Synthese funktionalisierter magnetischer Nanopartikel, deren Konjugation mit dem Siderophor Feroxamin und deren Bewertung für den Bakteriennachweis

Magnetische Nanopartikel sind aufgrund ihrer starken magnetischen Eigenschaften und der einfachen Funktionalisierung ihrer Oberfläche ideale Werkzeuge für die analytische Wissenschaft und Nanomedizin. Wir berichten hier über die erste Instanz eines Konjugats zwischen aminofunktionalisierten Kieselsäure-Magnetpartikeln und dem Siderophor feroxamin sowie der Auswertung für die Erfassung von photogenem Material. Siderophore sind kleine, organische Moleküle, die eine Schlüsselrolle im Eisenanteilmechanismus spielen, und sie werden von spezifischen äußeren Membranrezeptoren von Bakterien erkannt.

Dieses Video zeigt Schritt für Schritt ein effizientes Protokoll zur Herstellung magnetischer Eisen-Nanopartikel. Dann wurden sie mit Kieselsäure beschichtet, um die Dispersion zu schützen und den magnetischen Kern zu schützen. Die resultierende Reaktoroberfläche wurde mit Amingruppen funktionalisiert.

Synthese von magnetischen Nanopartikeln konjugiert mit Feroxamin. Fügen Sie 0,5 Gramm Fe(acac)3 in eine 20 ml Glasdurchstechflasche. Dann mit einem 10 ml Benzylalkohol mischen.

Beschallen Sie diese Mischung für 2 Minuten. Dann auf einen Heizblock übertragen und bei 180 Grad Celsius 72 Stunden erhitzen. Spülen Sie die Nanopartikel mit 96% Ethanol.

Und Zentrifuge für 30 Minuten. Trennen Sie die Nanopartikel vom Überstand durch magnetische Anziehung, mit einem Neodym-Magnet. Entsorgen Sie das Restlösungsmittel.

Entsorgen Sie den Überstand abwechselnd mit Beschallung, bis das Lösungsmittel klar aussieht. Bereiten Sie eine Suspension von 2 Gramm MNP in 80 Milliliter Isopropanol, fügen Sie 4 Milliliter 21%Ammoniak, 7,5 Milliliter destilliertes Wasser und 0,56 Milliliter TEOS. Erhitzen Sie die Mischung bei 40 Grad Celsius für 2 Stunden, mit kontinuierlichem Rühren.

Dann für 1 Stunde beschallen. Trennen Sie das MNP mit einem Magneten, entsorgen Sie den Überstand, dispergieren Sie ihn in 30 Milliliter Isopropanol, fügen Sie Ammoniak, destilliertes Wasser und TEOS in der zuvor beschriebenen Reihenfolge hinzu. Erhitzen Sie das Gemisch bei 40 Grad Celsius für zwei Stunden unter ständigem Rühren.

Dann für eine Stunde beschallen. Entfernen und waschen Sie bequem die magnetische Rührstange, um das gesamte Material wiederherzustellen. Entsorgen Sie den Überstand und spülen Sie die Nanopartikel dreimal mit 96% Ethanol ab, abwechselnd mit Beschallung.

Trocknen Sie die Nanopartikel unter Vakuum bei Raumtemperatur für 12 Stunden. Spülen Sie 500 Milligramm des MNP@SIO2 aus dem vorherigen Schritt mit Dimethylformamid gewonnen. Beschallen und entsorgen.

Die Partikel in einem rundum-Boden-Kolben wieder aufhängen, mit einem Magnetbalken umrühren und 9 Milliliter APTES hinzufügen. Rühren Sie die Mischung bei 60 Grad Celsius für 12 Stunden. Entsorgen Sie den Überstand und spülen Sie die Nanopartikel dreimal mit 96% Ethanol ab, abwechselnd mit Beschallung.

Lösen Sie 100 mg Deferoxamin, Mesylatsalz und 53,0 Milligramm Eisenacetylaceton in 5 Milliliter destilliertem Wasser auf. Rühren Sie die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur. Waschen Sie das resultierende Produkt dreimal mit 20 Milliliter Ethylacetat in einem Trenntrichter.

Entfernen Sie das organische Lösungsmittel unter Vakuum. Gefriertrocknen Sie die wässrige Phase, um sich Feroxamin und einen roten Feststoff zu leisten. Fügen Sie 350 Milligramm Bernsteinanhydrid zu einer Lösung von 100 mg Feroxamin in 5 Milliliter Pyridin in einem 50 Milliliter Rundbodenkolben hinzu.

Rühren Sie die resultierende Mischung bei Raumtemperatur 16 Stunden lang. Entfernen Sie den Überschuss von Pyridin unter reduziertem Druck. Lösen Sie die Reaktion roh in 3 Milliliter Methanol.

Die Methanollösung in eine LH-20-Säule übertragen und bei 0,5 ml/Minute löschen. Sammeln Sie die rote Fraktion und entfernen Sie das Methanol unter Vakuum. Spülen Sie 30 mg trockene Amin-funktionalisierte Nanopartikel zweimal mit DMF und beschallen Sie die Nanopartikel in einem 100 Milliliter Erlenmeyer Kolben für 30 Minuten.

