Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Diese Methode ist hilfreich, um mehrere Biomarker in einem einzigen Kryoabschnitt zu erkennen und gemeinsam zu lokalisieren, einschließlich Markern, die normalerweise in Paraffinabschnitten nicht nachweisbar sind. Mit dieser experimentellen Färbemethode wird die Färbezeit deutlich reduziert und das Verfahren kann in jedem Labor durchgeführt werden. Demonstriert diese Methode wird Dinesh Jaishankar sein.

Er ist ein erfahrener Postdoc aus dem Labor, und auch der Immunotherapy Assessment Core, Facility Manager. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl von Antikörpern für die Analyse die Auffgungs- und Emissionsfiltersätze, die auf dem halbautomatischen Bildgebungssystem verfügbar sind. Und nach dem Testen verschiedener Kombinationen von fluorophor konjugierten Primärantikörpern bereiten Sie Fluorophore so vor, dass Sie eine minimale spektrale Überlappung haben, wie in der Tabelle vorgeschlagen.

Für Multiplex-Färbung, bereiten Sie einen Cocktail von Antikörpern mit kompatiblen Fluorophoren bei vorgegebenen optimalen Wahnvorstellungen, und fügen Sie den Cocktail zu den Gewebeabschnitten von Interesse. Für die Einzelmarkerfärbung fügen Sie den primären konjugierten Antikörper nur dem Dia hinzu. Für alle Färbungen, enthalten eine Kontrolle ungefärbt Dia, die die gleiche Färbung Verfahren ohne die Zugabe eines primären konjugierten Antikörper unterzogen wird.

Nach einer einstündigen Inkubation bei Lichtschutz bei Raumtemperatur die Dias zwei Mal mit PBS für fünf Minuten pro Waschgang waschen. Nach der zweiten Wäsche, Gegenfärbung der Multiplex-Buntschlitten mit DAPI für sieben Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt, gefolgt von zwei fünfminütigen Wäschen in PBS. Um eine Spektralbibliothek zu erstellen, stellen Sie die Lampenleistung des multispektralen Bildgebungssystems auf 100 % ein und öffnen Sie die Betriebssystemsoftware des Mikroskops.

Wählen Sie Protokoll bearbeiten und neues Protokoll aus. Geben Sie einen Protokollnamen ein, und wählen Sie Fluoreszenz im Bildverarbeitungsmodus aus. Geben Sie dann einen Studiennamen an, und laden Sie die einzelnen gebeizten Dias auf die Bühne.

Klicken Sie auf Belichtung bearbeiten, und verwenden Sie die Optionen für den automatischen Fokus und die automatische Belichtung, um die Belichtungszeiten anzupassen und Snapshots für die einzelnen gebeizten Folien zu erfassen. Speichern Sie nach der Abbildung der einzelnen gebeizten Dias das Protokoll. Und laden Sie in der Machine Learning-Software unter der Registerkarte Build Library jedes einzelne gebeizte Bild.

Wählen Sie die entsprechende Etage aus, und klicken Sie auf Extrahieren. Die Software extrahiert automatisch das im Boden ausgewählte Fluoreszenzsignal. Um die extrahierte Farbe zu speichern, klicken Sie auf Speichern, um sie zu speichern.

Eine neue Gruppe kann erstellt oder die extrahierte Farbe in einer vorhandenen Gruppe gespeichert werden. Passen Sie für die multispektrale Bildgebung nach der Erstellung und Überprüfung der Spektralbibliothek den Fokus und die Belichtungszeiten auf dem Multiplex-Buntdia wie gezeigt an und öffnen gescannte Dias, um eine neue Aufgabe zu erstellen. Geben Sie eine Folien-ID an, und wählen Sie ein Protokoll aus.

Wählen Sie unter Aufgabe den gesamten Folienscan aus, um einen ganzen Diascan auf der Multiplex-Buntfolie durchzuführen. Wählen Sie im gesamten Folienscanbild Bereiche aus, die für das gesamte Bild von Interesse sind. Diese Bereiche werden mit den zuvor festgelegten Belichtungszeiten auf dem Multiplex-Dia gescannt, die für die spektrale Unmischung und Analyse verwendet werden sollen.

