Name: Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie einen extrazellulären Flux-Analysator nutzen, um Glykolyse und oxidative Phosphorylierung während der Spermienkapazitation bei Mäusen in Echtzeit zu vergleichen. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in den Energiestoffwechsel männlicher Gameten.

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Die Autoren möchten die Unterstützung von Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu am Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center würdigen.

Spermien werden von 8-16 Wochen alten CD-1 männlichen Mäusen gesammelt. Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Weill Cornell Medicine genehmigt.
1. Tag vor dem Assay
<ol><li>
Vorbereitung von Sensorpatrone und extrazellulärem Flussanalysator-Kalibrant
	<ol>
<li>Um die Sensorpatrone zu hydratisieren, entfernen Sie die Sensorpatrone aus dem XFe96 Extracellular Flux Assay Kit und stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Versorgungsplatte.</li>
		<li>Füllen Sie ein Lösungsreservoir mit 25 ml doppeldestilliertemH2O mit einer Mehrkanalpipette, fügen Sie jedem Brunnen der Versorgungsplatte 200 lH2O hinzu. Legen Sie die Sensorpatrone wieder in die Nutzplatte und inkubieren Sie sie über Nacht in einem 37 °C Nicht-CO2-Inkubator. HINWEIS: Die Kartusche muss mindestens 4 h hydratisiert werden.</li>
		<li>Aliquot 25 ml des extrazellulären Flussanalysators kalibrieren in ein 50 ml konisches Rohr und inkubieren es über Nacht in einem 37 °C Nicht-CO2-Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Herstellung von ConA-beschichteten Mikroplatten
	<ol>
<li>2,5 mg ConA in 5 ml doppeldestilliertemH2O auflösen, um einen 0,5 mg/ml (w/v) Vorrat zu erstellen.</li>
		<li>Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette jeden Brunnen einer extrazellulären Flussanalysator 96-Well-Platte mit 50 l der 0,5 mg/ml Con A-Lösung. Lassen Sie den Deckel offen und lassen Sie die Platte über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. HINWEIS: Mehrere Platten können auf einmal beschichtet und bis zu vier Wochen bei 4 °C gelagert werden, bis sie einsatzbereit sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung des Spermienpuffers
	<ol>
<li>Bereiten Sie 250 ml extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer mit niedrigen HEPES mit 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 5,6 mM Glukose und 1 mM HEPES. Den Puffer auf 37 °C erhitzen und den pH-Wert auf 7,4 einstellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tag des Assays
<ol><li>Vorbereitung für die Kartuschenkalibrierung
	<ol>
<li>Ersetzen Sie die H2O in der Nutzplatte durch 200 l XF-Kalibrant pro Bohrkörper und inkubieren Sie mindestens 1 h in einem Nicht-CO2 37 °C-Inkubator. HINWEIS: Anstelle von kalibrierenden, sterilgefilterten PBS kann pH 7.4 verwendet werden.</li>
		<li>50 ml TYH-Puffer bei 37 °C erhitzen.</li>
	</ol></li>
	<li>Generieren einer Wellenvorlage für den extrazellulären Flussanalysator
	<ol>
<li>Schalten Sie den extrazellulären Flussanalysator ein und lassen Sie die Temperatur auf 37 °C stabilisieren.</li>
		<li>Öffnen Sie die Wellensoftware und entwerfen Sie eine neue Vorlage, indem Sie eine leere Vorlage öffnen (siehe Ergänzungsdatei 1, Wellenvorlage).</li>
		<li>Öffnen Sie die Registerkarte Gruppendefinitionen. Definieren Sie Assay-Medien als TYH; pH 7.4 und Zelltyp als Maussperma, lassen Injektionsstrategien und Vorbehandlungen leer. Erstellen Sie verschiedene Gruppen für jede Assaybedingung; In diesem Beispiel gibt es 6 verschiedene Gruppen (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) und 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) zur Induzieren von Kapatizien, 2-Deoxyglucose (2-DG) als Glykolysehemmer, Antimycin A (AntA) und Roton (Rot) als Inhibitor des komplexen III und des komplexen I der Elektronentransportkette. HINWEIS: Um die Variabilität zwischen den Brunnen zu berücksichtigen, sollten mindestens 7-8 Brunnen pro Zustand parallel gemessen werden.</li>
		<li>Öffnen Sie die Registerkarte "Platte" und definieren Sie die Plattenkarte, indem Sie Gruppen bestimmten Brunnen zuweisen. HINWEIS: Die vier Eckbrunnen (A1, A12, H1, H12) werden mit TYH-Puffer (kein Sperma) gefüllt und später für die Hintergrundsubtraktion verwendet.</li>
		<li>Öffnen Sie die Registerkarte Protokoll, fügen Sie 4 verschiedene Messzyklen hinzu, wählen Sie den jeweiligen Port aus und bearbeiten Sie die Messdetails (Abbildung 2, Tabelle 1). Markieren Sie die Maßnahme nach der Injektion und markieren Sie nicht das Gleichgewicht.</li>
		<li>Speichern Sie die Testvorlage, füllen Sie die Projektzusammenfassung aus, und definieren Sie den Speicherort für die Ergebnisdatei.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von Verbindungen zum Laden in die Sensorpatrone
	<ol>
