Name: Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen messen, um die Wirkung von Medikamenten auf den eIF4F-Komplex zu bewerten. Diese Methode unterstützt die Entwicklung gezielter Krebstherapien.

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HEK293 Zelllinie wurde für das Protokoll verwendet und wurde in Dulbecco modifizierte Adler Medium ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum, 2 mM L-Glutamin, und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5%CO2 in einer befeuchteten Umgebung kultiviert.
1. Quantitative Bewertung der komplexen Störung des eIF4F über eIF4E:eIF4G604-646 Complementation Assay
<ol><li>Zellkultur und transiente Transfektion von eIF4E:eIF4G604-646 Komplementierungstest<ol>
<li>Verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen mit weniger als 20 Passagen für alle Experimente. Bestimmen Sie am ersten Tag die Zellennummer mithilfe eines Standardzellenzählers, und zählen Sie die gesamten lebensfähigen Zellen mit der Trypan Blue Exclusion Methode13.</li>
		<li>Samen 6-Well-Platten mit 0,9 - 1,2 x 106 HEK 293 Zellen pro Brunnen in 2 ml Standardwachstumsmedium. HINWEIS: Um die beste Transfektionseffizienz innerhalb der oben angegebenen Zelllinien zu erreichen, stellen Sie sicher, dass die vergoldeten Zellen am Tag nach der Aussaat 70-90% konfluent sind.</li>
		<li>Am Morgen des 2. Tages werden Zellen mit SubA-eIF4E und eIF4G604-646-SubB-Plasmid mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) wie unten beschrieben, mittransfekt.<ol>
<li>Verdünnen Sie 9 l Liposomenlösung in einem Rohr, das 125 l reduziertes Serummedium ohne Phenolrot enthält (siehe Materialtabelle)für jede Transfektion und inkubieren Bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
			<li>Bereiten Sie den Master-Mix der DNA vor, indem Sie für jedes Transfektionsrohr 3 g jedes Plasmids in 125 l reduziertem Serummedium verdünnen.</li>
			<li>Fügen Sie dem DNA-Master-Mix-Rohr 12 l Enhancer-Reagenzien hinzu, mischen Sie sie gut und fügen Sie sofort die DNA hinzu: Enhancer Master-Mix zu jeder Tube verdünnter Liposomen im Verhältnis 1:1. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
			<li>Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 für 24 h.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Am Morgen des 3. Tages, spülen Sie jeden Brunnen mit 1 ml PBS.</li>
		<li>Entfernen Sie die PBS und inkubieren Zellen in jedem Brunnen mit 0,3 ml Trypsin für 5 min bei 37 °C.</li>
		<li>Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 2 ml des reduzierten Serummediums ohne Phenolrot, das 0% FCS in jedem Brunnen enthält, hinzufügen und transfizierte Zellen in ein 15 ml-Rohr übertragen. HINWEIS: Phenolrot kann die Luziferase-Aktivität stören; Daher müssen die Zellen von diesem Schritt an in Medium ohne Phenolrot behandelt werden.</li>
		<li>Zellen für 5 min bei 290 x g abdrehen und das Medium ansaugen. Setzen Sie die Zellen in 2 ml des reduzierten Serummediums ohne Phenolrot mit 0% FCS aus. Zählen Sie wie in Schritt 1.1 beschrieben.</li>
		<li>Samen transfizierte HEK 293 Zellen in 96 gut undurchsichtigen Platten mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Bohrkörper in 90 l Medium ohne Phenolrot, das 0% FCS enthält. Um 3 technische Replikationen innerhalb des gleichen Experiments für 3 verschiedene Verbindungen zu erhalten, säen 60 Brunnen der Platten mit Zellen, die die Brunnen an den Rändern ausschließen.</li>
		<li>Unmittelbar nach dem Aussaat der transfizierten Zellen 10 L mit 10 % DMSO-Verbindungslösung hinzufügen (siehe Schritt 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Compound-Vorbereitung<ol>
<li>Bereiten Sie 1 mM Compound-Aktienlösungen vor, indem Sie die Zinsverbindung in 100% DMSO (v/v) auflösen. Um 3 Replikationen für jede zusammengesetzte Titration zu erhalten, verwenden Sie 8 l der 1 mM Compound-Stammlösung. HINWEIS: Das Volumen von 1 mM Stammmasse verwendet wird, ist mehr als das, was es benötigt wird. Dies geschieht, um Pipettierfehler zu berücksichtigen, falls vorhanden.</li>
		<li>Führen Sie eine 2-fache serielle Verdünnung der Stammverbindungslösung mit 4 l des 1 mM-Bestands in 4 l von 100 % DMSO für jeden Titrationspunkt durch. HINWEIS: Für eine vollständige zusammengesetzte Titration führen Sie 9 serielle Verdünnungen aus dem Ausgangsbestand in 100% DMSO durch. Wenn mehrere Verbindungen getestet werden müssen, verwenden Sie eine 96-Well-Platte und eine Mehrkanalpipette, um diesen Schritt und nachfolgende Verdünnungen zu erleichtern.</li>
