Name: Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in katzenartigen arteriellen Thromben mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die verbesserte Visualisierung von NETs in paraffingebetteten Geweben.

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Die Studie wurde von Mitteln der University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F) unterstützt. Die Autoren möchten Dr. Kevin Woolard für den Einsatz des Fluoreszenzmikroskops würdigen.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of California, Davis, durchgeführt. Nekropsien und Biopsien von Geweben wurden mit Zustimmung der Eigentümer durchgeführt.
1. Gewebefixierung, Einbettung und Schnitt
<ol><li>Dissect out der aortenbifurkation, einschließlich der absteigenden Aorta, Femoralarterie, und die gemeinsamen Iliasarterien (Abbildung 1A), kurz nach humaner Euthanasie oder Tod. Blunt sezieren die Faszie (Abbildung 1B), bevor sie vollständig in 10% neutral gepuffertes Formalin für mindestens 24 h und nicht länger als 48 h getaucht wird.</li>
	<li>Um die Probe zu dehydrieren, tauchen Sie zuerst in 10% neutral gepuffertes Formalin ein, das 1 h auf 37 °C erhitzt wird. Dann tauchen Sie in steigenden Konzentrationen von Ethanol erhitzt auf 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x für je 1 h. Schließlich, ohne Spülung, tauchen Sie 2x in 100% Toluin erhitzt auf 37 °C für 1 h jeder.</li>
	<li>Paraffin auf 62 °C erhitzt hinzufügen und das Paraffin vollständig über Nacht erstarren lassen.</li>
	<li>Abschnitt 2–3 m des paraffineingebetteten Gewebes mit einem Mikrotome und auf positiv geladenen Glasdias platzieren. Schnittgewebe bis zu einer weiteren Analyse bei -80 °C lagern.</li>
</ol>2. Deparaffinierung, Rehydratation und wärmeinduzierte Antigenabruf
<ol><li>Um die Deparaffinierung und Rehydrierung von Abschnitten auf Glasgleitern durchzuführen, legen Sie Glasschlitten in Regale und verarbeiten Sie in der folgenden Reihenfolge:<ol>
<li>Vollständig in 100% Xylol für 3 min untertauchen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. Spülen Sie nicht zwischen den Schritten.</li>
		<li>Vollständig in abnehmenden Ethanolkonzentrationen untertauchen (100%, 95%, 70%) bei Raumtemperatur (RT), 3x für je 3 min. Spülen Sie nicht zwischen den Schritten.</li>
		<li>Vollständig in entionisiertes Wasser für 2 min untertauchen. Wiederholen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie Abschnitte in Tris-gepufferte Salin mit 0,1 % Tween (TBST, pH = 7,6) für 2–3 min.</li>
	<li>Füllen Sie das Reservoir mit entionisiertem Wasser, das auf 100 °C erhitzt wird. Lassen Sie die Dampfkammer für 20 min ausdemieren. HINWEIS: Die wärmeinduzierte Antigenabrufung wird am besten mit indirekter Erwärmung durchgeführt, die von einem Dampfer mit einer voreingestellten Temperatureinstellung erzeugt wird, z. B. einem Lebensmitteldampfer.</li>
	<li>Erhitzen Sie die handelsübliche Antigen-Retrievallösung, die Tris und EDTA (pH = 9) enthält, auf einer temperaturgeregelten Kochplatte unter ständigem Rühren auf 95–97 °C. Stellen Sie sicher, dass es nicht kocht. HINWEIS: Die Lösung sollte trüb werden, sobald sie erwärmt ist.</li>
	<li>Gießen Sie die beheizte Antigen-Retrieval-Lösung in einen Schiebebehälter und legen Sie den Behälter in die Kammer des Dampfers. Lassen Sie die Antigen-Retrieval-Lösung auf die Temperatur des Dampfers für 3–4 min ausdemaieren. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Kammer 95 °C beträgt.</li>
	<li>Untertauchen Sie die Dias vollständig in die beheizte Antigen-Retrieval-Lösung und setzen Sie den Einsatz der externen Erwärmung über den Dampfer für 20 min fort.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schieberbehälter aus dem Dampfer und lassen Sie die Dias und die Antigen-Retrieval-Lösung auf RT abkühlen. Bewahren Sie die verdünnte Antigen-Retrieval-Lösung bei 4 °C auf und verwenden Sie bei Bedarf bis zu 2x.</li>
	<li>Waschen Sie die Dias 3x mit TBST für 5 min.</li>
</ol>3. Immunkennzeichnung und Autofluoreszenzabschreckung
HINWEIS: In Tabelle 1 ist die Zusammensetzung der blockierenden Puffer aufgeführt, die in den folgenden Schritten verwendet werden.
<ol><li>Inkubieren Sie Abschnitte in Blocking Buffer 1 für 2 h bei RT unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min). Versiegeln Sie mit Paraffinfolie, um ein Trocknen zu vermeiden.</li>
	<li>Ohne Waschen sofort 100 l polyklonalen antihumanen citrullinierten Histon-H3-Antikörper (0,03 mg/ml im Sperrpuffer 1) direkt auf das Dia auftragen.</li>
	<li>Legen Sie einen Abdeckzettel (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) auf jeden Abschnitt, um eine gleichmäßige Verteilung des Antikörpergemischs zu ermöglichen.</li>
	<li>12–16 h bei 4 °C mit sanftem Schaukeln (30–50 Umdrehungen von 15:0 00 Uhr) bebrüten. Versiegeln Sie mit Parafilmfolie, um ein Trocknen zu vermeiden.</li>
	<li>3x mit TBST für 5 min waschen.</li>