<li>Bereiten Sie 2 ml 50 mM db-cAMP vor, indem Sie 9,8 mg Verbindung im TYH-Puffer auflösen und IBMX zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzufügen. HINWEIS: IBMX neigt dazu, nach verdünnter TYH-Puffer zu ausfallen. Ausscheidungen können durch Wirbeln und Inkubieren der TYH/db-cAMP/IBMX-Lösung in einem 37 °C-Wärmeblock für 5 min gelöst werden.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 ml 500 mM 2-DG vor, indem Sie 82,1 mg Verbindung im TYH-Puffer auflösen.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 ml von 5 m AntA/Rot vor, indem Sie beide Medikamente im TYH-Puffer verdünnen. HINWEIS: Verbindungen werden 10-fach durch Injektion in die extrazelluläre Flussanalysatorpatrone verdünnt; Achten Sie daher darauf, dass Injektionslösungen 10x konzentrierter sind.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung von Maussperma
	<ol>
<li>Anästhetisieren Sie 3 männliche Mäuse zwischen 8 und 16 Wochen durch Isofluran und opfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation, nachdem keine Reaktion auf Zehenkneifen nachgewiesen wurde. Entfernen Sie die Cauda epididymide und vasa deferentia.</li>
		<li>Legen Sie jede Cauda in 500 l vorgewärmten TYH-Puffer in 24-Well-Platte gut, immobilisieren Sie die Cauda an der Unterseite der Platte mit einem Paar Zange und öffnen Sie das Gewebe durch 5-7 kleine Schnitte mit Federschere.</li>
		<li>Die Platte sofort in einen Nicht-CO2 37 °C-Inkubator geben und das Sperma 15 min verteilen lassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Beladung der Sensorpatrone
	<ol>
<li>Zwei Port-Ladeführungen für Port A und D sowie Port B und C sind im Extrazellulären Flux-Kit enthalten. Entfernen Sie zum Laden eines bestimmten Ports den Deckel von der Sensorkassette, und richten Sie den Buchstaben der entsprechenden Anschlussladeführung an der oberen linken Ecke der Patrone aus. Verwenden Sie beim Einspritzen die Fingerspitzen der nicht injizierenden Hand, um die Anschlussladeführung an Ort und Stelle zu halten und die Pipettenspitzen vertikal in die Anschlussladeführungslöcher einzulegen.</li>
		<li>Anschluss A: Mit einer Mehrkanalpipette in jede Spalte 20 L des TYH-Puffers einspritzen.</li>
		<li>Port B: Injizieren Sie 22 L TYH-Puffer in Spalte 1-4, injizieren Sie 22 l 500 mM 2-DG in die Spalte 5-8 und 25 l von 5 'M AntA/Rot in Spalte 9-12.</li>
		<li>Port C: Injizieren Sie 25 L TYH-Puffer in jede Spalte mit ungeraden Zahlen, injizieren Sie 25 l von 10 mM db-cAMP/ 500 'M IBMX in jede Spalte mit geraden Zahlen.</li>
		<li>Legen Sie die Sensorpatrone mit der Kalibrierplatte in den extrazellulären Flussanalysator und starten Sie den Test. Die Kalibrierung dauert 10 - 15 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung von Spermienplatten
	<ol>
<li>45 mg BSA in 15 ml TYH-Puffer (3 mg/ml w/v) auflösen und drei Aliquots von 3 ml BSA/TYH-Lösung in jeweils 5 ml Zentrifugenrohren vorbereiten.</li>
		<li>Kombinieren Sie zwei Spermienbrunnen in einem 1,5 ml Zentrifugenrohr, zählen Sie das Sperma mit einem Hämatozytometer und verdünnen Sie das Sperma auf eine Konzentration von 2 x 107 Spermien/ml. HINWEIS: Verwenden Sie geschnittene Pipettenspitzen zum Pipetieren von Spermien, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Sperma für 3 min bei 700 x g, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml TYH Puffer hinzu. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt, entfernen Sie den Überstand und übertragen Sie jede Spermiensuspension aliquot in ein 5 ml Zentrifugenrohr mit 3 ml BSA/TYH.</li>
		<li>Legen Sie 180 L TYH-Puffer in jeden Eckbrunnen (A1, A12, H1, H12) einer ConA-beschichteten Platte. Legen Sie 180 l Spermiensuspension in jeden leeren Brunnen der ConA-beschichteten Platte (1,2 x 106 Spermien/Gut).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Spermienplatte bei 250 x g für 1 min, drehen Sie die Platte um 180°, und Zentrifuge wieder bei 250 x g für 1 min (niedrigste Bremsrate 1).</li>
		<li>Entfernen Sie die Kalibrierplatte aus dem extrazellulären Flussanalysator und fügen Sie die Spermienplatte hinzu. Setzen Sie den Test fort.</li>
	</ol></li>
	<li>Datenextraktion und -analyse
	<ol>
<li>Nach Abschluss des Testes entfernen Sie die Kassette, öffnen Sie die Ergebnisdatei, klicken Sie auf die Registerkarte Exportieren und exportieren Sie die abgeschlossene Ausführung als GraphPad Prism-Datei (Ergänzende Datei 2: Primäre Beispieldaten für Abbildung 3).</li>
		<li>Duplizieren Sie die ECAR- und OCR-Datei, indem Sie auf die Registerkarte Neu und dann auf die Registerkarte "Doppelte Familie" klicken (Abbildung 3A).</li>
		<li>Löschen Sie die ersten 7 Datenzeilen (Abbildung 3B).</li>
		<li>Normalisieren Sie sich auf den Datenpunkt vor der cAMP/IBMX-Injektion durch Basissubtrahierung von Zeile 1. Klicken Sie auf die Registerkarte Analysieren, dann auf die Registerkarte Basislinie entfernen und Spaltenmathematik. Hervorheben ausgewählter Zeilen: Erste Zeile, Berechnung: Verhältnis:Wert/Baselineund Unterspalten: Unterspalte ignorieren. Klicken Sie auf OK (Abbildung 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der Verlust der Spermienkapazität in Ermangelung bestimmter metabolischer Substrate oder kritischer Stoffwechselenzyme ergab den Energiestoffwechsel als Schlüsselfaktor für eine erfolgreiche Befruchtung. Ein metabolischer Schalter während der Zellaktivierung ist ein etabliertes Konzept in anderen Zelltypen, aber wir beginnen gerade zu verstehen, wie Spermien ihren Stoffwechsel an den steigenden Energiebedarf während der Kapitulation anpassen. Mit einem extrazellulären Flussanalysator haben wir ein leicht anwendbares Werk...