		<li>Fügen Sie für jeden Punkt der 2-fachen seriellen Verdünnung 36 l Sterilwasser der HPLC-Klasse hinzu, um eine 40-L-L-10-fache Arbeitslösung in 10 % DMSO (v/v) zu erstellen (d. h. 100 bis 0,39 M 10 % DMSO-Stammserie, die zu einer von 10 bis 0,039 M,in 1 % DMSO führt, wenn zellenzugesetzt wird). Wie für die Behandlungskontrolle, bereiten Sie auch eine 10% DMSO nur Lagerlösung in HPLC-Grade sterilen Wasser.</li>
		<li>Fügen Sie den Zellen in der 96 gut opaken Platte 10 l 10 l 10 l 10 l 10-L-Arbeitslösungen hinzu, um die beabsichtigte Endkonzentration mit einer Rest-DMSO-Konzentration von 1% (v/v) bei einem Gesamtvolumen von 100 l zu erzielen und 3 h bei 37 °C mit 5% v/v atmosphärischem CO2zu brüten.</li>
	</ol></li>
	<li>Luziferase-Komplementierung und Lebensfähigkeitstest<ol>
<li>Nach 3 h Arzneimittel herstellung das Luziferase-Substratreagenz durch Kombination von 1 Volumen Substrat mit 19 Volumen des Verdünnungsreagenzes (siehe Herstelleranleitung). HINWEIS: Der Luziferase-Test wird mit einem handelsüblichen Kit durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um sofort 25 L Substratreagenz hinzuzufügen.</li>
		<li>Schütteln Sie die Platte bei 350 Umdrehungen von Euro/ Mittel 50 min auf einem Orbital-Shaker bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Bewerten Sie die Lumineszenz mit einem Plattenleser. Stellen Sie dazu den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 455. Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 mm mit einer Messzeit von 1 s.</li>
		<li>Um die Zelllebensfähigkeit zu beschwichtigen, fügen Sie 33 L des Lebensfähigkeits-Assay-Reagenz hinzu und messen Sie dann die Lumineszenz nach 15 min bei Raumtemperatur mit dem Plattenleser erneut.</li>
		<li>Bewerten Sie die Lumineszenz mit dem Plattenleser, indem Sie den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 600 nm einstellen. Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 mm mit einer Messzeit von 1 s. HINWEIS: Die Lebensfähigkeit wird durch Messung des intrazellulären ATP-Spiegels bei der Zelllyse gemäß den Anweisungen des Herstellers beurteilt. Multiplexing ist in diesem Fall möglich, da der Lebensfähigkeitstest eine andere Luziferase mit einer anderen Emissionswellenlänge verwendet.</li>
		<li>Verwenden Sie die Daten, um die IC50-Werte jeder Verbindung durch Kurve zu bestimmen, die die Daten an eine 4-Parameter-Anpassungskurvengleichung anpasst: Y = ((A-D)/(1+((x/C)))) + D Die numerischen Werte D und A müssen im Kurvenanpassungsprozess eingeschränkt werden: D = Leuchtwert auf der Y-Achse für minimale Kurvenasymptote oder minimale theoretische Reaktionsstufe, die vom eIF4E:4G-Komplementierungstest erwartet wird. A = Lumineszenzwert auf der Y-Achse für maximale Kurvenasymptote oder maximale theoretische Antwortvariablen, die vom eIF4E:4G-Komplementierungstest erwartet werden. ANMERKUNG: Der Wert für die minimale Reaktion wird aus der 1% DMSO (v/v) Kontrollbehandlung abgeleitet, und der Wert für die maximale Reaktion wird von der maximalen Reaktion eines mTOR-Inhibitors mit hoher Affinität abgeleitet, der ohne Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit plateaued hat.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Korrelierende eIF4E:eIF4G604-646 Assay-Hemmung mit eIF4F-komplexer Störung in Zellen
<ol><li>Um zu bestätigen, dass das vom Test gemessene Signal der physikalischen Störung der eIF4E-eIF4G-Wechselwirkung durch die Verbindung, Samenzellen, wie in Schritt 1.1 beschrieben, entspricht.</li>
	<li>Ersetzen Sie am Tag danach das Medium durch 1 ml reduziertes Serummedium, das kein Phenolrot enthält, und brüten sie 4 h durch die Verbindung von Interesse. Stellen Sie eine Rest-DMSO-Konzentration von 1% (v/v) bei einem Gesamtvolumen von 1 ml sicher. ANMERKUNG: Um eine Korrelation mit dem Ergebnis zu ermöglichen, verwenden Sie zusammengesetzte Konzentrationen am Anfang, Mittelpunkt und Endpunkt der gemessenen Komplementierungs-Assay-Titrationskurve.</li>
	<li>Lyse-Zellen und durchgeführt m7GTP ziehen nach unten, um eIF4F und eIF4E:4EBP1 Komplexe zu isolieren. Detaillierte Verfahren zur Durchführung des m7GTP Pull-Down-Experiments finden Sie an anderer Stelle14.</li>
	<li>Detektieren Sie m7GTP-gebundene eIF4G-, eIF4E- und 4EBP1-Proteinspiegel durch Western-Blot-Analyse und korrelieren Sie dann mit eIF4F-komplexer Störung mit Komplement-Assay-Signalhemmung.</li>
</ol>

