Wirkung künstlicher Tränenformulierungen auf die Metabolische Aktivität menschlicher Hornhautepithelzellen nach Exposition gegenüber Dericcation
2. Mai 2020
Ziel dieses Protokolls ist es zu bewerten, ob verschiedene künstliche Tränenformulierungen menschliche Hornhautepithelzellen mit einem In-vitro-Modell vor der Austrocknung schützen können. Nach der Exposition gegenüber künstlichen Tränenformulierungen und Dericcation werden menschliche Hornhautepithelzellen auf metabolische Aktivität untersucht.
Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, in einem In-vitro-Modell zu bewerten, ob künstliche Tränenformulierungen menschliche Hornhautepithelzellen vor Austrocknung schützen können. Diese Methode kann verwendet werden, um Formulierungen für trockene Augen zu identifizieren, die den Augenschutz für Personen mit Symptomen des trockenen Auges unterstützen können. Dieser Assay verwendet ein sehr empfindliches Maß zum Nachweis der metabolischen Aktivität von Hornhautepithelzellen.
Dadurch können kleine Veränderungen der Gesundheit der Hornhautzellen durch Austrocknung festgestellt werden. Parisa Mirzapour, Nijani Nagaarudkumaran und Adeline Suko werden das Verfahren heute vorführen. Beginnen Sie mit der Züchtung immortalisierter menschlicher Hornhautepithelzellen in kollagenbeschichteten Kolben mit 20 Millilitern DMEM/F12, die 10 % fötales Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid enthalten, und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage.
Sobald die Zellen fast zusammenfließend sind, entfernen Sie das Zellkulturmedium und geben Sie vier bis sechs Milliliter Zelldissoziationsmedium in jeden Kolben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, bis sie sich lösen, und überprüfen Sie sie regelmäßig unter dem Mikroskop. Geben Sie zwei bis sechs Milliliter DMEM/F12 mit 10 % FBS in jeden Kolben und geben Sie den Inhalt in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 450 bis 500 g g. Aspirieren Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in vorgewärmten Medien. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und berechnen Sie das Volumen, das 100.000 Zellen enthält.
Geben Sie in jede Vertiefung einer 48-Well-Kulturplatte, die mit Kollagen I beschichtet ist, zusammen mit dem berechneten Zellvolumen Medien und stellen Sie sicher, dass das endgültige Volumen in jeder Vertiefung 0,5 Milliliter beträgt. Inkubieren Sie die Zellen dann 24 Stunden lang. Für das Kontrollverfahren nehmen Sie das Nährmedium aus den Vertiefungen und behandeln Sie die Zellen sofort mit 150 Mikrolitern einer Testformulierung oder einer Medienkontrolllösung.
Inkubieren Sie die Zellen dann 30 Minuten lang. Entfernen Sie die Testlösung aus den Zellen und fügen Sie 0,5 Milliliter 10%ige metabolische Farbstofflösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für weitere vier Stunden.
Entfernen Sie nach der Inkubation 100 Mikroliter Farbstofflösung aus jeder Vertiefung und geben Sie sie auf eine 96-Well-Platte. Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, um die Fluoreszenz jedes Wells zu messen, indem Sie die Anregung auf 540 Nanometer und die Emission auf 590 Nanometer einstellen. Um das Wiederherstellungsverfahren durchzuführen, inkubieren Sie die Zellen mit den Testlösungen oder Kontrollen, wie zuvor beschrieben.
Geben Sie dann 0,5 Milliliter DMEM/F12-Medien in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen 18 Stunden lang. Entfernen Sie dann das Medium und testen Sie die Stoffwechselaktivität.
Um das Kontrollverfahren durchzuführen, entfernen Sie das Nährmedium von den Zellen in der 48-Well-Platte und behandeln Sie sie sofort mit der Testformulierung oder der Kontrolllösung. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie nach der Inkubation die Testlösungen aus den Zellen und legen Sie sie fünf Minuten lang zum Austrocknen in eine Kammer mit 37 Grad Celsius und 45 % Luftfeuchtigkeit.
Fügen Sie dann 0,5 Milliliter 10%ige metabolische Farbstofflösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Übertragen Sie nach der Inkubation 100 Mikroliter der metabolischen Farbstofflösung aus jeder Vertiefung auf eine 96-Well-Platte und messen Sie die Fluoreszenz. Um das Wiederherstellungsverfahren durchzuführen, wiederholen Sie das zuvor beschriebene Protokoll und schließen Sie nach dem Austrocknungsschritt eine 18-stündige Inkubation mit DMEM/F12-Medium ein.