Die Anwendung der Massenspektrometrie hat die Untersuchung des Stoffwechsels revolutioniert. Gezielte metabolische Profilierung und metatobiomische Tracing ermöglichen eine präzise Überwachung von Veränderungen im Energiestoffwechsel. Die erfolgreiche Durchführung der Metabolomik erfordert jedoch umfangreiche Schulungen, erfahrenes Personal und teure, hochempfindliche Massenspektrometer, die nicht für jedes Labor verfügbar sind. In den letzten Jahren ist die Verwendung eines extrazellulären Flussanalysators, wie z. B. des Seahorse XFe96, als Ersatzmethode zur Messung von Veränderungen im Energiestoffwechsel in verschiedenen Zelltypen1,2,3,4,5populär geworden.
Spermien sind hochspezialisierte motile Zellen; deren Aufgabe es ist, das väterliche Genom an die Oozyte zu liefern. Sperma verlassen den männlichen Fortpflanzungstrakt nach der Ejakulation sind noch funktionell unreif und können die Eizelle nicht befruchten, weil sie nicht in der Lage sind, die Gewänder der Eizellen zu durchdringen. Spermien erwerben Befruchtungskompetenz, wenn sie durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt in einem Reifungsprozess, bekannt als Capacitation6,7,transportiert werden. Frisch ejakulierte Spermien oder Spermien, die aus der Cauda epididymis seziert werden, können in vitro durch Inkubation in definierten Kapazitationsmedien, die Ca2+, Bicarbonat (HCO3-) oder einen zelldurchlässigen cAMP analog (z. B. Dibutyryl-cAMP), ein Cholesterin-Akzeptor (z. B. Rinderserumalbumin, BSA) und eine Energiequelle (z. B. Glukose). Während der Kapitulation modifizieren Spermien ihr Motilitätsmuster in einen asymmetrischen Flagellar-Beat, der einen Schwimmmodus namens Hyperaktivierung8,9darstellt, und sie werden kompetent, um die Akrosomenreaktion7zu durchlaufen, wo proteolytische Enzyme freigesetzt werden, die die Gewänder der Eizellen verdauen. Diese Prozesse erfordern Energie, und ähnlich wie somatische Zellen, Spermien erzeugen ATP und andere hochenergetische Verbindungen über Glykolyse sowie mitochondrialen TCA-Zyklus und oxidative Phosphorylierung (Oxphos)10. Während mehrere Studien zeigen, dass Glykolyse notwendig und ausreichend ist, um die Spermien-Kapazität11,12,13,14zu unterstützen, ist der Beitrag von Oxphos weniger klar. Im Gegensatz zu anderen Zelltypen, bei denen die Glykolyse physikalisch an den TCA-Zyklus gekoppelt ist, sind Spermien stark kompartimisiert und sollen diese Prozesse in separaten Flagellarkomden aufrechterhalten: Das Mittelstück konzentriert die mitochondriale Maschinerie, während die Schlüsselenzyme der Glykolyse auf das Hauptstück15,16beschränkt zu sein scheinen. Diese Abschottung führt zu einer anhaltenden Debatte darüber, ob Pyruvat, das im Hauptstück durch Glykolyse produziert wird, mitochondriale Oxphos im Mittelstück unterstützen kann und ob ATP, die von Oxophs im Mittelstück produziert wird, in der Lage wäre, ausreichend schnell entlang der Länge des Flagellums zu diffundieren, um den Energiebedarf in distalen Teilen des Hauptteils17,18,19zu unterstützen. Es gibt auch Unterstützung einer Rolle für Oxphos in Spermien-Capacitation. Oxphos ist nicht nur energetisch günstiger als Glykolyse, erzeugt 16-mal mehr ATP als Glykolyse, sondern Mittelstückvolumen und mitochondrialer Gehalt sind direkt mit der Reproduktivfitness bei Säugetierarten korreliert, die einen größeren Grad des Wettbewerbs zwischen Männchen fürKumpels zeigen 20. Um diese Fragen zu beantworten, sind Methoden zur Untersuchung der relativen Beiträge von Glykolyse und Oxphos während der Spermien-Kapazität erforderlich.
