Name: Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Differenzierung postganglionärer Sympathika-Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien Bedingungen. Diese Methode ermöglicht die Forschung zu autonomen Erkrankungen.

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Wir danken Heidi Ulrichs für die kritische Lektüre und Bearbeitung des Manuskripts.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir haben vor kurzem zwei Rezensionen veröffentlicht, eine, die die Verwendung von hPSC-abgeleiteten SymNs für die Krankheitsmodellierung31 sowie einen eingehenden Vergleich der verfügbaren Differenzierungsprotokolle22diskutiert. Daher konzentrieren wir uns hier auf die Fehlerbehebung des aktuellen Protokolls, um dem interessierten Forscher zu helfen, SymNs zu erstellen. Während des gesamten Differenzierungsprozesses sollte die Kontamination in allen Stadien sorgfältig kont...

Postganglionische sympathische Neuronen (SymNs) gehören zum autonomen Nervensystem (ANS) und haben mehrere wichtige Rollen bei der Reaktion und Regulierung der Homöostase des Körpers unabhängig vom Bewusstsein. Zum Beispiel stimuliert Stress SymNs und ruft die Kampf-oder-Flug-Reaktion hervor, die zu einer Erhöhung der Herzfrequenz, des Blutdrucks und des Schwitzens führt. SymNs sind bei mehreren menschlichen Störungen aufgrund von Genetik, Toxizität/Verletzung oder als Begleiter zu anderen Krankheiten betroffen. Ein Beispiel für eine genetische Neuropathie ist die Kindheitsstörung Familiäre Dysautonomie (FD), bei der eine schwere Dysregulation von SymNs eine dysautonome Krise verursacht, die durch Schwitzen, Ausblasen der Haut, Erbrechen, Bluthochdruck und Angst1offensichtlich wird. Ein Beispiel für Toxizität ist die Chemotherapie, die toxische Nebenwirkungen auf autonome2Neuronen 2 haben soll. Es ist bekannt, dass autonome Denervation und Hyper-Innervation sowohl zu Krankheiten wie Parkinson oder hypertensiveNierenerkrankung,4führen können, als auch zu begleiten. Daher ist es für die Suche nach neuartigen und wirksamen Behandlungen von Vorteil, die Mechanismen der SymN-Biologie und Defekte im Zusammenhang mit Krankheiten zu erforschen und zu verstehen.
Anatomie Das periphere Nervensystem verzweigt sich in sensorische und autonome Divisionen. Die affevollen Nerven des sensorischen Nervensystems sind für das Gefühl von Schmerz und Berührung verantwortlich, während das ANS für die Weitergabe von Informationen von allen Organen an das Gehirn verantwortlich ist. Das ANS ist in das enterische Nervensystem unterteilt, das den Magen-Darm-Trakt, das parasympathische Nervensystem, das für die Entspannung wichtig ist, und das sympathische Nervensystem (SNS), das für die Aktivierung/Regulierung von Organen wichtig ist. Das SNS passt ein Zwei-Neuron-System5an. Präganglionische sympathische neuronale Axone im Rückenmark projizieren