	<li>Tragen Sie 100 l Ziegenanti-Kaninchen-Antikörper auf, die mit Alexa Fluor 488 konjugiert sind (verdünnt auf eine Endkonzentration von 0,04 mg/ml oder 1:50 in Blocking Buffer 1), wie in Schritt 3.3 beschrieben. 1 h bei RT unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min) inkubieren. Schützen Sie Dias vor Licht.</li>
	<li>Waschen Sie mit TBST 3x für 5 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie Abschnitte in Blocking Buffer 2 über Nacht bei 4 °C unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min). Vor Licht schützen.</li>
	<li>Waschen Sie mit TBST 3x für 5 min.</li>
	<li>Blockabschnitte in Blocking Buffer 3, wie in Schritt 3.3 bei RT beschrieben, für 2 h unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min).</li>
	<li>Inkubieren Abschnitte mit biotinylierten polyklonalen Kaninchen antihumanen NE-Antikörper (Endkonzentration = 0,2 g/ml in Blocking Buffer 3) bei 4 °C für 12–16 h, wie in den Schritten 3.2–3.4 beschrieben.</li>
	<li>Waschen Sie mit TBST 3x für 5 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit Alexa Fluor 594 Streptavidin-Konjugat (verdünnt auf 1:100 oder 0,02 mg/ml in Blocking Buffer 3), wie in den Schritten 3.2–3.3 für 1 h bei RT beschrieben.</li>
	<li>Waschen Sie mit TBST 1x für 5 min.</li>
	<li>Tragen Sie 100 l Autofluoreszenz-Abschrecklösungsmischung direkt auf die Abschnitte für 1 min auf, wie vom Hersteller angewiesen.</li>
	<li>Waschen Sie die Dias sofort mit TBST 6x für 10 min.</li>
	<li>Bedecken Sie jede Folie mit 100 l von 300 nM DAPI für 5 min im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie mit TBST für 3 min. Wiederholen Sie dies für insgesamt 5x.</li>
	<li>Tragen Sie einen Tropfen (ca. 50 l) Antifade-Montagemedium, Teil des Autofluoreszenz-Abschreckkits, direkt auf die Glasrutsche auf, die den Abschnitt umgibt. Legen Sie einen Abdeckzettel (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) vorsichtig auf den Abschnitt, ohne Blasen zu erzeugen.</li>
	<li>Proben bei 4 °C über Nacht im Dunkeln aushärten lassen, bis sich das Montagemedium für die mikroskopische Analyse mit Tauchlinsen gehärtet hat.</li>
</ol>4. Neutrophile extrazelluläre Trap-Identifikation
HINWEIS: Das folgende Protokoll verwendet ein invertiertes Epifluoreszenzmikroskop mit einer 1.280 x 960 digitalen CCD-Kamera (siehe Tabelle der Materialien).
<ol><li>Um Thrombi zu lokalisieren, scannen Sie kranially zu kauarisch entlang der Länge der Aorta, Aortenbifurkation, und jede Femoralarterie mit Phasenkontrastmikroskopie mit einem 10-fachen Objektiv. Ein Thrombus ist ein Konglomerat von Geweben, die rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Blutplättchen neben dem Endothel auf Phasenkontrast und Hellfeldmikroskopie enthalten (Abbildung 2A, Abbildung 2B).</li>
	<li>Erste Untersuchung von Abschnitten für NETs mit dem DAPI-Kanal (Erregung = 357/44 nm) mit 10x- und 20-fach-Objektiven (Abbildung 2C). Beachten Sie, dass cfDNA als dekondensierte DNA erscheint, die nicht innerhalb der Grenzen des Zytoplasmas einer Zelle liegt, wenn sie auf Phasenkontrast oder Hellfeldmikroskopie gesehen wird.</li>
	<li>Identifizieren Sie extrazelluläres NE und CitH3 auf den Texas Red Kanälen (Erregung = 585/29 nm, Emission = 628/32 nm) und grünen fluoreszierenden Proteinkanal (Erregung = 470/22 nm, Emission = 525/50 nm) bzw. mit 10, 20 und 40x Objektiven.</li>
	<li>Bewerten und analysieren Sie NETs innerhalb eines Thrombus mit verfügbarer Software, z. B. Image J (NIH). Die NET-Bildung wird anhand der Kolokalisierung von cfDNA, extrazellulärem CitH3 und NE wie zuvor beschrieben18identifiziert. Halten Sie konsistente Belichtungszeit und Gewinne jedes Kanals während der gesamten Aufnahme von Bildern aufrecht, um eine Sättigung der Pixelintensität zu vermeiden.</li>
	<li>Ordnen Sie jeden Thrombus basierend auf seiner Nähe zur absteigenden Aorta zu, indem Sie ihn in drei gleiche Zonen unterteilen, wobei Zone 1 der Aorta, Zone 3 am weitesten von der Aorta und Zone 2 zwischen Zonen 1 und 3 am nächsten liegt. Wenn der Bediener für den Gesundheitszustand jedes Subjekts geblendet ist, nehmen Sie mindestens zehn zufällige Felder in jeder Zone ein. Charakterisieren Sie die Verteilung von NETs in Thrombi, indem Sie die Anzahl der Felder mit NETs in jeder Zone durchschnittlichisieren oder die durchschnittliche NET-Belegungsfläche pro Zone berechnen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir beschreiben ein Protokoll zur Identifizierung von NETs in festen kardiogenen arteriellen Thromben mit einem Doppel-Immunolabeling-Protokoll und einer Immunfluoreszenzmikroskopie. Obwohl nur kardiogene arterielle Thromben gefärbt wurden, konnte dieses Protokoll theoretisch für andere Thrombentypen und andere Tierarten verwendet werden. Die Identifizierung von NETs innerhalb des felinen arteriellen Thrombens deutet darauf hin, dass NETs bei Derene bei Katzen eine Rolle spielen können.
Der Na...