<ol><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanism+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li>
<li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+translation+machinery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li>
<li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex%3A+a+critical+nexus+for+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li>
<li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis%3A+the+role+of+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li>
<li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF4E%3A+A+retrospective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li>
<li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li>
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<li>Grüner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li>
<li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
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<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).</li>
<li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1%3A+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li>
<li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Translation%22%5BJournal%5D)">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819(2013).</li>
<li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40(2019).</li>
<li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+protein-protein+interactions+%28PPIs%29%3A+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die in diesem Artikel beschriebene Methode nutzt einen luziferase-basierten Komplementierungstest zur quantitativen Überwachung der komplexen EIF4F-Montage durch direkte Messung der eIF4G-eIF4E-Interaktion in lebenden Zellen. Wir haben Einzelheiten für die Verwendung des eIF4E-eIF4G-Komplementierungssystems zur Verfügung gestellt und auch gezeigt, dass das System bei der Messung der medikamentös induzierten 4EBP1-vermittelten Dissoziation der eIF4E-eIF4G-Interaktion16extrem genau ist. Um den Durch...

Die Kontrolle der Genexpression spielt eine zentrale Rolle bei der korrekten Ausführung zellulärer Programme wie Wachstumsproliferation und Differenzierung. Ein regulatorischer Kontrollmechanismus kann entweder auf der Ebene der Gentranskription oder auf der Ebene der mRNA-Translation ausgeübt werden. In den letzten zehn Jahren ist es immer offensichtlicher geworden, dass die translationale Kontrolle durch Modulation des Initiationsprozesses und nicht durch die späteren Schritte der Dehnung und Beendigung die Synthese bestimmter Teilmengen von Proteinen, die eine breite Palette biologischer Funktionen spielen, fein regulieren kann.
Erhöhte Übersetzung von mRNAs, die am Überleben beteiligt sind, antiautophagische und anti-apoptotische Reaktionen wurden in mehrere Krebsarten verwickelt und wurden auch ursächlich mit der abnormen Aktivierung oder dem Ausdruck von Translationsinitiationsfaktoren in Verbindung gebracht1.
Der eIF4F-Komplex ist ein Master-Regulator der Übersetzungsinitiierung. Durch die Bindung der Cap-Struktur am 5' Ende von mRNAs treibt eIF4F die anfängliche mRNA-ribossome Rekrutierung voran und erhöht damit die mRNA-Translationseffizienz von schwach übersetzten eukaryotischen mRNAs2. EIF4F vermittelte Übersetzung von krebsbedingten mRNAs wurde für viele Krebsmodelle berichtet, die eine abnorme Aktivierung von RAS/MAPK- oder AKT/TOR-Signalwegen beherbergen, was darauf hindeutet, dass Krebszellen eIF4F hochregulieren, um ihre eigene proneoplastische Aktivität zu steigern. Die Störung dieser Einspeiseschleife durch Hemmung der eIF4F-Komplexbildung ist damit eine sehr vielversprechende therapeutische Strategie3,4.
Der eIF4F-Komplex besteht aus (i) eIF4E, der kappenbindenden Untereinheit von eIF4F, die mit der Cap-Struktur der 5' UTR von mRNA interagiert, (ii) eIF4A, dem RNA-Helicase und (iii) eIF4G, dem Gerüstprotein, das sowohl mit eIF4A als auch mit eIF4E interagiert und schließlich die 40S-Riboso-Subunit5rekrutiert. EIF4G-Assoziation mit eIF4E ist der preisbegrenzende Schritt für die Montage funktioneller eIF4F-Komplexe und wird durch die eIF4E-bindenden Proteine (4EBPs, Mitglieder 1, 2 und 3)negativ reguliert. Durch den Wettbewerb mit eIF4G-Bindung an eIF4E über eine Schnittstelle, die aus kanonischen und nicht-kanonischen eIF4E-Bindungssequenzen7,8,9 (Region aa 604-646 auf Human eIF4E) besteht, reduziert 4EBP den Pool von eIF4E, der aktiv an der Übersetzung und Der Verhinderung von eIF4F-Komplexbildung beteiligt ist. Das Zusammenspiel dieser Protein-Protein-Wechselwirkungen wird hauptsächlich durch das Säugetierziel der rapamycin (mTOR)-vermittelten Phosphorylierung von 4EBP reguliert. Bei mitogenen Reizen phosphorisiert mTOR die Mitglieder der 4E-BP-Proteinfamilie direkt, verringert ihre Verbindung mit eIF4E und fördert damit die EIF4E-eIF4G-Interaktion und die Bildung funktioneller eIF4F-Komplexe10.
Trotz der großen Anstrengungen bei der Entwicklung von Verbindungen, die auf die komplexe Integrität von eIF4F abzielen, hat das Fehlen von Assays zur Messung der direkten Störung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen die Suche nach zellulären aktiven Schlagverbindungen eingeschränkt. Wir haben einen Luziferase-Assay auf Basis eines Coelenterazin-Analogas (z. B. Nanoluc-basierter Komplementierungs-Assay) angewendet, um den Status der eIF4F-Integrität durch die eIF4E-eIF4G-Interaktion in Echtzeit zu überwachen. Das Luziferase-Komplementierungsproteinsystem besteht aus einem 18 kDa-Proteinfragment (SubA) und 11 Aminosäure-Peptidfragment (SubB), das für minimale Selbstassoziation und Stabilität optimiert ist11. Einmal als Fusionsprodukt mit dem menschlichen EIF4E und der eIF4E-Interaktionsdomäne aus dem menschlichen eiF4G1 (aa 604-646) ausgedrückt, werden die beiden interagierenden Proteine das SubA- und SubB-Fragment in die Nähe voneinander bringen und die Bildung der aktiven Luziferase induzieren, die in Gegenwart eines zelldurchlässigen Substrats schließlich ein helles Leuchtsignal erzeugen wird (Abbildung 1). Wir haben an anderer Stelle über den Bau und die Validierung des EIF4E:eIF4G604-646 Ergänzungssystems16berichtet.
Hier beschreiben wir, wie das komplementäre System eIF4E:eIF4G604-646 (auf Anfrage erhältlich) angewendet werden kann, um 4EBP1-vermittelte eIF4E-eIF4G-Störungen in lebenden Zellen genau zu messen. Darüber hinaus zeigen wir seinen Nutzen, indem wir die Wirkung mehrerer mTOR-Inhibitoren messen, die sich derzeit in klinischen Studien als potenzielle Krebstherapeutika befinden12. Da Off-Target-Effekte oft die medikamentöse Aktivität verschleiern, beschreiben wir auch, wie die Vielseitigkeit der EIF4E:eIF4G604-646 Systemmessung mit orthogonalen Messungen der zellulären Lebensfähigkeit erweitert werden kann, um diese zu berücksichtigen.