zunächst auf die sympathischen Ganglien, wo sich postganglionische SymN-Zellkörper befinden. Diese Neuronen senden dann lange Projektionen, um das Zielgewebe jedes Organs im Körper zu innervieren. Signale, die von präganglionischen Neuronen übertragen werden, sind cholinerge, während postganglionische SymNs adrenerge sind und somit Noradrenalin (NE) als ihren wichtigsten Neurotransmitter ausdrücken. Es gibt nur wenige bemerkenswerte Ausnahmen von postganglionischen, sympathischen Neuronen, die cholinergisch sind, einschließlich derer, die die Blutgefäße innervierend bilden. Adrenergetische postganglonische Neuronen drücken die Enzyme Tyrosinhydroxylase (TH), aromatische L-Aminosäure-Decarboxylase (AAAD), Dopamin-Hydroxylase (DBH) und Monoaminoxidase (MAO-A) aus, die alle für die Erzeugung und Metabolisierung von NE verantwortlich sind. Darüber hinaus exprimieren sie die NE-Recycling-Transporter und/oder Rezeptoren a-adrenergen Rezeptor (ADRA2), den adrenergen Rezeptor (ADR2B), den Noradrenalin-Transporter (NET1) und den vesikulären Monoamin-Transporter (VMAT1/2).
Entwicklung Während der embryonalen Entwicklung werden SymNs aus dem Neuralkamm (NC) abgeleitet, der zwischen dem Neuralrohr und dem überlagernden Ektoderm6entsteht und sich in mehrere Zelllinien differenzieren kann, einschließlich Melanozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Glia, enterischen Neuronen, sensorischen Neuronen und autonomen Neuronen7. Neurale Kammzellen (NCCs) sind hochwandernde Zellen, die mehrere Wege durch den Embryo nehmen. In diesem frühen Stadium der NC-Entwicklung exprimieren die Zellen die Marker SNAIL1'2, FOXD3 und SOX108,9,10,11. Die Migrationsroute zusammen mit der axialen Position, die sie annehmen, bestimmt den NC-Subtyp, zu dem sie sich entwickeln werden. Diese NC-Subtypen lassen sich durch ihre spezifische HOX-Genexpression unterscheiden: Cranial NCCs exprimieren keine HOX-Gene, vagal-NCCs drücken HOX 1–5 aus, Trunk-NCCs drücken HOX 6–9 aus und sakrale NCCs drücken HOX 10–1112aus. Unter ihnen werden Trunk-NCCs als Hauptquelle von SymNs anerkannt. SymN-Vorläufer drücken den Transkriptionsfaktor MASH1/ASCL113aus, der die Expression von PHOX2B14 und INSM115fördert. Die GATA-Familie von Transkriptionsfaktoren kommt während der späten sympathischen Entwicklung zum Ausdruck. GATA2 und GATA3 werden in den SymNs ausgedrückt, was wiederum DBH16aktiviert. Der Transkriptionsfaktor HAND2 ist auch wichtig für die Expression und Wartung von DBH und TH17.
HPSCs (z. B. embryonale und induzierte pluripotente Stammzellen) sind ein leistungsfähiges Werkzeug18, um Entwicklungsparadigmen zu rekapitulieren und SymNs zu erzeugen, die dann zur Krankheitsmodellierung verschiedener menschlicher Störungen eingesetzt werden können. Daher ist es bei der Generierung von SymNs aus hPSCs von entscheidender Bedeutung, Entwicklungsrichtlinien zu befolgen und die Ausprägung geeigneter Marker entlang des Differenzierungsprozesses zu bewerten.