Katzen mit hypertropher Kardiomyopathie sind dem Risiko lebensbedrohlicher thromboembolischer Komplikationen1,2ausgesetzt. Trotz der hohen Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit fein kardiogener arterieller Thromboembolie (CATE) ist die zugrunde liegende Pathophysiologie von CATE bei Katzen schlecht verstanden. Es gibt auch begrenzte diagnostische und therapeutische Instrumente zur Behandlung und Identifizierung von Katzen, die von diesem verheerenden Zustand bedroht sind3.
Zusätzlich zu seiner Rolle bei der angeborenen Immunität haben Neutrophilen gezeigt, dass sie eine Rolle bei der Thrombose spielen, indem sie neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) freisetzen, die webartige Netzwerke zellfreier DNA (cfDNA) sind, die mit Histonen und granulären Proteinen wie Neutrophilenase (NE) und Myeloperoxidase verkrustet sind. Neutrophile durchlaufen NETs Bildung als Reaktion auf systemische Entzündung, direkte Begegnung mit Krankheitserregern, und Interaktion mit aktivierten Blutplättchen4,5,6,7. Bei Hunden, neutrophil-abgeleitete DNA hat sich gezeigt, dass GerinnselLyse hemmen, während NET-Proteine die Gerinnselbildung beschleunigen. Die Fähigkeit von NETs, zirkulierende Zellen und Gerinnungskomponenten zu fangen, ist auch der Schlüssel zu ihren thrombogenen Eigenschaften8,9,10,11,12.
NETs werden durch Kolokalisierung von extrazellulären neutrophilen Proteinen, Histonen und cfDNA nachgewiesen. Aus diesem Grund ist die Identifizierung und Quantifizierung von NETs in festen Geweben durch Immunfluoreszenz von deparaffiniertem Gewebe dem traditionellen Hämatoxylin- und Eosinfleck (H&E) mit Hellfeldmikroskopie4,5überlegen. Mehrere Studien am Menschen mit Immunfluoreszenzmikroskopie identifizierten NETs als strukturelle Komponenten von koronaren arteriellen Thromben, zerebralen Schlaganfall-Thromben, Atherothrombose und venösem Thrombi13,14,15,16,17. Bis heute wurde eine standardisierte Methode zur Erkennung und Quantifizierung von NETs in Katzenthromben nicht beschrieben. Da die Identifizierung von NETs in transinenkardiinen arterienförmigen Thromben zukünftige translationale Forschung entolieren kann, beschreiben wir Techniken der NET-Identifikation und -Bewertung in paraffin-eingebetteten arteriellen Thromben bei Katzen.

