Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

Unsere Methodik ist die erste, die ein zuverlässiges experimentelles Werkzeug zur Induktion einer transienten Aktivierung einer endogenen reaktiven Sauerstoffspezies oder ROS-Produktion in einem Gewebe in vivo bereitstellt. Unsere Methodik bietet ein robustes, benutzerfreundliches und nicht-invasives Verfahren, das eine konsistente Produktion physiologisch stimulierender ROS-Spiegel in der Haut ermöglicht, wobei im Wesentlichen eine rote Lichtquelle verwendet wird. Da die physiologische Induktion von ROS in der Haut die Bedürfnisse des Gewebestamms erfüllt, haben wir unsere Methodik für die Hautregenerationstherapie, einschließlich guter Heilung und Haarwachstum, weiter angewendet.

Die Biologie und Signalübertragung von ROS ist derzeit ein Forschungs-Hotpot. Eine wesentliche Einschränkung bei der Untersuchung der ROS-Funktion in vivo ist der Mangel an geeigneten Werkzeugen, um eine kontrollierte endogene ROS-Produktion zu induzieren. UNSERE Methodik ist benutzerfreundlich und einfach, aber alle Geräte, Lampe, IV, IS usw., müssen angemessen kalibriert werden.

Kritische chemische Ausgangsstoffe müssen frisch sein und alle Schritte oder das Protokoll müssen strikt befolgt werden. Um das Haarwachstum auf der Rückenhaut von Mäusen in der zweiten Telogenphase zu induzieren, nachdem nach Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf den Pedalreflex bei etwa Tag 50 postnatalen Wurf Mate C57 schwarzen sechs Mäusen, verwenden Sie einen Rasierer und eine Enthaarungscreme, um zwei unabhängige nebeneinander liegende Hautregionen vom Rücken jeder Maus zu entfernen. Entfernen Sie nach einigen Minuten die Creme mit PBS und erfassen Sie das Haarfollikelwachstum durch die tägliche Aufnahme von hochauflösenden Bildern der Kontroll- und behandelten dorsalen Hautbereiche jedes Tieres.

Um die Entstehung von Verbrennungen zweiten Grades auf der Rückenhaut von Mäusen in der zweiten Telogenphase zu induzieren, entfernen Sie die Haare vom Rücken der Maus. Einen Messingriegel mit einem Durchmesser von einem Zentimeter in kochendem Wasser auf 95 Grad Celsius erhitzen und den Riegel fünf Sekunden lang auf den zentralen Bereich der Maushaut auftragen. Unmittelbar nach der Entstehung der Verbrennung injizieren Sie den Tieren intraperitoneal einen Milliliter physiologischer Lösung, um eine Dehydrierung zu verhindern und den Mäusen zu ermöglichen, sich 24 Stunden lang zu erholen, bevor sie mit der Behandlung fortfahren.

Für die Erzeugung von BrdU-markierten Retentionszellen oder LRCs injizieren 10 oder 14 Tage alte Wurfgeschwister an vier aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich intraperitoneal mit 50 Milligramm BrdU pro Kilogramm Körpergewicht in PBS. Lassen Sie die Mäuse nach der Markierungsphase 50 bis 60 Tage lang entwickeln, bevor Sie die Behandlung anwenden. Um die vorübergehende Produktion von nicht-letalen reaktiven Sauerstoffspezies oder ROS-Spiegeln in der Maushaut für eine Haarwuchsanalyse zu induzieren, tragen Sie nach der Aufnahme eines Ausgangsbildes des Haarwachstums topisch etwa 25 Milligramm mALA-Creme auf die rechte rasierte Hautregion auf und legen Sie das Tier 2,5 Stunden lang in die Dunkelheit.

Am Ende der Photosensibilisatoren-Behandlung entfernen Sie gründlich überschüssige Creme mit PBS und bestätigen Sie die PP9-Produktion in situ durch rote Fluoreszenzexpression unter Blaulichtanregung, dann bestrahlen Sie die gesamte Rückenhaut mit einer geeigneten roten Lichtquelle für eine Gesamtdosis von 2,5 bis 4 Joule pro Quadratzentimeter. Lassen Sie die Mäuse dann auf einer Heizdecke mit Überwachung bis zum vollständigen Liegen erholen, bevor Sie die Tiere in ihre Käfige zurückbringen. Um die transiente ROS-Produktion für die Heilung von Verbrennungen zweiten Grades einzuschalten, tragen Sie etwa 25 Milligramm mALA-Creme auf die rechte Verbrennungsoberfläche und etwa vier Millimeter angrenzendes Gewebe auf und legen Sie die Tiere wie gezeigt 2,5 Stunden lang im Dunkeln.