Tourmente et al. wandten einen 24-Well extrazellulären Flussanalysator an, um den Energiestoffwechsel eng verwandter Mausarten mit signifikant unterschiedlichen Spermienleistungsparametern zu vergleichen21. Anstatt die basalen ECAR- und OCR-Werte von nicht kapazitierten Spermien zu melden, passen wir hier ihre Methode mit einem 96-Well extrazellulären Flussanalysator an, um Veränderungen des Energiestoffwechsels während der Flüchtigkeit der Maus in Echtzeit zu überwachen. Wir haben eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, Glykolyse und Oxphos in Echtzeit in Spermien mit schlagenden Flagella in bis zu zwölf verschiedenen Versuchsbedingungen zu überwachen, indem der Fluss von Sauerstoff(O2) und Protonen (H+) gemessen wird (Abbildung 1A). Durch den Abbau von Pyruvat zu Laktat während der Glykolyse und die Produktion vonCO2 über den TCA-Zyklus extrudieren nicht-kapazitierte und kapazitierte Spermien H+ in die Assaymedien, die vom extrazellulären Flussanalysator über H+-empfindliche Fluorophore zur Sondenspitze einer Sensorpatrone immobilisiert werden. Parallel dazu wird derO2-Verbrauch durch oxidative Phosphorylierung überO2-empfindlicheFluorophore immobilisiert, die zur gleichen Sondenspitze immobilisiert sind (Abbildung 1B). Der effektive Nachweis des freigesetzten H+ und verbrauchten O2 erfordert einen modifizierten Spermienpuffer mit geringer Pufferkapazität ohne Bicarbonat oder Phenolrot. Um also in Abwesenheit von Bicarbonat eine Kapacitation zu induzieren, haben wir die Verwendung eines zelldurchlässigen cAMP-Analogos übernommen, das zusammen mit dem Breitbereichs-PDE-Hemmer IBMX22injiziert wurde. Drei zusätzliche unabhängige Injektionsöffnungen ermöglichen die Injektion von pharmakologischen Aktivatoren und/oder Inhibitoren, was die Echtzeitdetektion von Veränderungen der zellulären Atmung und Glykolyserate aufgrund experimenteller Manipulation enciert.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>2-DG</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>IBMX; Herstellung einer 500 mM Stammlösung in DMSO (111,1 mg/ml) und Lagerung in kleinen Aliquots</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Anta; Eine 5 mM Stammlösung in DMSO (2,7 mg/ml) herstellen und in kleinen Aliquoten</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1470</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Concanacalin A, Lektin aus Arachis hypogaea (Erdnuss)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L7381</td><td>ConA</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Isothesie</td><td>Henry Schein Tiergesundheit</td><td>1169567761</td><td>Isofluran-Magnesiumsulfat</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>N6,2'-O-Dibutyryladenosin 3',5'-cyclisches Monophosphat-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>db-cAMP</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13995</td><td>Rot; Herstellung einer 5 mM Stammlösung in DMSO (2mg/ml) und Lagerung in kleinen Aliquoten</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3-Natriumchlorid</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Ausrüstung und Materialien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-Kanal-Pipette 10-100 &mu; L</td><td>eppendorf</td><td>ES-12-100</td><td></td></tr><tr><td>12-Kanal-Pipette 50-300 &mu; L</td><td>vwr</td><td>613-5257</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, non-CO2 Inkubator</td><td>vwr</td><td>1545</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Cetrifuge Röhrchen</td><td>eppendorf</td><td>30119380</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>vwr</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge mit Plattenadapter</td><td>Thermo Scientific</td><td>IEC FL40R</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionskit</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Phasenkontrastmikroskop mit 40X Objektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, geteilt</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X93</td><td></td></tr><tr><td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, geteilt</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X95</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>Auch als XFe96 FluxPak mini (102601-100) mit 6 statt 18 Patronen erhältlich.</td></tr></tbody></table>