<table><tbody><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Streptavidin-Konjugat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Katalog # S11227</td><td></td></tr><tr><td>Anti-citrullinierter Histon-H3-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Zellbildgebungssystem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEFC4300</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Imaging System Objektiv 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4681</td><td>NA 0,25, WD 6,9/7,45 mm</td></tr><tr><td>EVOS Imaging System Objektiv 20x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4682</td><td>NA 0,40, WD 6,8 mm</td></tr><tr><td>EVOS Imaging System Objektiv 40x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4699</td><td>NA 0,75, WD 0,72 mm</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 Antikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Katalog # A32723</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>Katalog # NC9660079. Herstellerteil # 005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Neutrophiler Elastase Antikörper</td><td>Bioss Antikörper</td><td>Bs-6982R-Biotin</td><td>Kaninchen polyklonaler Antikörper, Biotin konjugiert</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Pierce</td><td>Produkt # 28324. Los # EJ64292</td><td></td></tr><tr><td>Positiv geladene Objektträger</td><td>Thomas Scientific</td><td>Hersteller-Nr. 1354W-72</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchenserum</td><td>Life Technology</td><td>Katalog # 10510</td><td></td></tr><tr><td>Target Retrieval Solution</td><td>Agilent Dako</td><td>S2367</td><td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td></tr><tr><td>TrueVIEW Autofluoreszenz-Quenching Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung von neutrophilen extrazellulären fallen in paraffin-embedded feline arteriellen thrombi mittels immunfluoreszenzmikroskopie

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs), bestehend aus zellfreier DNA (cfDNA) und Proteinen wie Histonen und neutrophiler Elastase (NE), werden von Neutrophilen als Reaktion auf systemische Entzündungen oder Krankheitserreger freigesetzt. Obwohl NETs bisher gezeigt haben, dass sie die Gerinnselbildung verstärken und die Fibrinolyse bei Menschen und Hunden hemmen, ist die Rolle von NETs bei Katzen mit kardiogener arterieller Thromboembolie (CATE), einer lebensbedrohlichen Komplikation, die zur hypertrophen Kardiomyopathie sekundär ist. , ist unbekannt. Eine standardisierte Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von NETs in kardiogenen arteriellen Thromben bei Katzen wird unser Verständnis ihrer pathologischen Rolle in CATE fördern. Hier beschreiben wir eine Technik zur Identifizierung von NETs in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten Thromben innerhalb der Aortenverzweigung, die während der Nekropsie extrahiert wird. Nach der Deparaffinierung mit Xylol wurden Aortenschnitte indirekt wärmeinduzierte Antigenabrufungen unterzogen. Abschnitte wurden dann blockiert, permeabilisiert, und ex vivo NETs wurden durch Kolokalisierung von zellfreier DNA (cfDNA), citrulliniertem Histon H3 (citH3) und neutrophiler Elastase (NE) mittels Immunfluoreszenzmikroskopie identifiziert. Um die Immundetektion von NETs in Thromben zu optimieren, wurde die Autofluoreszenz von Gewebeelementen durch die Verwendung eines Autofluoreszenz-Quenching-Verfahrens vor der Mikroskopie eingeschränkt. Diese Technik könnte ein nützliches Werkzeug sein, um NETs und Thrombose bei anderen Arten zu studieren und bietet neue Einblicke in die Pathophysiologie dieses komplexen Zustandes.