<table><tbody><tr><td>293FT Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur Mikroplatte 96 Well, F-Bottom</td><td>Greiner bio-one</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>Zelltiter Glo 2.0</td><td>PROMEGA</td><td>G9241</td><td></td></tr><tr><td>Envision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>nicht anwendbar</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Mehrkanalpipetten 12-Kanäle 30-300 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Mehrkanalpipetten 12 Kanäle 5-50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662050</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE6</td><td>PROMEGA</td><td>E2692</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI Starter Systems</td><td>PROMEGA</td><td>N2014</td><td></td></tr><tr><td>Optimem I Reduced Serum Mediun, kein Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>nicht anwendbar</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-155S</td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung der eif4f-montage durch messung der eif4e-eif4g-interaktion in lebenden zellen

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Die Bildung des eIF4F-Komplexes hat sich als der wichtigste nachgeschaltete Knoten für die Konvergenz von Signalsignalen erwiesen, die häufig beim Menschen onkoogene Aktivierung erfahren. eIF4F ist ein Cap-Bindungskomplex, der an der mRNA-ribossomeRekrutierungsphase der TranslationInitiation beteiligt ist. In vielen zellulären und präklinischen Krebsarten führt die Deregulierung von eIF4F zu einer verstärkten Übersetzung spezifischer mRNA-Teilmengen, die an der Proliferation und dem Überleben von Krebs beteiligt sind. eIF4F ist ein heterotrimerkomplex, der aus der Kappenbindungs-Untereinheit eIF4E, dem Helicase eIF4A und der Gerüstuntereinheit eIF4G gebaut wurde. Entscheidend für die Montage aktiver eIF4F-Komplexe ist die Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen eIF4E- und eIF4G-Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der eIF4F-Assembly, das den Status der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen überwacht. Der eIF4e:4G zellbasierte Protein-Protein-Interaktionstest ermöglicht auch eine genaue und zuverlässige Bewertung medikamentös induzierter Veränderungen in der komplexen Integrität von eIF4F. Wir stellen uns vor, dass diese Methode zur Überprüfung der Aktivität kommerziell erhältlicher Verbindungen oder zum weiteren Screening neuartiger Verbindungen oder Modalitäten angewendet werden kann, die die Bildung des eIF4F-Komplexes effizient stören.

Um die Empfindlichkeit des Komplementierungssystems eIF4E:eIF4G604-646 zu validieren, wurde die 4EBP1-vermittelte Hemmung der eIF4F-Komplexbaugruppe mit mTOR-Inhibitoren bewertet. Durch hemmende mTORC1-Kinase-abhängige Phosphorylierung der 4EBP-Proteinfamilie verbessert die mTOR-Hemmung die 4EBP1-Assoziation mit eIF4E und damit eIF4F-Demontage15. Es wurden zwei Klassen mechanistisch unterschiedlicher MTOR-Kinasen getestet: Rapalogs (z.B. Rapamycin), die ...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen vor, das es dem Anwender ermöglichen würde, die medikamentöse Störung der komplexen EIF4F-Dynamik in Screening-Formaten zu bewerten.

Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Die Regulation der Signalgebung des eIF4F-Komplexes ist mit einer erhöhten Translation von mRNA-Untergruppen verbunden, die an der Proliferation und dem Überleben von Krebs beteiligt sind. Hier beschreiben wir einen eIF4E-eIF4G-zellbasierten Protein-Protein-Interaktionsassay, der es uns ermöglicht, die medikamenteninduzierte Störung der Integrität des eIF4F-Komplexes in lebenden Zellen zu bewerten. Es besteht ein wachsendes Interesse an der Entwicklung von Modalitäten, die effizient auf die Protein-Protein-Schnittstelle abzielen.Wir haben uns vorgestellt, dass unsere eIF4E-eIF4G PPI-Assays dazu beitragen werden, diese Strategien zu fördern und zu validieren. Dieser Assay wird ein optimales primäres Schema für die Optimierung von eIF4E-eIF4G-Inhibitoren liefern. Die korrekte Aussaat der Zelle und die Durchführung der Transfertransfektion sind der schwierigste Aspekt dieses Produkts, da sie sich direkt auf die Unterdrückung des PPI-Berichtssystems auswirken können.Nach dem Auftauen und Zählen der Zellen 6-Well-Platten mit HEK 293-Zellen mit 2 Millilitern Standard-Wachstumsmedium pro Vertiefung bepflanzen. Am Morgen des 2. Tages verdünnen Sie für jede geplante Transfektion 9 Mikroliter Lösung auf Liposomenbasis in einem Röhrchen mit 125 Mikrolitern reduziertem Serummedium ohne Phenolrot. Während die verdünnten Liposomen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, bereiten Sie den Mastermix der DNA vor, indem Sie 3 Mikrogramm jedes Plasmids in 125 Mikrolitern reduziertem Serummedium für jedes Transfektionsröhrchen verdünnen.Geben Sie 12 Mikroliter Enhancer-Reagenzien in den DNA-Mastermix 2 und mischen Sie dann gut. Geben Sie diese Mischung sofort in jedes Röhrchen mit verdünnten Liposomen im Verhältnis 1 zu 1. Nachdem Sie diesen DNA-Lipidkomplex 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, geben Sie den Komplex in jede Vertiefung der 6-Well-Platten.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Spülen Sie am Morgen des 3. Tages jede gut mit 1 Milliliter PBS aus und fügen Sie 0,3 Milliliter Trypsin hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 5 Minuten.Nach der Inkubation neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 2 Milliliter des reduzierten Serummediums ohne Phenolrot in jede Vertiefung geben. Übertragen Sie die transfizierten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 290x G.Aspirieren Sie das Medium und suspendieren Sie das Zellpellet in 2 Millilitern des reduzierten Serummediums. Die transfizierten HEK 293-Zellen werden in undurchsichtigen 96-Well-Platten mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Well in 90 Mikrolitern Medium ausgesät. Um 3 technische Replikate für 3 verschiedene Verbindungen innerhalb desselben Experiments zu erhalten, säen Sie 60 Vertiefungen.Schließen Sie die Vertiefungen an den Rändern aus. Unmittelbar nach dem Aussäen der transfizierten Zellen geben Sie 10 Mikroliter 10%ige DMSO-Verbindungslösung in jede Vertiefung. Bereiten Sie 1 Millimolar zusammengesetzte Stammlösungen vor, indem Sie jede interessierende Verbindung in 100 % DMSO auflösen.Um 3 Replikate für jede Verbundtitration zu erhalten, verwenden Sie 8 Mikroliter der 1 Millimolar zusammengesetzten Stammlösung. Führen Sie eine zweifache serielle Verdünnung jeder Stammlösung in 8 Vertiefungen einer 96-Well-PCR-Platte durch, indem Sie 4 Mikroliter des 1 Millimolar Stamm in 4 Mikroliter 100 %DMSO für jeden Titrationspunkt pipettieren. Entsorgen