Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Der Metabolit wird durch Faktoren wie die Genomumgebung und Managementpraktiken beeinflusst. Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen diesen Faktoren könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung der Ausbeute und Qualität eines Produkts ermöglichen. Durch die Integration einer dritten mobilen Phase anstelle der traditionellen zwei, ermöglicht diese Technik die Trennung und Detektion einer breiteren Palette von Metaboliten.

Metabolomik könnte auf jeden Bereich der Biologie angewendet werden. Erstens, um ein tieferes Verständnis der Biochemie eines Organismus zu erreichen und ihre Reaktion auf abiotischen oder biotischen Stress in Bezug auf die Physiologie zu erklären. Zweitens, Biomarker mit der untersuchten Störung in Verbindung zu bringen.

Da Isopropylalkohol ein viskoses Lösungsmittel ist, sollte er bei geringer Flare-Rate eingeführt werden, und eine ausreichende Ausgleichszeit vor der Erhöhung der Zusammensetzung auf 98% verwendet werden Diese Schritte verhindern, dass das chromatische Grafiksystem überdruckt, einen Fehler zurückgibt oder möglicherweise die analytische Säule beschädigt. Um mit der Herstellung der Körner zu beginnen, verwenden Sie einen Labormixer, um das Getreide zu mahlen. Führen Sie den Mixer mit hoher Geschwindigkeit für 20 Sekunden und dann wiederholen.

Entfernen Sie das Mixerglas von der Basis. Tippen Sie auf die Seite des Mixerglases, um grobe Körner an die Oberfläche der Probe zu bringen. Das grob gemahlene Korn kann entsorgt oder gelagert werden.

Übertragen Sie das fein gemahlene Korn aus dem Mixer auf ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr aus Kunststoff. Bereiten Sie am selben Tag wie die Extraktion das Extraktionslösungsmittel vor, wie im Manuskript beschrieben. Als nächstes wiegen Sie 200 Milligramm fein gemahlenes Korn in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.

Fügen Sie 500 Mikroliter Extraktionslösungsmittel in das Korn in der Röhre hinzu. Bereiten Sie außerdem einen Rohling vor, indem Sie 500 Mikroliter Extraktionslösungsmittel in ein leeres Rohr geben. Mit einem Homogenisator, auf 6 500 RPM eingestellt, mischen Sie das Lösungsmittel und Getreide für 20 Sekunden.

Wiederholen Sie dann weitere 20 Sekunden. Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei vier Grad Celsius und 16, 100 mal G, für fünf Minuten. Übertragen Sie den Überstand auf ein Zwei-Milliliter-Kunststoffrohr und behalten Sie das Pellet.

Wiederholen Sie den Extraktionsprozess auf dem Pellet zweimal. Kombinieren Sie die drei Überstand, ergibt ein Gesamtextraktvolumen von etwa 1,5 Milliliter und mischen durch Wirbel. Um eine gepoolte Probe aller Getreideextrakte zu machen, die für die Qualitätskontrolle verwendet werden sollen, übertragen Sie 55 Mikroliter jedes Getreideextrakts in ein Zwei-Milliliter-Rohr und Einenwirbel.

Dann übertragen Sie 50 Mikroliter Aliquots dieser gepoolten Probe auf Glasfläschchen. Übertragen Sie einen 50-Mikroliter-Aliquot jedes Kornprobenextrakts auf Glasfläschchen. Wie im schriftlichen Manuskript beschrieben, bereiten Sie die Lösungen vor, die für die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie benötigt werden.

Bereiten Sie am Tag der LCMS-Analyse 100 Milliliter 5%Acetonitril vor, die 200 Nanogramm pro Milliliter Leucin Enkephalin enthalten. Fügen Sie 950 Mikroliter dieser Lösung in die Glasflasche mit dem 50 Mikroliter Aliquot des Kornextrakts hinzu. Mischen Sie den Inhalt in der Durchstechflasche durch Wirbeln.

Richten Sie zunächst eine Kalibrierung der Instrumente ein, wie im Manuskript und im Benutzerhandbuch des Herstellers beschrieben. Als nächstes spülen und spülen Sie das LC-Fluidiksystem mit LCMS-Lösungsmitteln, einschließlich mobiler Phasen- und Waschlösungsmittel. Gleichgewichten Sie das LC-System unter Verwendung der Startbedingungen der LC-Methode, um sicherzustellen, dass sich der Säulendruck stabilisiert hat.

Richten Sie die Instrumentensequenztabelle ein. Injizieren Sie das Natriumformat am Anfang der Probensequenz, um die Gerätekalibrierung zu überprüfen. Analysieren Sie zuerst Lösungsmittel und präparative Rohlinge, gefolgt von gepoolten Qualitätskontrollproben für die Systemkonditionierung und dann der randomisierten Stichprobenliste.

Führen Sie Qualitätskontrollproben in regelmäßigen Abständen aus, da sie technisch repliziert werden. Führen Sie zwei Qualitätskontrollbeispiele am Ende der Sequenz aus. Überprüfen Sie während der Ausführung der Sequenz die Datenqualität, einschließlich der internen Standardmassengenauigkeit und der Signalreproduzierbarkeit.

Zur Überprüfung der Signalreproduzierbarkeit sollte eine Sichtprüfung von überlagerten Spektren ausreichen. Vier interne Standards wurden in die Lösung aufgenommen, die zur Herstellung der Getreideextrakte verwendet wurde. Während LCMS wurden sowohl für positive als auch für negative Ionisationsmodi eine gute Massengenauigkeit und eine einzige Reproduzierbarkeit interner Standards beobachtet.

Basierend auf der Analyse von Rohlingen wurden 421 Signale im negativen Modus und 835 Signale im positiven Modus als Artefakte bewertet. Diese Signale waren in Rohlingen mit Intensitäten vorhanden, die 5 % der durchschnittlichen Einzelintensität in Kornproben entsprachen oder darüber lagen. Nach dem Entfernen der Artefakte und der weiteren Filterung der Daten wurden im negativen Modus 483 Features und der positive Modus 523 Features zurückgegeben.

Etwa 250 Merkmale waren biologisch relevant und unterschieden sich signifikant in der Intensität zwischen den Weizensorten. Die Qualitätskontrollmaßnahmen, wie die Aufnahme von präparativen Rohlingen, internen Standards und gepoolten Proben, sind in diesem Protokoll zu beachten.