Führen Sie dann eine statistische Analyse der Daten durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Drei Formulierungen des trockenen Auges wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Lebensfähigkeit menschlicher Hornhautepithelzellen verglichen. Die Lösungen eins und zwei hatten einen signifikanten Einfluss auf die Stoffwechselaktivität der Zellen vor der Austrocknung.
Zellen, die Lösung eins ausgesetzt waren, zeigten nach einer 18-stündigen Erholung einen zusätzlichen Abfall der Zellstoffwechselaktivität, was bedeutet, dass sie zunächst verletzt waren und die Verletzung nicht repariert wurde. Im Vergleich dazu hatte Lösung drei nur einen milden Effekt auf die Stoffwechselaktivität der Epithelzellen. Beim Vergleich der Fähigkeit dieser lipidhaltigen Formulierungen für das trockene Auge, die Zellen zu schützen, wurde festgestellt, dass die Lösungen eins und zwei die Zellen nicht vor Austrocknungsstress schützten.
Lösung drei bot jedoch einen gewissen Schutz. Achten Sie beim Aussäen der Zellen in kollagenbeschichtete Platten darauf, dass die Zellsuspension Zellen enthält, die gleichmäßig gemischt sind, so dass jede Vertiefung mit der gleichen Zellzahl besiedelt wird. Lösung drei zeigte eine statistisch signifikante Verbesserung der Zellviabilität und des Schutzes vor Austrocknungsstress im Vergleich zu den beiden anderen lipidhaltigen Produkten.
Es ist möglich, dass Mineralöl mit Phospholipiden zusammen mit HP-Guar und Propylenglykol Lösung drei ermöglicht, um die Hydratation der Hornhautzellen zu schützen und die Verdunstung unter Austrocknung zu reduzieren.
Übersicht
Diese Studie bewertet die schützenden Wirkungen verschiedener künstlicher Tränenformulierungen auf humane Hornhautepithelzellen, die in einem In-vitro-Modell einer Austrocknung ausgesetzt wurden. Die metabolische Aktivität der Zellen wird untersucht, um die Wirksamkeit dieser Formulierungen bei der Verhinderung von Zellschäden zu bestimmen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Augenheilkunde
- Zellbiologie
Hintergrund
- Trockenes-Auge-Syndrom ist eine häufige Augenerkrankung, die zu Beschwerden und Sehstörungen führen kann.
- Künstliche Tränenflüssigkeit wird verwendet, um die Symptome zu lindern und die Hornhautzellen zu schützen.
- Das Verständnis der schützenden Wirkmechanismen dieser Formulierungen ist entscheidend für die Entwicklung wirksamer Therapien.
- Diese Studie konzentriert sich auf die metabolische Aktivität von Hornhautepithelzellen als Maß für die Zellgesundheit.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Wirksamkeit verschiedener künstlicher Tränenformulierungen beim Schutz der Hornhautepithelzellen vor Austrocknung.
- Identifizierung von Formulierungen, die die Zellviabilität und metabolische Aktivität nach Austrocknung verbessern.
- Gewinnung von Erkenntnissen zur Entwicklung von Therapeutika bei trockenem Auge.
Verwendete Methoden
- Immortalisierte humane Hornhautepithelzellen wurden in DMEM/F12-Medien kultiviert.
- Die Zellen wurden mit verschiedenen künstlichen Tränenformulierungen behandelt und einer Austrocknung unterzogen.
- Die metabolische Aktivität wurde mithilfe eines metabolischen Farbstoffs und der Fluoreszenzmessung bewertet.
- Es wurde eine statistische Analyse durchgeführt, um die Wirkungen der Formulierungen auf die Zellviabilität zu vergleichen.
Hauptergebnisse
- Die Formulierungen eins und zwei verringerten signifikant die metabolische Aktivität vor der Trocknung.
- Lösung drei zeigte eine statistisch signifikante Verbesserung der Zellviabilität nach der Trocknung.
- Nur Lösung drei bot Schutz vor Trocknungsstress.
- Mineralöl mit Phospholipiden in Lösung drei könnte die Hydratation verbessern und die Verdunstung reduzieren.
