Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

Die Presto-Tango-Plattform wurde entwickelt, um die parallele und gleichzeitige Abfrage aller nicht-olfaktorischen GPCRs im menschlichen Genom durchzuführen, einschließlich der verwaisten Ziele, um Ligand-induzierte Beta-Arrestin-2-Rekrutierung zu profilieren. Die Presto-Tango-Plattform ist die einzige Open-Source-Ressource zur Profilierung des gesamten GPCR-Genoms in einem parallelen Ansatz, indem ein G-Protein-unabhängiger Beta-Arrestin-Rekrutierungstest verwendet wird. Den Prozessor zu demonstrieren wären Genevieve Laroche, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in meinem Labor, und Manel Zighal, ein Doktorand in meinem Labor.

Vor Beginn des Verfahrens 20 Mikroliter einer 25 Mikrogramm pro Milliliter Poly-L-Lysin-Lösung in jeden Brunnen der entsprechenden experimentellen Anzahl von 384 optischen Bodenplatten hinzufügen und die Platten bei Raumtemperatur für 30 Minuten bis zwei Stunden inkubieren. Am Ende der Inkubation die Platten über die Spüle ziehen, um das überschüssige Poly-L-Lysin zu entfernen und jedem Brunnen 40 Mikroliter antimykotische Lösung hinzuzufügen. Dann inkubieren Sie die Platten für die Zellsaat bei 37 Grad Celsius benötigt und legen Sie den Rest der Platten bei vier Grad Celsius für die langfristige Lagerung.

Um HTLA-Zellen für das primäre Screening auszusäen, spülen Sie konfluente 150-Millimeter-Zellkulturen mit 10 Milliliter PBS vorsichtig ab, bevor Sie die Kulturen mit sechs Millilitern 0,05% Trypsin EDTA pro Schale behandeln. Wenn die Zellen abgetrennt haben Pool die Zellsuspensionen in einem 50 Milliliter konischen Rohr mit einem gleichen Volumen von DMEM. Und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Setzen Sie das Pellet mit 2,2 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter DMEM-Konzentration wieder auf und ziehen Sie die Platten über die Spüle, um die antimykotische Lösung zu entfernen. Tippen Sie auf die Teller, um zu trocknen und säen Sie 45 Mikroliter Zellen in jedem Brunnen. Dann legen Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 45% Kohlendioxid über Nacht.

Zur Vorbereitung der 384 Well DNA-Quellenplatte für die Transfektion verteilen Sie 50 Nanogramm pro Milliliter jedes Plasmids, die für das GPRC Tango-Konstrukt von Interesse in 0.1X Tris-EDTA pro Bohrgut einer 96-Well-Platte kodiert. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipetten, um 10 Mikroliter DNA-Lösung von jedem Brunnen der 96-Well-Platte manuell auf einzelne Bohrungen einer 384-Well-DNA-Quellplatte in Quadruplikat für jeden Zustand zu übertragen, wie dargestellt. Als nächstes 40 Mikroliter einer 0,313 Molaren-Calciumchloridlösung auf jeden Brunnen der DNA-Quellenplatte übertragen und den Inhalt jedes Brunnens vorsichtig mischen.

Fügen Sie 50 Mikroliter 2x HEPES Puffer zu jedem Brunnen der 384 Well DNA-Quellenplatte mit sanfter Mischung hinzu. Nach einer Minute übertragen Sie 10 Mikroliter der DNA-Transfektionsmischung aus der 384 Well DNA-Quellenplatte auf jeden Brunnen von gesäten HTLA-Zellen und inkubieren die Zellen im Zellkultur-Inkubator über Nacht. Am nächsten Tag dekantieren Sie das transfizierte Zellmedium und fügen Sie langsam 40 Mikroliter verhungerndes Medium zu jedem Brunnen hinzu, wobei darauf geachtet wird, die Zellen nicht direkt zu berühren.

Dann 20 Mikroliter des Fahrzeugpuffers für die abwechselnden Reihen ohne Verbindung in 20 Mikroliter der Zinsverbindung in einer dreifachen Konzentration in die abwechselnden Reihen geben, bevor die Platte in den Zellkultur-Inkubator zurückgebracht wird. 16 bis 24 Stunden nach der Stimulation dekantieren Sie das transfizierte Zellmedium und fügen Sie jedem Brunnen 20 Mikroliter frisch zubereitetes Glühreagenz für eine fünf- bis 20-minütige Inkubation bei lichtgeschützter Raumtemperatur hinzu. Dann lesen Sie die Platten auf einem Mikroplatten-Lumineszenzzähler mit einer Integrationszeit von einer Sekunde pro Brunnen.