Mit diesem Protokoll zur Deparaffinierung, wärmeinduzierten Antigenabruf ungegnet und doppelte Immunkennzeichnung von Paraffin-eingebettetem Thromben identifizierten wir neTs zum ersten Mal in feline CATE. Thrombi innerhalb der aortenigen Bifurkation wurden durch Fluoreszenzmikroskopie und Hellfeldmikroskopie mittels Standard-H&amp;E-Färbung und Phasenkontrastmikroskopie lokalisiert. Bei der Hellfeldmikroskopie bestand der transinale arterielle Thrombi aus roten Blutkörperchen, Leukozyten, Fibrin und Blutplättchen (<stro...

Wir beschreiben eine Methode zur Identifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten kardiogenen arterieogenen arteriellen Thromben mit wärmeinduziertem Antigen-Retrieval und einem doppelten Immunlabeling-Protokoll.

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Dieses Protokoll der Parafinisierung gefolgt von Antigen-Retrieval von Paraffin-eingebetteten Aortenschnitten kann ein nützliches Werkzeug sein, um die Rolle von neutrophilen trizellulären Fallen bei der Feinthrombose zu untersuchen. Der Nachweis von neutrophilen trizellulären Fallen durch Immunfluoreszenz in festem und paraffinintegriertem Gewebe ist konventionellen histologischen Stents wie HNE überlegen, da sie den gleichzeitigen Nachweis sicherer ERDNA und extrazellulärer Proteine ermöglichen. Dieses Protokoll kann in anderen Thrombentypen und in anderen Tierarten verwendet werden.Die Identifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen innerhalb der katzenarteriellen Thromben deuten darauf hin, dass sie bei Derene eine Rolle bei der Thrombose bei Katzen spielen können. Die hier vorgestellten Protokolle sind Leitlinien. Wir empfehlen den Ermittlern dringend, die Dauer und die Bedingungen des Antigen-Rückholvorgangs anzupassen, um ein zufriedenstellendes Signal zu liefern.Um ein automatisiertes System zur Deparaffinierung und Rehydrierung der Abschnitte auf Glasschlitten zu verwenden, legen Sie die Glasgletten in Regale. Drei Minuten lang vollständig in 100-prozentige Saline untertauchen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.Spülen Sie nicht zwischen den Schritten. Untertauchen Sie bei Raumtemperatur dreimal dreimal für jeweils drei Minuten vollständig in abnehmenden Ethanolkonzentrationen. Zwei Minuten lang vollständig in entionisiertes Wasser tauchen und noch einmal wiederholen.Nach der Behandlung mit TBST füllen Sie das Reservoir mit entionisiertem Wasser, das auf 100 Grad Celsius erhitzt wird. Lassen Sie die Dampfkammer für 20 Minuten ausdemieren. Auf einer Wärmeplatte die handelsübliche Antigen-Retrievallösung mit Tris und EDTA bei pH 9,0 bis 95 bis 97 Grad Celsius erhitzen.Stellen Sie sicher, dass es nicht kocht. Suberge die Gleitet vollständig in der beheizten Antigen-Retrieval-Lösung und setzen Sie den Einsatz der externen Heizung über den Dampfer für 20 Minuten. Als nächstes waschen Sie die Dias dreimal mit TBST für fünf Minuten.Platzieren Sie nun die Abschnitte in Blockierpuffer 1. Zwei Stunden bei Raumtemperatur unter sanftem Schaukeln zwischen 30 und 50 U/min inkubieren. Ohne Waschen, sofort 100 Mikroliter verdünnter Kaninchen polyklonal anti-human citrullinierter Histon H3 Antikörper direkt auf die Rutsche auftragen.Legen Sie auf jedem Abschnitt einen Abdeckzettel auf, um eine gleichmäßige Verteilung des Antikörpergemischs zu ermöglichen. 12 bis 16 Stunden bei vier Grad Celsius mit sanftem Schaukeln bebrüten. Danach waschen Sie die Dias dreimal mit TBST für jeweils fünf Minuten.Um Antikörper aufzutragen, verwenden Sie eine Pipette und verteilen Sie gleichmäßig 100 Mikroliter Ziegenanti-Kaninchen-Antikörper konjugiert alexa Fluor 488. Bedecken Sie die Dias mit Zinnfolie und bebrüten Sie die Dias eine Stunde bei Raumtemperatur unter sanftem Schaukeln. Nach dem Waschen mit TBST nach dem Manuskript, inkubieren die Abschnitte in Sperrpuffer 2 über Nacht bei vier Grad Celsius unter sanftem Schaukeln.Schützen Sie vor dem Licht. Waschen Sie mit TBST dreimal für jeweils fünf Minuten. Blockieren Sie die Abschnitte im Sperrpuffer 3 wie bisher bei Raumtemperatur für zwei Stunden unter sanftem Schaukeln.Inkubieren Sie die Abschnitte mit Biotin laded ployclonal Kaninchen anti-human entrophil elastase Antikörper bei