Vorheriges symN-Protokoll Nur wenige Forschungsgruppen haben bisher über die Generierung von SymNs aus hPSCs19,20,21berichtet. Der direkte Vergleich dieser Protokolle untereinander und unserer wurde vor kurzem22überprüft. Im Jahr 201623haben wir ein Differenzierungsprotokoll für die Erzeugung autonomer Neuronen mit SymN-Charakter veröffentlicht (Abbildung 1A). Dieses Protokoll verwendete KSR-basiertes Medium, das sowohl bei der Aufrechterhaltung undifferenzierter hPSCs als auch bei der Zelldifferenzierung verwendet wurde. Darüber hinaus wurden hPSCs auf embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF-Feederzellen) aufrechterhalten. Wir verwendeten dieses Protokoll und PSCs von Patienten mit FD, um die Störung23zu modellieren. Im Jahr 2019 haben wir eine detailliertere Version dieses älteren Protokolls24beschrieben. Zusammenfassend wurde das neuronale Schicksal durch die doppelte SMAD-Hemmung25 induziert, um die TGF-- und BMP-Signalisierung in den ersten 2 Tagen zu blockieren. Die WNT-Aktivierung mit CHIR99021 förderte neuronale Vorläufer zu NC-Zellen. Am 11. Tag wurden die Zellen nach FACS für CD49D+ oder SOX10+ Populationen26,23sortiert, was zu einer Effizienz von etwa 40 % NC-Erzeugung führte. Daher war eine Sortierung erforderlich, um die Effizienz und Reinheit für die nächsten Differenzierungsschritte zu gewährleisten. Die NCCs wurden mit der kombinierten Behandlung von FGF2 und CHIR als Sphäroide aufrechterhalten und verstärkt. Nach 4 Tagen wurden die NC-Sphäroide der Wartung plattiert und mit BDNF, GDNF und NGF versorgt, um die SymN-Reifung zu beenden. Obwohl diese SymNs starke SymN-Marker wie ASCL1, TH, DBH und PHOX2A exprimierten, waren Marker für reifere SymNs, einschließlich der Expression des Nicotinacetylcholin-Rezeptors (CHRNA3/CHRNB4) und des Vesikeltransporters (VMAT1/2), auch nach 70 Tagen Differenzierung niedrig. HOX-Gene in diesem Protokoll wurden nicht formal getestet, und reife neuronale Eigenschaften, einschließlich der elektrophysiologischen Aktivität der Zellen, wurden nicht überprüft.
Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll zur Generierung von SymNs vor (Abbildung 1B). HPSCs werden unter feederfreien Bedingungen auf vitronectin (VTN)-beschichteten Gerichten mit Essential 8 (E8) Medien27gehalten. Die Formel der Differenzierungsmedien wurde in jeder Phase geändert, wodurch der Prozentsatz der NC-Bevölkerungum 28erhöht wurde. Die SymN-Reifung kann auf CD49D+/SOX10+ sortierten oder unsortierten Massen-NCC-Populationen durchgeführt werden. Beide zeigen eine hohe SymN-Marker-Expression am 30. Tag. Darüber hinaus reagieren die mit diesem Protokoll erzeugten SymNs auf elektrophysiologische Aufzeichnungen und Auflagen mit SymN-Aktivator- und Inhibitorverbindungen.