Wählen Sie in der Mikroskop-Betriebssystemsoftware MSI-Felder unter Aufgabe aus, und klicken Sie dann auf Prozessfolie, um Interessenbereiche mit einer 20-fachen Vergrößerung zu erfassen. Sobald die Bereiche von Interesse erworben wurden, klicken Sie in der Machine Learning-Software unter der Registerkarte manuelle Analyse auf Datei und Öffnen, um die multiplexen gebeizten Bilder zu laden. Wählen Sie die Spektralbibliotheksquelle aus, und klicken Sie auf Flächen auswählen, um die zuvor gespeicherte Spektralbibliothek auszuwählen.

Klicken Sie auf Datei und Öffnen, um das unbefleckte Bild zu laden. Klicken Sie dann auf das Symbol für die Autofluoreszenz-Farbmarkierung, und zeichnen Sie eine Linie oder einen Bereich auf der ungefleckten Folie, um die Autofluoreszenz im Gewebe zu identifizieren. Weisen Sie dann unter der Registerkarte Marker und Farben bearbeiten Namen für jeden Marker zu, und klicken Sie auf Alle vorbereiten.

Nachdem Sie das spektral ungemischte Bild überprüft haben, wählen Sie in der Machine Learning-Software die Zytoplasmamembran- und Markeroptionen aus dem Panel aus. Und wählen Sie mit der Auslassungstaste dieses Signal aus, um den Marker zu finden, um entweder die Kerne, das Zytoplasma oder die Membran zu erkennen. Wenn ein Zytoplasma- oder Membranmarker ausgewählt ist, wählen Sie die Option Signal verwenden, um die Kernspaltungsoption zu unterstützen.

Die Software erkennt und erstellt automatisch individuelle Masken für Den Kern, das Zytoplasma und die Membran. Verwenden Sie die Pathologieansicht für einen bestimmten Marker und die Konfigurationsoptionen in der Software, um die Masken anzupassen, und klicken Sie auf Segment Alle, um eine Zellsegmentierungszuordnung zu erstellen. Wählen Sie nach der Zellsegmentierung die Marker aus, um die positiven Zellen zu phäphieren.

Wählen Sie außerdem mindestens fünf Zellen aus, die nicht mit dem ausgewählten Marker befleckt sind, um die negativen Zellen zu phänotypieren. Klicken Sie dann auf Klassifier trainieren, um die Software zu trainieren, um automatisch alle Zellen zu erkennen, die mit den ausgewählten Markern im Bild befleckt sind. Es wird eine Phänotypkarte erstellt.

Wie diese Bilder zeigen, könnten Antikörper, die für die Durchflusszytometrie validiert wurden, verwendet werden, um Gewebefärbung mit dem Flüssigkristall-Abstimmfilter im halbautomatischen Bildgebungssystem zu visualisieren. Hier kann ein spektral ungemischtes Bild von gefrorenen menschlichen Mandeln beobachtet werden, das die Kennzeichnung von B-Zellen und Proliferierenden Zellen innerhalb des follikulären Keimzentrums und der interfollikulären T-Zell-Region umfasst. Die Pathologie-Ansichtsoption ermöglicht die Visualisierung des einzelnen Färbemusters für jeden Marker innerhalb des Gewebes von Interesse, was darauf hindeutet, dass die Multiplex-Färbungsmethode und die spektrale Bildgebung auf gefrorenem Gewebe wirken.

Wie auf einem gefrorenen Maustumorabschnitt gezeigt, kann multispektrale Bildgebung auch verwendet werden, um Tumor infiltrierende T-Zellen und andere myeloische Zelllinien einschließlich tumorassoziierter Makrophagen zu visualisieren. Zellsegmentierung und Phänotypkarten sowie die Anzahl der von der Software analysierten Fleckenzellen für jeden von der Software analysierten Marker können generiert werden, was zeigt, dass die Software für die Quantifizierung der multispektralen Färbung auf gefrorenen Geweben verwendet werden kann. Für jemanden, der die Technik neu hat, ist es wichtig, die spezifischen Merkmale Ihrer Fluorchrome kennen zu lernen und Qualitätsbibliotheksdias für das spektrale Unmixen mit minimaler spektraler Überlappung vorzubereiten.

Es ist auch wichtig, Antikörper-Titration durchzuführen. Unserer Meinung nach kann diese Methode am Krankenbett Informationen über die Wirksamkeit der Immuntherapie bei Krebs und anderen therapeutischen Anwendungen liefern, insbesondere wenn Timing von entscheidender Bedeutung ist.