Bereiten Sie eine Lösung von 200 Milligramm N-Succinylferoxamin, 173 Milligramm Benzotriazol 1-yl-oxy-tris-phosphonium hexafluorphosphat BOP, 46 mg 1-Hydroxybenzotriazol HOBt und 128,8 Milligramm N, N-Diisopropylethylamin DIPEA, in 10 ml DMF, in einem 50 Milliliter Rundkolbenkolben. Setzen Sie die zuvor gespülte MNP@SiO2@NH2 in einem 3 Milliliter DMF unter Beschallung unter trockenen und sauerstofffreien Bedingungen aus. Verwenden Sie Argon-Atmosphäre.

Fügen Sie, tropfenweise, mischen Sie A, um B.Shake die endgültige Mischung zu mischen, mit einem Orbital-Shaker, bei Raumtemperatur über Nacht. Trennen Sie das resultierende Konjugat mit einem Magneten von der Suspension. Bakterielle Assay mit Y.enterocolitica Stämmen, um die Isolierung und Erfassung von pathogenen Bakterien mit Nanopartikeln zu quantifizieren.

Bereiten Sie eine Suspension aller Zwischen-Nanopartikel und des Endkonjugats in PBS bei 1 mg/ml in sterilen Röhrchen vor. Bereiten Sie eine Kultur von Y.entorocolitica in 5 ml von Luria Bertani, LB, Brühe über Nacht. Bereiten Sie eine 5 ml Eisenmangel Trypcase Soy Broth, TSB, durch Zugabe von 50 Mikroliter von 10 mM 2, 2-Bipyridyl-Lösung.

Impfen Sie die 5 Milliliter Eisenmangel TSB Brühe mit 50 Mikroliter der Nachtkultur von Y.enterocolitica. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius mit Rührung, bis ein OD600 von 0,5 bis 0,8 erreicht ist. Nehmen Sie 100 Mikroliter der Nachtkultur und verdünnen Sie sie in einer Röhre mit 900 Mikroliter PBS, um die erste Verdünnung von 1/10 zu erhalten.

Bereiten Sie dann eine Verdünnung von 1/100 aus der ersten Verdünnung mit dem gleichen Verfahren vor, um eine Konzentration von Bakterienzellen bei 10 auf die Leistung von 6 Koloniebildeinheiten pro Milliliter ungefähr zu erhalten. Fügen Sie eine 100 Mikroliter Nanopartikel Suspension und 1 mg/ml zu 1 Milliliter der 1/100 Bakterien Verdünnung. Trennen Sie die MNP-Bakterienaggregate, indem Sie einen Magneten verwenden, den Überstand sorgfältig entsorgen.

Spülen Sie die abgetrennten Nanopartikel zweimal mit einem Millimeter PBS mit einem Wirbel. Bereiten Sie vier aufeinanderfolgende 1/10 Verdünnungen von der früheren Suspension, bis eine 10 bis zur Leistung von minus 4 Verdünnung. Platte 10 Mikroliter jeder Verdünnung auf TS Agarplatten.

Fotografieren Sie die Platte mit einem Gel-Digitalisierer im Epi-White-Modus. Verarbeiten Sie das Bild mit der praktischen Software, um einen Punkt zu verstärken, um die Anzahl der einzelnen Kolonien zu zählen. Um die Bildung der kovalenten Bindung zwischen den Nanopartikeln und dem Siderophor zu bestätigen, verwenden wir die FT-IR Raman Spektroskopie, um die Synthese zu überwachen und zu beobachten, wie neue Bänder in Übereinstimmung mit einer neuen funktionellen Gruppe in jedem Schritt erscheinen.

TEM- und SEM-Mikroskopie wurden verwendet, um die Morphologie und Partikelgröße zu beobachten. Thermogravimetrische Analyse zur Messung des Gewichtsverlusts durch Zugabe von organischem Material. Und XPS ermöglicht es uns, die verschiedenen Oxidationszustände der Atome in der Oberfläche zu analysieren und die Bildung kovalenter Bindungen zu bestätigen.

Schließlich haben wir alle Zwischenprodukte auf dem endgültigen Konjugat verwendet, um seine Fähigkeit zu testen, Bakterien zu fangen, um ihre Eigenschaften als Biosensor zu etablieren. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die hohe Biokompatibilität von Magnetit-Nanopartikeln zu nutzen. Die Beschichtung mit Kieselsäure verbessert die Dispersion und schützt den magnetischen Kern vor Abbau in wässrigen Medien.

Und geben Sie auch eine reaktive Oberfläche, um mit Amingruppen zu funktionalisieren, die notwendig sind, um ein säuremodifiziertes Siderophor durch Carbodiimid-Chemie kovalent zu binden. In diesem Fall, N-Succynilferoxamin. Die Fähigkeit zur Abscheidung von Konjugatbakterien wurde getestet und als Ergebnis wurde eine geringe Anzahl von Kolonien gefunden, ohne signifikanten Unterschied zu den Zwischenprodukten aufgrund einer spezifischen Wechselwirkung auf sperrige Effekte, die in der PBS-Bakteriensuspension dargestellt wurden.