Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen

Die Regulation der Signalgebung des eIF4F-Komplexes ist mit einer erhöhten Translation von mRNA-Untergruppen verbunden, die an der Proliferation und dem Überleben von Krebs beteiligt sind. Hier beschreiben wir einen eIF4E-eIF4G-zellbasierten Protein-Protein-Interaktionsassay, der es uns ermöglicht, die medikamenteninduzierte Störung der Integrität des eIF4F-Komplexes in lebenden Zellen zu bewerten. Es besteht ein wachsendes Interesse an der Entwicklung von Modalitäten, die effizient auf die Protein-Protein-Schnittstelle abzielen.

Wir haben uns vorgestellt, dass unsere eIF4E-eIF4G PPI-Assays dazu beitragen werden, diese Strategien zu fördern und zu validieren. Dieser Assay wird ein optimales primäres Schema für die Optimierung von eIF4E-eIF4G-Inhibitoren liefern. Die korrekte Aussaat der Zelle und die Durchführung der Transfertransfektion sind der schwierigste Aspekt dieses Produkts, da sie sich direkt auf die Unterdrückung des PPI-Berichtssystems auswirken können.

Nach dem Auftauen und Zählen der Zellen 6-Well-Platten mit HEK 293-Zellen mit 2 Millilitern Standard-Wachstumsmedium pro Vertiefung bepflanzen. Am Morgen des 2. Tages verdünnen Sie für jede geplante Transfektion 9 Mikroliter Lösung auf Liposomenbasis in einem Röhrchen mit 125 Mikrolitern reduziertem Serummedium ohne Phenolrot. Während die verdünnten Liposomen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, bereiten Sie den Mastermix der DNA vor, indem Sie 3 Mikrogramm jedes Plasmids in 125 Mikrolitern reduziertem Serummedium für jedes Transfektionsröhrchen verdünnen.

Geben Sie 12 Mikroliter Enhancer-Reagenzien in den DNA-Mastermix 2 und mischen Sie dann gut. Geben Sie diese Mischung sofort in jedes Röhrchen mit verdünnten Liposomen im Verhältnis 1 zu 1. Nachdem Sie diesen DNA-Lipidkomplex 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, geben Sie den Komplex in jede Vertiefung der 6-Well-Platten.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Spülen Sie am Morgen des 3. Tages jede gut mit 1 Milliliter PBS aus und fügen Sie 0,3 Milliliter Trypsin hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 5 Minuten.

Nach der Inkubation neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 2 Milliliter des reduzierten Serummediums ohne Phenolrot in jede Vertiefung geben. Übertragen Sie die transfizierten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 290x G.

Aspirieren Sie das Medium und suspendieren Sie das Zellpellet in 2 Millilitern des reduzierten Serummediums. Die transfizierten HEK 293-Zellen werden in undurchsichtigen 96-Well-Platten mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Well in 90 Mikrolitern Medium ausgesät. Um 3 technische Replikate für 3 verschiedene Verbindungen innerhalb desselben Experiments zu erhalten, säen Sie 60 Vertiefungen.

Schließen Sie die Vertiefungen an den Rändern aus. Unmittelbar nach dem Aussäen der transfizierten Zellen geben Sie 10 Mikroliter 10%ige DMSO-Verbindungslösung in jede Vertiefung. Bereiten Sie 1 Millimolar zusammengesetzte Stammlösungen vor, indem Sie jede interessierende Verbindung in 100 % DMSO auflösen.

Um 3 Replikate für jede Verbundtitration zu erhalten, verwenden Sie 8 Mikroliter der 1 Millimolar zusammengesetzten Stammlösung. Führen Sie eine zweifache serielle Verdünnung jeder Stammlösung in 8 Vertiefungen einer 96-Well-PCR-Platte durch, indem Sie 4 Mikroliter des 1 Millimolar Stamm in 4 Mikroliter 100 %DMSO für jeden Titrationspunkt pipettieren. Entsorgen Sie die überschüssigen 4 Mikroliter nach dem letzten Punkt der zweifachen seriellen Verdünnung.

Geben Sie 36 Mikroliter steriles Wasser in HPLC-Qualität in jedes Röhrchen, um 40 Mikroliter 10x Compound Serial Dilution Solutions in 10% DMSO herzustellen. Bereiten Sie außerdem ein Steuerelement vor. 10%DMS nur Stammlösung in sterilem Wasser in HPLC-Qualität.

Geben Sie 10 Mikroliter 10x Arbeitslösungen zu den Zellen in der undurchsichtigen 96-Well-Platte, um die beabsichtigte Endkonzentration zu erhalten, mit einer verbleibenden DMSO-Konzentration von 1 %Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 3 Stunden. Beginnen Sie nach 3 Stunden mit der Vorbereitung des Luciferase-Substratreagenzes, indem Sie 1 Volumen des Substrats mit 19 Volumen des Verdünnungsreagenzes kombinieren. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um sofort 25 Mikroliter des Substratreagenzes in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit den Zellen zu geben.

Schütteln Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler bei 350 U/min 50 Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Lumineszenz zu beurteilen, legen Sie die Platte auf ein Plattenlesegerät. Stellen Sie den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 455.

Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 Millimetern mit einer Messzeit von 1 Sekunde. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen, geben Sie 33 Mikroliter Reagenz für den Viabilitätsassay in jede Vertiefung. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur beurteilen Sie die Lumineszenz mit dem Plattenleser, indem Sie den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 600 einstellen.

Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 Millimetern und eine Messzeit von 1 Sekunde. Verwenden Sie die Daten aus dem Plattenlesegerät, um den IC 50-Wert jeder Verbindung zu bestimmen, indem Sie die Daten an die im Manuskript beschriebene 4-Parameter-Anpassungskurvengleichung anpassen. HEK 293 Zellen wurden mit dem eIF4E-eIF4G-Komplementationssystem transfiziert, dann zurückgebildet und mit mTOR-Inhibitoren behandelt.

Wenn die Lumineszenz 4 Stunden nach der Behandlung bestimmt wurde, führten PP242 und Rapamycin beide zu einer dosisabhängigen Hemmung des Signals. Weder PP242 noch Rapamycin führten zu einer signifikanten Abnahme der Zellviabilität, was darauf hindeutet, dass die Abnahme der Lumineszenz im eIF4E-eIF4G-Komplementationssystem nicht auf einen unspezifischen Zelltod, sondern auf eine Störung der EIF4E-4G-Wechselwirkung zurückzuführen ist. Die Western-Blot-Analyse nach dem m7GTP-Pulldown-Experiment zeigte, dass die durch 4EBP1 vermittelte Störung der endogenen eIF4E-eIF4G-Interaktion mit dem gemessenen eIF4E-eIF4G-Assay-Signal korreliert.

PP242 war ein wirksamerer Inhibitor der Gesamt-4EBP1-Phosphorylierung als Rapamycin. Beide Inhibitoren zeigten einen normalen Einfluss auf die mTOR-Signalgebung, wobei Rapamycin aktiver gegen mTORC1-Substrate war und PP242 sowohl auf mTORC1 als auch auf mTORC2 abzielte. Der kritischste Aspekt dieses Produkts ist die Aussaat der Zellen am Tag der Transaktion, die erneute Aussaat der Zellen in einem Medium ohne Phenolrot, die Bewertung der Lumineszenz des eIF4E-eIF4G-Komplementationsassays und die Durchführung des Viabilitätsassays auf derselben Platte.

Ein sekundärer Viabilitätsassay kann durchgeführt werden, um jedes Medikament mit Ziel- und bekannten spezifischen Wirkungen zu bewerten.