Schlussfolgerungen
- Nicht alle künstlichen Tränenformulierungen schützen Hornhautepithelzellen wirksam vor Austrocknung.
- Lösung drei ist ein aussichtsreicher Kandidat zur Verbesserung des okularen Schutzes bei trockenen Augen.
- Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Mechanismen hinter den schützenden Wirkungen dieser Formulierungen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieser In-vitro-Assay bietet eine quantitative, reproduzierbare Methode, um künstliche Tränenformulierungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zu bewerten, die metabolische Aktivität von Hornhautepithelzellen unter Austrocknungsstress aufrechtzuerhalten. Er ermöglicht eine Frühphase der Risikominderung bei Wirkstoffkandidaten für trockene Augen, indem er die Formulierungszusammensetzung mit dem funktionalen zellulären Schutz verknüpft und somit Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der präklinischen Entwicklung unterstützt. Der Ansatz entspricht den Workflows zur Zielvalidierung und Assay-Entwicklung bei der Entdeckung okularer Therapeutika.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem formularspezifische Effekte auf die Zellviabilität und Trocknungsschutzfähigkeit gemessen werden.
- Operativer Wert: Nutzt einen empfindlichen metabolischen Farbstoffnachweis (alamarBlue), um geringe Veränderungen im Gesundheitszustand von Hornhautepithelzellen zu detektieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erstellt validierte Modelle menschlicher Hornhautepithelzellen für die anschließende Formulierungsscreening.
- Operationaler Wert: Standardisiert Expositions- und Austrocknungsbedingungen (30-minütige Inkubation, 5 Minuten bei 37 °C, 45 % relative Luftfeuchtigkeit) für reproduzierbare quantitative Ergebnisse.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme durch die Verwendung menschlicher Hornhautepithelzellen, die Verdunstungsstress ausgesetzt sind.
- Operationaler Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Weiterentwicklungsbewertungen, indem Formulierungen identifiziert werden, die die Stoffwechselaktivität nach Austrocknung bewahren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die Identifizierung von Leitverbindungen, indem Formulierungen bevorzugt werden, die sowohl die Aufrechterhaltung der Zellviabilität als auch den Trocknungsschutz zeigen, bevor man zu In-vivo-Modellen übergeht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung lipidhaltiger Formulierungen hinsichtlich der metabolischen Aktivität von Hornhautepithelzellen unter Austrocknungsstress.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Zellansaatung, Behandlung und fluorometrische Messung der metabolischen Aktivität.
- Analytik: Erzeugt quantitative Fluoreszenzsignale (Anregung bei 540 nm, Emission bei 590 nm), die den Vergleich zwischen verschiedenen Formulierungen und Kontrollen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Kontinuität, indem ein humanes Zellmodell verwendet wird, das für die Pathophysiologie des hyperevaporativen trockenen Auges relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zum Screening mehrerer künstlicher Tränenformulierungen unter definierten Austrocknungsbedingungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine prognostische Aussagekraft hinsichtlich der Wirksamkeit von Formulierungen, indem die Stoffwechselaktivität mit dem zellulären Schutz vor durch Austrocknung verursachten Schäden verknüpft wird.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Zelldichte, Inkubationszeiten und Umweltbedingungen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung zwischen Fortführung oder Abbruch, indem Formulierungen identifiziert werden, die keinen ausreichenden Zellschutz bieten (z. B. Lösung eins und zwei), im Vergleich zu solchen mit signifikantem Schutz (Lösung drei).
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Trocken-Augen-Kandidaten basierend auf statistisch signifikanten Verbesserungen der Zellviabilität nach der Austrocknung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Zellkultur immortalisierter humaner Hornhautepithelzellen und aseptischer Techniken.
- Benötigt kollagen I-beschichtete Kulturschalen, ein Hämozytometer zur Zellzählung sowie einen Plattenreader mit Fluoreszenznachweisfunktion.
- Setzt eine standardisierte Abstimmung zwischen den Teams hinsichtlich der Bedingungen in der Trockenkammer (37 °C, 45 % relative Luftfeuchtigkeit) und der Inkubationsdauer des metabolischen Farbstoffs voraus.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf andere Zelltypen der Augenoberfläche oder alternative Stressmodelle ausgeweitet wird.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die 30-minütige Vorinkubation und das 5-minütige Austrocknungsfenster, die chronische trockene Augenbedingungen möglicherweise nicht vollständig replizieren.