verwendung eines extrazellulären flux-analyzers zur messung von veränderungen in der glykolyse und oxidativen phosphorylierung während der maus sperma-capacitation

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Säugetier-Spermien erwerben Befruchtungsfähigkeit im weiblichen Fortpflanzungstrakt in einem Prozess, der als Kapitulation bekannt ist. Capacitation-assoziierte Prozesse benötigen Energie. Es bleibt eine laufende Debatte über die Quellen, die die ATP erzeugen, die Spermien progressive Motilität, Kapitulation, Hyperaktivierung, und Akrosomenreaktion antreibt. Hier beschreiben wir die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators als Werkzeug, um Veränderungen im Energiestoffwechsel während der Maus-Sperma-Kapazität zu analysieren. Mit H+- undO2- empfindlichen Fluorophoren ermöglicht diese Methode die Überwachung der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung in Echtzeit in nicht-kapazitierten oder kapazitiven Spermien. Die Verwendung dieses Assays in Gegenwart verschiedener Energiesubstrate und/oder pharmakologischer Aktivatoren und/oder Inhibitoren kann wichtige Einblicke in den Beitrag verschiedener Stoffwechselwege und den Schnittpunkt zwischen Signalkaskaden und Stoffwechsel während der Spermienkapitulation liefern.