<table><tbody><tr><td>100 mm Zellkulturschalen</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Gewebekulturröhrchen</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten mit extrem niedrigem Aufsatz</td><td>Corning</td><td>07 200 601 und 07 200 602</td><td></td></tr><tr><td>5 % CO2/20 % O2 Gewebekultur-Inkubator</td><td>Thermo Fisher/Life Technologien</td><td>Heracell VIOS 160i</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Gewebekulturröhrchen</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovation Cell Technologies</td><td>AT104500</td><td>Zelldissoziationslösung</td></tr><tr><td>Anti-AP2a-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab108311</td><td>Wirt: Kaninchen; Verdünnung</td></tr> <tr><td>1:400Anti-Ascl1-Antikörper</td><td>BD Pharmingen</td><td>556604</td><td>Wirt: Maus IgG1; 1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-CD49D Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>304313</td><td>Wirt: Maus IgG1; 5 &mu; l/Mio. Zellen in 100 μm; l Volumen</td></tr><tr><td>Anti-CD49D-Antikörper (Isotyp)</td><td>BioLegend</td><td>400125</td><td>Wirt: Maus IgG1; 5 &mu; l/Mio. Zellen in 100 μm; l Volumen</td></tr><tr><td>DAPI-Farbstoff</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-DBH Antikörper</td><td>Immunostar</td><td>22806</td><td>Wirt: Kaninchen; 1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>Wirt: Huhn; 1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-HOXC9 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab50839</td><td>Wirt: Maus; 1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-NET1 Antikörper</td><td>Mab</td><td>NET17-1</td><td>Wirt: Maus; 1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-PRPH Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-377093/H0112</td><td>Wirt: Maus IgG2a; 1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-SOX10 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365692</td><td>Wirt: Maus IgG1; 1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-TH Antikörper</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101-150</td><td>Wirt: Kaninchen; 1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td>Bestandskonzentration: 100 mM</td></tr><tr><td>B27 Ergänzung</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>Lagerkonzentration: 50x</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD</td><td>Bestandskonzentration: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td>Stammkonzentration: 6 mM</td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>Countess II</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählkammer</td><td>Objektträger Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>57021& 5424R</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R& D Systems</td><td>4423</td><td>Stammkonzentration: 6 mM</td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>dbcAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Stammkonzentration: 100 mM</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>Stammkonzentration: 1x</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>Stammkonzentration: 1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>E6 medium</td><td>gibco</td><td>A15165-01</td><td></td></tr><tr><td>E8 medium</td><td>gibco</td><td>A15169-01</td><td>Bestandskonzentration: 1x</td></tr><tr><td>E8 Ergänzung</td><td>gibco</td><td>A15171-01</td><td>Stammkonzentration: 50x</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td>Stammkonzentration: 0,5 M</td></tr><tr><td>Elektrophysiologische Platten (AXION cytoview MEA96)</td><td>Axion BioSystems</td><td>M768-tMEA-96W</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Maschine</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX (für FACS)</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Maschine</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios EQ (zum Sortieren)</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen (blaue Filterkappe)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen (weiße Kappe)</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450</td><td>Bestandskonzentration: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td>Basalmembran-Matrix; Stammkonzentration: 100x</td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Thomson et al., (1998)</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Oh et al. (2016)</td><td>H9-PHOX2B::eGFP</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Fibronektin (FN)</td><td>VWR/Corning</td><td>47743-654</td><td>Stammkonzentration: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher/Gibco</td><td>25030-081</td><td>Stammkonzentration: 200 mM</td></tr><tr><td>LN-Tank</td><td>Kundenspezifische biogene Systeme</td><td>V-1500AB</td><td></td></tr><tr><td>MEA Lesegerät</td><td>Axion BioSystems</td><td>Maestro Pro</td><td></td></tr><tr><td>Maus Laminin I (LM)</td><td>R& D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>Stammkonzentration: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>N2-Zusatz</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Stammkonzentration: 100x</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>gibco</td><td>21103-049</td><td>Stammkonzentration: 1x</td></tr><tr><td>NGF</td><td>PeproTech</td><td>450-01</td><td>Stammkonzentration: 25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>Stammkonzentration: 1x</td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithinhydrobromid (PO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>Stammkonzentration: 15 mg/mL</td></tr><tr><td>Primocin (Antibiotika)</td><td>InvivoGen</td><td>ANTPM1</td><td>Stammkonzentration: 50 mg/mL</td></tr><tr><td>qPCR-Gerät</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch</td><td></td></tr><tr><td>qPCR-Platten</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB/CF</td><td>Bestandskonzentration: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Stammkonzentration: 1 mM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris/R& D Systems</td><td>1614</td><td>Stammkonzentration: 10 mM</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Corning</td><td>MT-25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin (VTN)</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>A14700</td><td>Stammkonzentration: 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>VWR/Corning</td><td>706308</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td>Bestandskonzentration: 10 mM</td></tr></tbody></table>

