Snap Freezing von Muskelgewebe für das Schneiden: Ein Protokoll zur Gewinnung ultradünner Schnitte von schnell eingefrorenem Mausmuskelgewebe

Die in diesem Artikel beschriebene indirekte Immunofluoreszenz-Protokoll ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen in der Milchdrüse der Maus. Eine vollständige Verfahren wird gegeben, um Brustdrüsenproben herzustellen, um die Immunhistochemie die Gewebeschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie durchführen, um Bild und um Bilder zu rekonstruieren.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

In diesem Manuskript stellen wir eine halbautomatische Kryohistologie-Plattform mit hohem Durchsatz vor, um ausgerichtete Kompositbilder von Mehrfachreaktionsmessungen aus mehreren Runden der Fluoreszenzbildgebung an gefrorenen Schnitten mineralisierter Gewebe zu erstellen.

Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology von mineralisiertem Gewebe

Die Free-Floating-Technik ermöglicht es Forschern, histologisch basierte Färbungen einschließlich Immunhistochemie an festen Gewebeschnitten durchzuführen, um biologische Strukturen, Zelltypen sowie Proteinexpression und -lokalisation sichtbar zu machen. Dies ist eine effiziente und zuverlässige histochemische Technik, die für die Untersuchung einer Vielzahl von Geweben wie Gehirn, Herz und Leber nützlich sein kann.

Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) sowohl in frisch gefrorenen als auch in fixierten Maus-Hirnschnitten, mit dem Ziel, Multilabel-FISH und Fluoreszenz-IHC-Signal zu erreichen. IHC zielte auf zytoplasmatische und membrangebundene Proteine ab.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Hier zeigen wir, wie man das Sandwich-Gefriergerät zum schnellen Einfrieren von biologischen Proben verwendet, einschließlich Bakterien, Hefen, kultivierten Zellen, isolierten Zellen, tierischem und menschlichem Gewebe und Viren. Wir zeigen auch, wie man Proben für ultradünne Schnitte nach schnellem Einfrieren vorbereitet.

Schnelles Einfrieren mit Sandwich-Gefriergerät zur guten ultrastrukturellen Konservierung biologischer Proben in der Elektronenmikroskopie

Wir haben eine Gewebeverarbeitungstechnik entwickelt, bei der ein Vibratom und in Agarose eingebettetes Lungengewebe verwendet werden, um Lungenschnitte zu erzeugen, wodurch hochauflösende Bilder der Lungenarchitektur aufgenommen werden können. Wir verwendeten Immunfluoreszenzfärbung, um die räumliche Proteinexpression anhand spezifischer Lungenstrukturmarker zu beobachten.

Automatisierter Vibratomschnitt von Agarose-eingebettetem Lungengewebe für die Multiplex-Fluoreszenzbildgebung

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von &lt; 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baut auf der Basis-IBEX-Technik auf, indem es Heparin-Blocking hinzufügt, um unspezifische Bindungen zu minimieren, und die spektrale Detektion mit computergestützter Entmischung nutzt, um die Autofluoreszenz zu unterdrücken. Dieser Ansatz beschleunigt die Bildaufnahme bei gleichzeitiger Reduzierung von Hintergrundquellen und ermöglicht robuste mehrstufige räumliche Proteomanalysen mit hohen Parametern.

High-Plex-Bildgebung mittels spektral-konfokaler Mikroskopie zur Minimierung unspezifischer Gewebefluoreszenz

Erfahren Sie eine schnelle Färbemethode für die multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeschnitten. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Detektion und Ko-Lokalisierung mehrerer Biomarker in einer Kryosektion.

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

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