vier Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden, wie zuvor beschrieben. Nach dem Waschen mit TBST inkubieren die Rutschen mit Alexa Fluor 594 Streptavidin Konjugat für eine Stunde bei Raumtemperatur. Danach einmal fünf Minuten mit TBST waschen.100 Mikroliter Autofluoreszense Quenching Lösungsmischung direkt auf die Abschnitte für eine Minute, wie vom Hersteller angewiesen. Waschen Sie die Dias sofort sechsmal für jeweils 10 Minuten mit TBST. Bedecken Sie jeden Schlitten mit 100 Mikrolitern 300 Nanomolar DAPI für fünf Minuten im Dunkeln.Dann mit TBST fünfmal für jeweils drei Minuten waschen. Tragen Sie einen Tropfen Antifade-Montagemedium direkt auf die Glasrutsche auf, die den Abschnitt umgibt. Legen Sie einen Deckelschlupf sanft auf den Abschnitt, ohne Blasen zu erzeugen.Lassen Sie die Proben über Nacht im Dunkeln bei vier Grad Celsius aushärten. Um Thrombi zu lokalisieren, scannen Sie kranially zu kauarisch entlang der Länge der Aorta, Aortenbifurkation und jeder femeralen Arterie mit Phasenkontrastmikroskopie mit einem 10-fachen Objektiv. Untersuchen Sie zunächst die Abschnitte auf zellfreie DNA mit dem DAPI-Kanal mit der Anregung bei 357 und 44 Nanometern.Identifizieren Sie extrazelluläre neutrophile Elastase und citrullinierte Histon H3 auf den texanischen roten und grünen fluoreszierenden Proteinkanälen. Halten Sie konsistente Belichtungszeit und Gewinne jedes Kanals während der gesamten Aufnahme von Bildern aufrecht, um eine Sättigung der Pixelintensität zu vermeiden. Neutrophile extrazelluläre Fallen werden identifiziert, basierende Kolokalisierung von neutrophiler Elastase, citrulliniertem Histon H3 und zellfreier DNA.Mit Hämatoxylin- und Eosinflecken und Hellfeldmikroskopie bestehen Katzenarterienthromben aus roten Blutkörperchen, Leukozyten, Fibrin und Blutplättchen. NETs erschienen als Netzwerke von tiefvioletten Fäden verschiedener Längen, die nahegelegene Erythrozyten und Leukozyten umgaben. Mit diesem Protokoll ergab die Immunfluoreszenzmikroskopie große Aggregate von NETs, die aus zellfreier DNA, extrazellulärzitrulliniertem Histon H3 und neutrophiler Elastase bestehen.Unter Phasenkontrast in der Immunmikroskopie wurde ein Thrombus als gut abgegrenzte Struktur im Gefäßraum charakterisiert. Thromben wurden jedoch in keiner der Kontrollproben nachgewiesen. Diese Abbildung zeigt eine tiefe Autofluoreszenz von Gerinnselelementen wie Erythrozyten, wenn sie bei der Wellenlänge von 488 Nanometern abgebildet werden.Kurze Autofluoresenabschreckung nach Derimmunodierung erhöhte die Empfindlichkeit von Protein-Co-Lokalisierung und NET-Nachweis auch in Gebieten mit einer Fülle von Erythrozyten signifikant. Die Dauer der Fixierung wirkt sich auf die Immunreaktivität bestimmter Antigene aus. Wir empfehlen eine Fixierung für nicht länger als 24 Stunden par die Dehydrierung und Paraffineinbettung.Alternativ kann methanolfreies Paraformaldehyd verwendet werden, um Artefakt durch Ameisensäure und Ketone durch Oxidation von Formaldehyd zu begrenzen. Um Interferenzen bei der Verwendung von Primärantikörpern derselben Spezies zu vermeiden, haben wir einen zusätzlichen Sperrschritt zur Sättigung aller verbleibenden Bindungsstellen an den sekundären Antikörpern aufgenommen. Die Forscher müssen Negativkontrollen umfassen, die aus Isotyp-Antikörpern, dem Ausschluss von Primärantikörpern und Immun-Labeling-Schritten und biologischen Kontrollen von Katzen ohne Thrombose bestehen.Die Autofluoreszenz von Gewebegrenzen von Thromben kann die mikroskopische Identifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen hämmern. Der Prüfer kann die Fluoreszenz durch den Einsatz von weitroten Fluorophoren minimieren. Diese Technik kann ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von neutrophilen extrazellulären Fallen in anderen Tierarten sein.Dies kann ein besseres Verständnis der Pathophysiologie der Thrombose bieten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind Netzwerke von DNA, Histone und Neutrophilen-Proteine. Obwohl eine Komponente der angeborenen Immunantwort sind NETs in Autoimmun- und Thrombose beteiligt. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Hunde- Neutrophilen Isolierung und Quantifizierung von NETs Mikrotiterplatten-Fluoreszenztest verwendet wird.