effiziente differenzierung postganglionischer sympathika-neuronen mit humanen pluripotenten stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten kulturbedingungen

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) sind zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Krankheitsmodellierung und die Untersuchung der menschlichen embryonalen Entwicklung in vitro geworden. Zuvor haben wir ein Differenzierungsprotokoll zur Ableitung autonomer Neuronen mit sympathischem Charakter vorgelegt, das auf Patienten mit autonomer Neuropathie angewendet wurde. Das Protokoll wurde jedoch auf Knock Out Serum Replacement (KSR) und Feeder-basierten Kulturbedingungen aufgebaut, und um eine hohe Differenzierungseffizienz zu gewährleisten, war eine Zellsortierung erforderlich. Diese Faktoren verursachen eine hohe Variabilität, hohe Kosten und geringe Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus wurden reife sympathische Eigenschaften, einschließlich elektrischer Aktivität, nicht überprüft. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll, in dem PSC-Kultur und Differenzierung unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen durchgeführt werden. Genetische Marker, die den neuronalen Kamm des Stammes identifizieren, werden identifiziert. Eine weitere Differenzierung in postganglionische sympathische Neuronen wird nach 20 Tagen ohne Zellsortierung erreicht. Die elektrophysiologische Aufzeichnung zeigt die funktionelle Neuronenidentität weiter. Das aus unseren differenzierten Neuronen nachgewiesene Feuer kann durch Nikotin verstärkt und durch den adrenergen Rezeptor-Antagonisten Propranolol unterdrückt werden. Zwischensympathische neuronale Vorläufer in diesem Protokoll können als neuronale Sphäroide für bis zu 2 Wochen aufrechterhalten werden, was eine Erweiterung der Kulturen ermöglicht. Zusammenfassend zeigt unser aktualisiertes sympathisches Neuronendifferenzierungsprotokoll eine hohe Differenzierungseffizienz, eine bessere Reproduzierbarkeit, mehr Flexibilität und eine bessere neuronale Reifung im Vergleich zur vorherigen Version. Dieses Protokoll wird Forschern die Zellen zur Verfügung stellen, die notwendig sind, um menschliche Störungen zu untersuchen, die das autonome Nervensystem beeinflussen.

In diesem Protokoll geben wir Anweisungen, wie man SymNs von hPSCs generiert. Die hier gezeigten Kulturbedingungen wurden von einem früheren veröffentlichten Protokoll23,24 (Abbildung 1A) zu feederfreien und chemisch definierten Bedingungen ( Abbildung1B) verbessert. Es werden zwei Optionen angeboten, eine, bei der SymNs innerhalb von 20 Tagen hergestellt werden, und eine andere, in der die NCCs für 2 Wo...

In diesem Protokoll beschreiben wir eine stabile, hocheffiziente Differenzierungsstrategie für die Erzeugung postganglionischer sympathischer Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Dieses Modell wird Neuronen für die Verwendung von Studien zu multiplen autonomen Störungen zur Verfügung stellen.

Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Ableitung von sympathischen Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Diese Zellen werden es einem Wissenschaftler ermöglichen, menschliche Störungen zu untersuchen, die das sympathische Nervensystem beeinflussen. Diese Technik ermöglicht die Ableitung von sympathischen Neuronen in geteilten feederfreien Meetingbedingungen bei hoher skalierbarer Effizienz.Es führt zu elektrisch aktiven Neuronen in 20 Tagen. Diese Technik kann auf Krankheiten angewendet werden, die durch ein dysfunktionales sympathisches Nervensystem verursacht werden, es kann auch für die Modellierung von Krankheiten, regenerative Medizin und Arzneimittelscreening verwendet werden. Diese Zellen könnten in vitro verwendet werden, um jedes Gewebe innerhalb eines Co-Kultur-Systems zu innovieren, zum Beispiel für die Untersuchung der Herzgeweberegulation.Wenn die menschliche pluripotente Stammzellkultur 80 bis 90% Konfluenz erreicht, sollten große Kolonien mit glatten hellen Rändern beobachtet werden. Zum Aufspalten die Kultur mit PBS waschen, bevor Sie die Zellen mit vier Millilitern von 0,25 Molaren EDTA bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid behandeln. Nach zwei Minuten die Platte mit 10 Milliliterem E8-Medium spülen und die abgetrennte Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konusrohr übertragen.Dann 500 Mikroliter Zellen in ein 9,5 Milliliter Aliquot frisches E8-Medium übertragen. Und die Stammzellen auf neue vitronectin beschichtete 100-Millimeter-Schalen aufstellen. Einen Tag vor der Differenzierungsinduktion die entsprechende Anzahl von sechs Brunnenplatten mit zwei Millilitern Kellermembranmatrix pro Brunnen beschichten.Und die Teller über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Am nächsten Morgen die Teller auf Raumtemperatur erwärmen und die bereit, die menschliche pluripotente Stammzellkultur zweimal mit frischem PBS pro Wäsche zu teilen. Nach der zweiten Wäsche behandeln Sie die Zellen mit sieben Millilitern 0,5 Millimolar EDTA 15 Minuten lang im Zellkultur-Inkubator, bevor Sie die schwimmenden menschlichen pluripotenten Stammzellen anspornen und die geernteten Zellen in eine 50-Milliliter-Röhre übertragen.Fügen Sie dem Rohr ein gleiches PBS-Volumen hinzu, um die EDTA zu verdünnen und die Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Tag 01 Differenzierungsmedium aus, bevor Sie ein entsprechendes Mediumvolumen für die Buchhaltung hinzufügen. Verdünnen Sie die Zellen auf 1,25 mal 10 bis die fünfte Zelle pro Quadratzentimeter Konzentration in Milliliter Differenzierungsmedium pro Brunnen.Aspirieren Sie die gesamte Kellermembranmatrixlösung aus jedem Brunnen der zuvor auf sechs Wellplatten vorbereiteten Wellplatte. Dann säen Sie zwei Milliliter Zellen in jeden Brunnen und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Morgen füttern Sie die Zellen mit drei Millilitern Tag 01 Differenzierungsmedium pro Brunnen.Am zweiten Tag der Differenzierung, füttern Sie die Zellen mit drei Milliliter n. Tag zwei bis 10 Differenzierungsmedium pro Brunnen, dann füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag bis Tag 10. Um die neuralen Kammzellen zu Sphäroiden zu aggregieren, waschen Sie die Zellen am 10. Tag mit PBS. Und fügen Sie zwei Milliliter Dissoziationsmedium zu jedem Brunnen.Nach 20 Minuten im Zellkultur-Inkubator die schwimmenden Zellen in ein 50-Milliliter-Konusrohr übertragen und das Suspensionsvolumen in der Röhre mit frischem PBS auf 50 Milliliter erhöhen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Und setzen Sie das Pellet in einem ausreichenden Volumen von Tag 10 bis 14 Sphäroid medium zum Zählen wieder aus.Nach dem Zählen, verdünnen Sie die Zellen auf eine fünf mal 10 bis die fünfte Zelle pro 500 Mikroliter Konzentration mit Tag 10 bis 14 Sphäroid Medium. Und Platte 500 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen einer ultra niedrigen Befestigung 24-Well-Platte. Kehren Sie dann die Zellen an den Zellkultur-Inkubator zurück.Um eine minimale Sphäroidkultur zu induzieren, füttern Sie am 11. Tag der Kultur die neuralen Kammsphäroide mit zusätzlichen 500 Mikrolitern tag 10 bis 14 Sphäroidmedium pro Brunnen. Neigen Sie die Platte am 12. Tag, um die Sphäroide auf einer Seite der