Diese Methode verwendet einen extrazellulären Flussanalysator, um Echtzeit-Änderungen in der Rate der Glykolyse und Oxphos während der Maus Sperma-Capacitation zu überwachen. Abbildung 4 zeigt ein beispielhaftes Experiment, bei dem Spermien in Gegenwart von Glukose als einzigem Energiesubstrat und 2-DG und Antimycin und Roton als pharmakologische Modulatoren kapazitiert wurden. Das Energiesubstrat im extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer und die pharmako...

Wir beschreiben die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators zur Überwachung von Echtzeitveränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Mazemazeration der Maus.

Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um einen extrazellulären Flussanalysator anzuwenden, um Veränderungen im Energiestoffwechsel während der Spermienkapitulation zu überwachen. Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung in Echtzeit zwischen nicht-kapazitierten und kapazitierten Maussperma zu vergleichen. Entfernen Sie am Tag vor dem Test die Sensorpatrone aus einem extrazellulären Flussmittel-Assay-Kit und stellen Sie die Patrone auf den Kopf neben die Gebrauchsplatte.Füllen Sie ein Lösungsreservoir mit 25 Milliliter doppelt destilliertem Wasser und fügen Sie 200 Mikroliter Wasser in jeden Brunnen der Versorgungsplatte ein, und legen Sie die Sensorpatrone dann wieder in die Versorgungsplatte. Legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius Nicht-Kohlendioxid-Inkubator. Als nächstes werden 25 Milliliter extrazellulärer Flussanalysator in ein 50-Milliliter-Konusrohr eingegliedert und in den 37 Grad Celsius-Nicht-Kohlendioxid-Inkubator 37 Grad Celsius eingelassen.Um ConA-beschichtete Mikroplatten vorzubereiten, lösen Sie 2,5 Milligramm ConA in fünf Milliliter doppeldestilliertem Wasser auf und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um jeden Brunnen eines extrazellulären Flussanalysators 96-Well-Platte mit 50 Mikrolitern der ConA-Lösung zu füllen, und lassen Sie dann den Deckel offen, um die Platte über Nacht trocknen zu lassen. Um den Spermienpuffer vorzubereiten, erhitzen Sie 250 Milliliter extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer auf 37 Grad Celsius und stellen Sie den pH auf 7,4. Ersetzen Sie am Tag des Assays das Wasser in jedem Brunnen der Nutzplatte durch 200 Mikroliter XF-Kalibrant pro Brunnen und legen Sie die Platte für mindestens eine Stunde wieder in den Nicht-Kohlendioxid-Inkubator.Um eine Wellenvorlage zu generieren, aktivieren Sie den extrazellulären Flussanalysator. Während sich die Temperatur auf 37 Grad Celsius stabilisiert, öffnen Sie die Wellensoftware und öffnen Sie eine leere Vorlage. Definieren Sie unter der Registerkarte Gruppendefinitionen das Assaymedium als TYH und den Zelltyp als Maussperma, sodass die Injektionsstrategien und Vorbehandlungen leer bleiben.Erstellen Sie verschiedene Gruppen für jede Assaybedingung, und öffnen Sie die Plattenkarte, um jede Gruppe bestimmten Brunnen zuzuweisen. Fügen Sie unter der Registerkarte Protokoll das Aussetzen von Hervorhebungsergebnissen auf, fügen Sie jeden der vier verschiedenen Messzyklen hinzu, wählen Sie den entsprechenden Port aus, und bearbeiten Sie die Messdetails, sodass die Messgröße nach der Injektion hervorgehoben wird, speichern Sie dann die Assay-Vorlage, füllen Sie die Projektzusammenfassung aus und speichern Sie die Ergebnisse. Vor der Ernte des Spermas, vorwärmen 50 Milliliter TYH Puffer bei 37 Grad Celsius.Nach der Ernte von Caudas von erwachsenen männlichen Mäusen, legen Sie jede Cauda in 500 Mikroliter des vorgewärmten TYH-Puffers in einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte. Verwenden Sie Zangen, um jede Cauda einzeln an der Unterseite jedes Brunnens zu immobilisieren und schnell fünf bis sieben kleine Schnitte in jedem Gewebe mit einer Federschere zu machen. Wenn alle Caudas eingeschnitten sind, legen Sie die Platte sofort in den Nicht-Kohlendioxid-Inkubator, damit sich das Sperma 15 Minuten lang dispergieren kann.Um die Sensorpatrone zu laden, entfernen Sie den Deckel von der Sensorpatrone und richten Sie den Buchstaben der entsprechenden