Sie die überschüssigen 4 Mikroliter nach dem letzten Punkt der zweifachen seriellen Verdünnung.Geben Sie 36 Mikroliter steriles Wasser in HPLC-Qualität in jedes Röhrchen, um 40 Mikroliter 10x Compound Serial Dilution Solutions in 10% DMSO herzustellen. Bereiten Sie außerdem ein Steuerelement vor. 10%DMS nur Stammlösung in sterilem Wasser in HPLC-Qualität.Geben Sie 10 Mikroliter 10x Arbeitslösungen zu den Zellen in der undurchsichtigen 96-Well-Platte, um die beabsichtigte Endkonzentration zu erhalten, mit einer verbleibenden DMSO-Konzentration von 1 %Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 3 Stunden. Beginnen Sie nach 3 Stunden mit der Vorbereitung des Luciferase-Substratreagenzes, indem Sie 1 Volumen des Substrats mit 19 Volumen des Verdünnungsreagenzes kombinieren. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um sofort 25 Mikroliter des Substratreagenzes in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit den Zellen zu geben.Schütteln Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler bei 350 U/min 50 Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Lumineszenz zu beurteilen, legen Sie die Platte auf ein Plattenlesegerät. Stellen Sie den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 455.Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 Millimetern mit einer Messzeit von 1 Sekunde. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen, geben Sie 33 Mikroliter Reagenz für den Viabilitätsassay in jede Vertiefung. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur beurteilen Sie die Lumineszenz mit dem Plattenleser, indem Sie den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 600 einstellen.Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 Millimetern und eine Messzeit von 1 Sekunde. Verwenden Sie die Daten aus dem Plattenlesegerät, um den IC 50-Wert jeder Verbindung zu bestimmen, indem Sie die Daten an die im Manuskript beschriebene 4-Parameter-Anpassungskurvengleichung anpassen. HEK 293 Zellen wurden mit dem eIF4E-eIF4G-Komplementationssystem transfiziert, dann zurückgebildet und mit mTOR-Inhibitoren behandelt.Wenn die Lumineszenz 4 Stunden nach der Behandlung bestimmt wurde, führten PP242 und Rapamycin beide zu einer dosisabhängigen Hemmung des Signals. Weder PP242 noch Rapamycin führten zu einer signifikanten Abnahme der Zellviabilität, was darauf hindeutet, dass die Abnahme der Lumineszenz im eIF4E-eIF4G-Komplementationssystem nicht auf einen unspezifischen Zelltod, sondern auf eine Störung der EIF4E-4G-Wechselwirkung zurückzuführen ist. Die Western-Blot-Analyse nach dem m7GTP-Pulldown-Experiment zeigte, dass die durch 4EBP1 vermittelte Störung der endogenen eIF4E-eIF4G-Interaktion mit dem gemessenen eIF4E-eIF4G-Assay-Signal korreliert.PP242 war ein wirksamerer Inhibitor der Gesamt-4EBP1-Phosphorylierung als Rapamycin. Beide Inhibitoren zeigten einen normalen Einfluss auf die mTOR-Signalgebung, wobei Rapamycin aktiver gegen mTORC1-Substrate war und PP242 sowohl auf mTORC1 als auch auf mTORC2 abzielte. Der kritischste Aspekt dieses Produkts ist die Aussaat der Zellen am Tag der Transaktion, die erneute Aussaat der Zellen in einem Medium ohne Phenolrot, die Bewertung der Lumineszenz des eIF4E-eIF4G-Komplementationsassays und die Durchführung des Viabilitätsassays auf derselben Platte.Ein sekundärer Viabilitätsassay kann durchgeführt werden, um jedes Medikament mit Ziel- und bekannten spezifischen Wirkungen zu bewerten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