Platte anzusammeln. Und sorgfältig so viel Medium wie möglich aus jedem Brunnen ohne animierende Sphäroide aspirieren.Dann füttern Sie die Sphäroide mit einem Milliliter Tag 10 bis 14 Sphäroid Medium pro Brunnen. Um eine erweiterte Sphäroidkultur zu induzieren, füttern Sie am 15. Tag die Sphäroide mit 1,5 Millilitern Tag 10 bis 14 Sphäroidmedium, ergänzt mit 0,5 Mikromolar-Retinsäure pro Brunnen. Dann kehren Sie die Sphäroide an den Zellkultur-Inkubator zurück.Für eine sympathische Neuronendifferenzierung, am Tag 14 oder 28, kippen Sie die Platte, um die Sphäroide auf einer Seite der Platte zu akkumulieren und sorgfältig so viel Medium wie möglich zu aspirieren. Füttern Sie die Zellen mit einem Milliliter sympathischen Neuronmedium. Um große Sphäroidaggregate in kleinere Sphäroide aufzuteilen, fügen Sie nicht mehr als einen Milliliter Medium pro Brunnen hinzu und pipette die Sphäroide fünf bis zehn Mal vor dem Aufteilen.Und entfernen Sie das überschüssige Laminin-Fibronectin von zuvor vorbereiteten 24-Well-Platten. Teilen Sie die Platte einen Milliliter Sphäroide aus jedem Brunnen auf die 24-Wells Sphäroid-Kulturplatte zwischen vier separaten Brunnen der neu beschichteten 24-Well-Platte. Fügen Sie 250 Mikroliter frisches sympathisches Neuronmedium zu jedem Brunnen hinzu.Und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das Medium in jedem Brunnen durch einen Milliliter sympathischen Neuronmedium, ergänzt durch 0,125 Mikromolar-Retinsäure, und geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück. Nach Tag 35 füttern Sie die Neuronen, indem Sie sorgfältig nur die Hälfte des vorhandenen Mediums in jedem Brunnen durch frisches Medium ersetzen.Vor der Differenzierung sollten die menschlichen pluripotenten Stammzellkolonien mit glänzenden, glatten Kanten und wenig bis gar keiner Differenzierung rund sein. Die Zellen drücken den neuralen Kammmarker Sox10 von den Tagen vier bis zehn aus. Neurale Kammzellen entstehen in dichten abgedunkelten Graten, die ab dem sechsten Tag sichtbar sind.Diese Grate drücken auch Sox10 aus. Im Stadium der neuralen Kammzellen korreliert Sox10 mit dem Zelloberflächenmarker CD49D, der verwendet werden kann, um die neuralen Kammzellen zu sortieren. Positiv sortierte und unsortierte Populationen produzierten neurale Kammsphäride in ähnlicher Weise.Während negativ sortierte Zellen nicht richtig aggregieren, produzieren Sie keine runden, glatten, gesund aussehenden Sphäroide und sterben innerhalb von drei bis vier Tagen. Wenn an Tag 14 die quantitative Reverse-Transkriptase-PCR für neurale Kamm- und sympathische Nervenvorläufermarker verglichen wird, können signifikante Unterschiede zwischen den sortierten und unsortierten Zellen nicht nachgewiesen werden. Am 20. oder 35. Tag, den jeweiligen minimalen oder erweiterten Protokollen, können Neuroiden beobachtet werden, die in einem radialen Muster aus den beigefügten Sphäroiden wachsen.Marker im Zusammenhang mit Noradrenalin-Synthese und Transport werden in diesem Stadium ausgedrückt, sowie Hox6 durch neun Stamm neurale Kamm Gene. Elektrophysiologische Aufzeichnung erkennt auch neuronale Aktivität ab Tag 20. Solche Aktivität kann durch Medikamente verbessert oder unterdrückt werden, die Autorezeptoren von sympathischen Neuronen, die die Funktionalität von differenzierten Neuronen anpassen ziel.Der menschliche Befürworter selbst muss gesund sein, beginnend am Tag Null der Differenzierung, sonst wird das Experiment wahrscheinlich scheitern. Pharmakologische Inhibitoren oder Aktivatoren können den Neuronen hinzugefügt werden, um ihr normales oder pathologisches Verhalten zu verstehen. Diese Methode eröffnet einen neuen Weg für das Studium sympathischer Biologie und Pathologie, da es nun leicht möglich ist, Biopsien sympathischer Neuronen vom Menschen zu erhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Protokolle für die neuronale Differenzierung von pluripotenten menschlichen Stammzellen (hPSCs) sind oft zeitaufwendig und erfordern erhebliche Zellkultur Fähigkeiten. Hier haben wir ein kleines Molekül-basierte Differenzierung Verfahren zu einem multititre Plattenformat angepasst, die eine einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von menschlichen Nervenzellen in einer kontrollierten Art und Weise.