Anschlussladeführung an der oberen linken Ecke der Patrone aus. Halten Sie die Anschlussladeführung an Ort und Stelle, legen Sie die Pipettenspitzen vertikal in die Anschlussladeführungslöcher von Port A und injizieren Sie 20 Mikroliter TYH-Puffer in jede Säule. Für Port B 22 Mikroliter TYH-Puffer in die Spalten eins bis vier, 22 Mikroliter 500 Millimolar 2-Deoxyglucose in die Spalten fünf bis acht und 25 Mikroliter von fünf Mikromolar-Antimycin A-Roton in die Spalten neun bis zwölf.Für Port C 25 Mikroliter TYH-Puffer in jede Kolonne mit ungeraden Zahlen und 25 Mikroliter von 10 Millimolaren Dibutyryl-zyklischen AMP 500 Mikromolar IBMX in jede Spalte mit geraden Zahlen injizieren, dann legen Sie die Sensorpatrone mit einer Kalibrierplatte in den extrazellulären Flussanalysator und starten Sie den Test. Die Kalibrierung dauert 10 bis 15 Minuten. Um die Spermien zuzubereiten, fügen Sie drei Milliliter von drei Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin im TYH-Puffer zu jedem von drei Fünf-Milliliter-Zentifugenröhren hinzu.Als nächstes bündeln Sie zwei Samenbrunnen in jeweils drei 1,5 Milliliter Zentrifugenröhren. Nach dem Zählen, verdünnen Sie das Sperma auf ein zwei mal 10 zu den sieben Spermien pro Milliliter Konzentration pro Probe in frischem TYH mit RinderserumAlbumin ergänzt. Sedimentieren Sie das Sperma durch Zentrifugation und setzen Sie die Spermienpellets in einem Milliliter TYH-Puffer wieder auf.Zentrifugieren Sie das Sperma wieder und entfernen Sie die Überstande, die darauf achten, die Pellets nicht zu stören. Übertragen Sie jede Spermiensuspension in eine der vorbereiteten Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 180 Mikroliter TYH-Puffer in jede Eckbohrung einer ConA-beschichteten Platte ein. Fügen Sie 180 Mikroliter Sperma in jeden leeren Brunnen der ConA-beschichteten Platte und zentrifugieren Sie die Platte zweimal drehen die Platte 180 Grad zwischen zentrifugationen, dann legen Sie die Kalibrierplatte mit der Spermienplatte und den Test fortsetzen.In diesem repräsentativen Experiment wurden Spermien in Gegenwart von Glukose als einzigem Energiesubstrat und 2-Deoxyglucose und Antimycin und Roton als pharmakologische Modulatoren kapazitiert. Der Pfeil zeigt die Induktion der Kapitulation an. In Gegenwart von Glukose wurde die Kapitulation von einer siebenfachen Erhöhung der extrazellulären Versauerungsrate begleitet, die durch die Blockierung der Glykolyse mit 2-Deoxyglucose gehemmt wird.Kapazitierte Spermien zeigten eine 20-fache Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs im Vergleich zu nicht kapazitierten Spermien, die zeigten, dass Maussperma sowohl die Glykolyse als auch die oxidative Phosphorylierung verbessern, um den steigenden Energiebedarf während der Kapitulation zu unterstützen. Der Anstieg der extrazellulären Versauerungsrate während der Spermienkapitrezitation wird nicht durch die oxidativen Phosphorylierungsinhibitoren Antimycin A und Rotone beeinflusst, was darauf hindeutet, dass die Veränderung dieser Rate hauptsächlich durch die Wasserstofffreisetzung aus der Glykolyse angetrieben wird. Die Erhöhung der Sauerstoffverbrauchsrate wird jedoch durch Antimycin A und Roton sowie durch 2-Deoxyglucose blockiert, was zeigt, dass die Zunahme von OXPHOS während der Spermien-Kapazität von der glykolytischen Aktivität abhängt.Die Energiequelle und die pharmakologischen Aktivatoren und Inhibitoren können je nach Ziel des Experiments variiert und bis zu 12 verschiedene Bedingungen parallel gemessen werden. Das Protokoll kann leicht an andere Arten wie Mensch oder Rind angepasst werden, wo die Veränderungen des Energiestoffwechsels während der Kapatitierung ebenso rätselhaft sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Protokoll bietet einen biochemischen Ansatz zur Messung der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) und der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von primären leukämischen Zellen mit einem extrazellulären Fluss-Assay. Die Beurteilung des metabolischen Profils dieser Zellen hilft, ihre Bedürfnisse zu charakterisieren, was zu einer personalisierten Therapie führt.