Für ein sekundäres Screening, Subkultur die HTLA-Zellen in 100-Millimeter-Schalen bei einem fünf mal 10 bis die sechs Zellen Gesamtzelldichte in 11 Millimeter n gesamten Medium pro Schale für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag gemischt 10 Mikrogramm GPCR-Komplementär-DNA mit 500 Mikroliter NghAs-Calciumchloridlösung mit Wirbel, gefolgt von der Zugabe von 500 Mikroliter HEPES-Puffer. Nach kräftigem Schütteln die Lösung für eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und sofort einen Milliliter der Lösung auf die Zellen tropfen lassen.

Sanft schaukeln, um den Niederschlag gleichmäßig zu verteilen und die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius zu platzieren. Überprüfen Sie am nächsten Tag die Transfektionseffizienz unter einem fluoreszierenden Zellbildbild. Transaktionen mit einer Abdeckung von mehr als 50 % sind ideal.

Spülen Sie die transfizierten Zellen vorsichtig mit Versenlösung ab, bevor Sie die Zellen mit drei Millilitern 0,05%Trypsin EDTA lösen. Sammeln Sie die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet viermal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter verhungernder mittlerer Konzentration wieder auf. Dann säen Sie 45 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen einer Poly-L-Lysin codierten 384 WellPlatte und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator für mindestens vier Stunden.

Zur Vorbereitung einer halben Log-Dosis-Kurve-Ansprechplatte fügen Sie 270 Mikroliter HBSS ergänzt mit HEPES und Antimycotic antimycotic zu allen außer der letzten Reihe einer 96 Well Platte und fügen Sie 30 Mikroliter jeder hohen und niedrigen Wirkstofflösung zu den Brunnen der Reihe H.Übertragen Sie die Lösung aus jedem Brunnen der Reihe H in den entsprechenden Brunnen der Reihe G mit Mischen und weiterhin seriell verdünnen erreicht ist. Unter Verwendung des Schaltplans als Referenz mischen Sie 20 Mikroliter der niedrigen Säulenverdünnungen aus den Reihen A bis G der 96-Wellplatte und 20 Mikroliter der hochsäulenverdünnungsmittels zu den Brunnen B bis H der 96-Wellplatte zur zuvor sitzenden 384-Wellplatte. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für mindestens 16 Stunden.

16 bis 24 Stunden nach der Stimulation dekantieren Sie das transfizierte Zellmedium und fügen Sie jedem Bohrkörper 20 Mikroliter Glühreagenz für eine inkubation von fünf bis 20 Minuten hinzu, bevor Sie die Platten auf einem Mikroplatten-Lumineszenzzähler mit einer Integrationszeit von einer Sekunde pro Brunnen lesen. In diesem repräsentativen Experiment waren von den 168 GPCRs, die im Primärscreening abgefragt wurden, nur Dopaminrezeptor D3 und Opsin 5 Anwärter als potenzielle aktive Ziele. Dopamin-Rezeptor D3 produzierte eine signifikante Log2-Faltenänderung von 4,7, während Opsin 5 eine etwas geringere Reaktion von 2,39 produzierte.

Im Vergleich dazu, Dopamin-Rezeptor D2, die positive Kontrolle für den primären Bildschirm produziert eine log2 Faltenänderung von 4,58. Diese Ansprechkurven aus dem sekundären Screening zeigten, dass Chromatingranulatextrakt ähnliche Signalfenster in halbso maximalen effektiven Konzentrationswerten erzeugt, um Quinpirol zu bestätigen, das seine Gültigkeit als aktiver Treffer am Dopaminrezeptor D3 bestätigt. Für Opsin 5 wurde eine flache Dosiskurve ähnlich der Negativkontrolle erzeugt, die diesen Rezeptor jedoch als mögliches Ziel für den Chromatin-Granulatextrakt ausschließt. Presto-Tango erfordert besondere Sorgfalt, da Variabilitäten in der Zellverteilung, Transfektionseffizienz und seriellen Arzneimittelverdünnungen zu zusammengesetzten Fehlern führen können, die die Genauigkeit der Daten beeinflussen können.

Orthogonale Methoden wie Radioligand-Bindungsansätze, Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer und Cyclic AMP-Calcium- und Internalisierungs-Funktionsassays können verwendet werden, um Ligandenrezeptor-Wechselwirkungen weiter zu bestätigen und zu charakterisieren.