Tandem Affinitätsreinigung ist ein robustes Verfahren zur Identifizierung von Protein Bindungspartner. Als Proof of Concept wurde die Methode auch auf die gut charakterisierte Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu Copräzipitat der Wirtszelle Faktoren in Initiation der Translation beteiligt angewendet. Dieses Verfahren ist einfach einem der zellulären oder viralen Proteins.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Technik für die Echtzeit-Überwachung der Signalwege in lebenden Zellen mit verschiedenen Biosensoren als Reporter. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus handelsüblichen Komponenten und wie es zu benutzen für Experimente FRET.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

SILAC Immunpräzipitationsexperimenten stellt ein wirksames Mittel zur Entdeckung neuer Protein-Protein-Interaktionen. Dadurch, dass die genaue relative Quantifizierung von Protein Hülle und Fülle in den Kontroll-und Testproben, true Wechselwirkungen können leicht von experimentellen Verunreinigungen unterschieden werden, und niedriger Affinität Wechselwirkungen durch die Verwendung von weniger strengen Pufferbedingungen erhalten.

Identifizierung von Protein-Interaktionspartner in Säugetierzellen mit SILAC-Immunpräzipitation Quantitative Proteomics

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Hier beschreiben wir ein Verfahren, das eine detaillierte Analyse der phosphorylierungsabhängigen Aktivierung des IRF3-Transkriptionsfaktors ermöglicht. Dies wird durch die Kombination einer hochauflösenden SDS-PAGE und einer nativen PAGE erreicht, die mit Immunoblots unter Verwendung mehrerer phosphospezifischer Antikörper gekoppelt ist.

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

Hier präsentieren wir menschliche Zellkulturprotokolle zur Analyse von Translationsinitiationsfaktoren, die die 5'-Kappe von mRNA unter physiologischen Sauerstoffbedingungen binden. Diese Methode verwendet ein Agarose-gebundenes m7GTP Kappenanalogon und eignet sich zur Untersuchung von Kappenbindungsfaktoren und deren interagierenden Partnern.

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Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die räumlich-zeitliche Dynamik der Akt-Aktivierung und Phosphorylierung in lebenden HepG2-Zellen zu quantifizieren. Die Förster-Resonanzenergietransfer-Bildgebung (FRET) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das wertvolle Einblicke in die Insulinsignalwege und die Stoffwechselregulation in Krebszellen liefert.

Lebendzell-Förster-Resonanz-Energietransfer-Bildgebung der metabolisch regulierten Akt-Aktivierungsdynamik in HepG2-Zellen

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Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen

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