Extrazellulärer Flux-Assay: Eine Methode zur Messung des metabolischen Profils von Zellen

Mess-intrazellulären Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging

Die proteomische Analyse eines jeden Zelltyps hängt stark von der Reinheit und der Vorfraktionierung des Ausgangsmaterials ab, um die Probe vor der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (MS) zu entkomplexifizieren. Durch den Einsatz von Rückspültechniken können reine Spermien aus Nagetieren gewonnen werden. Nach der Verdauung können Phosphopeptide mit TiO2 angereichert werden.

Phosphopeptid Analyse der Nebenhoden Nagetier Spermien

Glykolyse ist ein definierender metabolischer Marker in mehreren biologischen Systemen. Die Überwachung der Glykolyse durch Messung des extrazellulären Flusses von H+ ist üblich, erfordert jedoch eine Korrektur, um quantitativ und eindeutig zu sein. Hier zeigen wir, wie extrazelluläre Flussdaten gesammelt und korrigiert werden können, um zwischen respiratorischen und glykolytischen Quellen der extrazellulären Versauerung zu unterscheiden.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Dieses Verfahren beschreibt Echtzeit Aufnahme von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise in explantierten Maus retinalen Gewebe mit einer extrazellulären Flux-Analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

Hier, zwei mittleren Durchsatz-Assays für die Bewertung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliche Spermien werden beschrieben. Diese Tests können verwendet werden, um schnell und einfach große Mengen von Verbindungen für Auswirkungen auf Ca2 +Bildschirm-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma.

Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) übergehen von einem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand aufgrund ihrer metabolischen Plastizität während der Blutbildung. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von HSPCs vor.

Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels

Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Die Analyse der Mitochondrienfunktion von Spermien mittels hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von frei beweglichen Spermien in einem geschlossenen Kammersystem. Die Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden, die Informationen über die mitochondrialen Eigenschaften und die Integrität der Spermien liefert.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Das hier beschriebene AcroSensE-Mausmodell und die hier beschriebenen Live-Cell-Imaging-Methoden bieten einen neuen Ansatz zur Untersuchung der Kalziumdynamik im subzellulären Kompartiment des Spermienakrosoms und wie sie Zwischenschritte regulieren, die zur Membranfusion und Akrosomen-Exozytose führen.

Echtzeit-Bildgebung der akrosomalen Kalziumdynamik und Exozytose in lebenden Mäusespermien

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente Methode zur Durchführung eines Glykolyse-Stresstests zur Quantifizierung der metabolischen Umprogrammierung in primären Maus-Mikroglia. Nach Isolierung und entzündlicher Stimulation wird die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) mit frisch hergestellten, pH-angepassten Reagenzien gemessen, gefolgt von einer Proteinnormalisierung, um eine genaue und reproduzierbare Bewertung glykolytischer Verschiebungen zu ermöglichen.

Untersuchung der Glykolyse in primären Mikroglia mittels extrazellulärem Flussassay

Erfahren Sie, wie Sie einen extrazellulären Flux-Analysator nutzen, um Glykolyse und oxidative Phosphorylierung während der Spermienkapazitation bei Mäusen in Echtzeit zu vergleichen. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in den Energiestoffwechsel männlicher Gameten.

Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation (Video) | JoVE Journal

Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation

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