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Wir beschreiben Methoden zum isolieren eckzahn Neutrophils aus Vollblut und NET Bildung in live Neutrophilen mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu visualisieren. Protokolle, NET Bildung und citrullinierte Histon H3 zu quantifizieren sind auch beschrieben (citH3) Ausdruck mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind dreidimensionale Strukturen, die durch stimulierte neutrophile Granulozyten erzeugt werden. In den letzten Jahren hat sich herabimsiert, dass NETs an einer Vielzahl von Krankheiten beteiligt sind. Der Nachweis von NETs im Gewebe kann diagnostische Relevanz haben, daher sind standardisierte Protokolle für die Kennzeichnung von NET-Komponenten erforderlich.

Immunfluoreszenz-Kennzeichnung von humanen und murinen neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine sehr einfache Möglichkeit, Neutrophil Extracellular Traps (NETs) aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien zu isolieren. Dann zeigt, wie die isolierten Netze können in einem in vitro-Adhäsionstest mit Krebszellen verwendet werden.

Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung

Hier wurde eine Methode zur Lokalisierung von Bakterien in Paraffin-eingebetteten Geweben mit Hilfe von DIG-markierten 16S rRNA-Ziel-DNA-Sonden beschrieben. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um die Rolle von Bakterien bei verschiedenen Krankheiten wie Parodontitis, Krebs und entzündlichen Immunerkrankungen zu untersuchen.

In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA

Lipids sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle bei der zellulären Funktionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen, um zu bestimmen, wobei der Schwerpunkt auf dem Cholesterinspiegel, sowohl durch HPTLC und HPLC mit einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der neutrophilen extrazellulären Falle Bildung zu gewinnen.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Wir beschreiben hier ein Verfahren zum Erhalt und eine neu charakterisierte Subpopulation von Neutrophilen stammRiesenFressZellen zu identifizieren. Diese Zellen entwickeln sich in Kultur aus frischem menschlichem Blut Neutrophilen und werden durch Phagozytose, Autophagie, ungeheuer groß, und längere Lebensdauer aus. Diese Methode ist wesentlich zur Weiterentwicklung dieses einzigartigen Neutrophilen stamm Subpopulation untersuchen.

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten In Vitro

Makrophagen extrazelluläre fallen sind eine neu beschriebene Einheit. Dieser Artikel konzentriert sich auf Methoden der konfokalen Mikroskopie und wie sie sind visualisiert in Vitro und in Vivo aus Lunge Proben.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

Erfahren Sie die Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in katzenartigen arteriellen Thromben mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die verbesserte Visualisierung von NETs in paraffingebetteten Geweben.

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

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