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Dieses Video demonstriert eine in vitro Methode zur Erzeugung postganglionärer sympathischer Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). hPSCs werden auf einem Basalmembranmatrixträger unter Verwendung eines Differenzierungsmediums zu Neuralleistenzellen (NCCs) differenziert. Die NCCs werden dann dissoziiert und unter Verwendung eines anderen Differenzierungsmediums zu Sphäroiden geformt. Schließlich werden die Sphäroide mit Hilfe eines sympathischen Neuronenmediums in...

Generierung postganglionärer sympathischer Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Dieses Video zeigt die Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus nicht-transgenen und transgenen humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). hPSCs werden unter Verwendung eines neuronalen Differenzierungsmediums zu neuralen Vorläuferzellen differenziert. Während die Differenzierung in nicht-transgenen Zellen mit kleinen Molekülen induziert wird, werden die transgenen hPSCs durch Zugabe eines Antibiotikums differenziert, das den Promotor für einen neuronalen differenzierungsspezifischen...

Differenzierung von nicht-transgenen und transgenen humanen pluripotenten Stammzellen in neurale Vorläuferzellen

Dieses Video zeigt den Prozess der Differenzierung menschlicher iPSCs in Motoneuronen. Die Begründung beinhaltet die Verwendung von iPSCs, die genetisch verändert wurden, um bestimmte Transkriptionsfaktoren zu exprimieren. Wenn dieses Antibiotikum in einem Medium kultiviert wird, das Doxycyclin enthält, löst es die Expression von Transkriptionsfaktoren aus und fördert dadurch die Differenzierung von iPSCs in Motoneuronen-Vorläuferzellen. Letztendlich werden die Vorläuferzellen in einem...

Differenzierung von künstlich hergestellten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen in funktionelle Motoneuronen

Wir, basierend auf Erkenntnissen aus der Entwicklungsbiologie und veröffentlichten Forschungsergebnissen, haben ein optimiertes Protokoll entwickelt, um effizient A9-Mittelhirn-dopaminerge Neuronen sowohl aus menschlichen embryonalen Stammzellen als auch aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, was für die Krankheitsmodellierung und Zellersatztherapie bei der Parkinson-Krankheit nützlich wäre.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Mit der Absicht, Veränderungen in miRNAs auf differenzierten humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) zu charakterisieren, beschreiben wir die hNSC-Differenzierung auf einem dreidimensionalen System, die Bewertung von Veränderungen in der microRNA-Expression durch miRNA-PCR-Arrays und computergestützte Analysen zur Vorhersage von miRNA-Zielen und deren Validierung durch duale Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Aussetzung und Kultivierung von neuronen menschlichen Stammzellen, die zuvor mehrere Wochen lang von neuronalen Vorläufern in vitro unterschieden wurden. Das Verfahren erleichtert bildgebende Assays von Neuriten, Synapsen und spät exemitten neuronalen Markern in einem Format, das mit Lichtmikroskopie und High-Content-Screening kompatibel ist.

Post-Differenzierung Replating von Human Pluripotent Stem Cell abgeleiteten Neuronen für High-Content Screening von Neuritogenese und Synapse Reifung

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Wir beschreiben eine Methode zur Differenzierung von vom Menschen induzierten pluripotenten Astrozyten und Neuronen des Rückenmarks und deren Kokultur für die elektrophysiologische Aufzeichnung.

Etablierung einer elektrophysiologischen Plattform zur Modellierung von ALS mit regionalspezifischen humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten und Neuronen

Die Ableitung von Abstammungslinien des enterischen Nervensystems (ENS) aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) bietet eine skalierbare Zellquelle zur Untersuchung der ENS-Entwicklung und -Krankheit sowie zur Verwendung in der regenerativen Medizin. Hier wird ein detailliertes in vitro Protokoll zur Gewinnung enterischer Neuronen aus hPSCs unter chemisch definierten Kulturbedingungen vorgestellt.

Differenzierung der Abstammungslinien des enterischen Nervensystems von humanen pluripotenten Stammzellen

Erfahren Sie die effiziente Differenzierung postganglionärer Sympathika-Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien Bedingungen. Diese Methode ermöglicht die Forschung zu autonomen Erkrankungen.

Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen (Video) | JoVE Journal

Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen

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