Bestrahlen Sie nach dem Entfernen der Creme die gesamte Rückenhaut und lassen Sie die Mäuse sich unter Überwachung erholen, wie gezeigt. Um eine vorübergehende ROS-Produktion in der Schwanzhaut zu induzieren, tragen Sie etwa 25 Milligramm mALA-Creme entlang des gesamten dorsalen Gewebebereichs der mit BrdU behandelten Mäuse auf und bestrahlen Sie die Rückenhaut des Schwanzes, wie gezeigt. Nachdem Sie die Mäuse eingeschläfert haben, entnehmen Sie die Schwanzhaut für den BrdU-Nachweis.

Entnehmen Sie mit einem Skalpell den Schwanz von jedem Tier, machen Sie dann gerade Längsschnitte und schälen Sie die gesamte Haut in einem Stück von der Wirbelsäule. Inkubieren Sie die geschälten Hautstücke in fünf millimolaren EDTA und PBS und fünf Milliliter-Röhrchen für vier Stunden bei 37 Grad Celsius, um die sorgfältige Trennung der intakten Epidermisschichten von der Dermis mit einer Pinzette zu ermöglichen. Fixieren Sie das getrennte Gewebe mindestens 72 Stunden lang bei Raumtemperatur in 4%Formaldehyd und PBS.

Markieren Sie dann das fixierte Gewebe mit den fluoreszenzkonjugierten Antikörpern, bevor Sie das Gewebe durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie gemäß Standardprotokollen sichtbar machen, um LRCs unter jeder experimentellen Bedingung zu identifizieren und zu quantifizieren. Für die ex vivo-Bewertung der ROS-Produktion wird nach der Ernte von Mausschwanzhautstücken, wie gezeigt, das unbehandelte Kontrollgewebe und fünf millimolare EDTA und PBS allein inkubiert und die photodynamischen Behandlungsproben in EDTA mit zwei millimolaren mALA ergänzt. Als nächstes fügen Sie jedem Gewebesatz Hydroethidin in einer Endkonzentration von 3,2 Mikromolaren hinzu und inkubieren Sie alle Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Am Ende der Inkubation dehnen Sie die Schwanzhautproben mit den Fingerspitzen über eine Glasoberfläche und bestrahlen das behandelte Gewebe mit 636 Nanometern rotem Licht bei einer Fluenz von 10 Joule pro Quadratzentimeter. Trennen Sie am Ende der Behandlung sofort die Epidermis von der Dermis und fixieren Sie die Epidermisfolien mindestens 72 Stunden lang bei Raumtemperatur in 4% Formaldehyd und PBS. Am Ende der Fixierung wird die rote 2-Hydroxyethidium-Emission durch Fluoreszenzmikroskopie mit grünem, anregendem Licht bewertet, um die Aufnahme hochwertiger Bilder zu ermöglichen.

Für den In-vivo-Nachweis der ROS-Produktion in der Rückenhaut werden unmittelbar nach der Rotlichtbestrahlung 100 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter DH-FDA und 50 % Ethanol auf alle Zielkontroll- und behandelten Hautbereiche aufgetragen. Die topische Verabreichung des mALA-Vorläufers auf die Rücken- und Schwanzhaut der Maus führt zu einer signifikanten Akkumulation von Protoporphyrin IX im gesamten Gewebe und spürbar im Haarfollikel, wie die rötlich-rosa Fluoreszenz dieser Verbindung unter Anregung von blauem Licht zeigt. Die anschließende Bestrahlung des behandelten Gewebes mit rotem Licht fördert die vorübergehende Produktion von ROS im Gewebe, insbesondere im Wölbungsbereich des Haarfollikels.

Das Einschalten der nicht-letalen ROS-Produktion in der Maushaut in vivo führt zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl von LRCs in der Wölbungsregion des Haarfollikels zwei Tage nach der photodynamischen Behandlung. Bemerkenswert ist, dass der Anstieg der LRC-Zahlen vorübergehend ist und sechs Tage nach der Behandlung wieder auf ein normales Niveau zurückkehrt. Die vorübergehende ROS-Produktion beschleunigt die Hautheilung nach einer Verbrennung zweiten Grades.

Die Quantifizierung der allmählichen Reduktion der geschädigten Haut zeigt die Robustheit und statistische Signifikanz des Gewebes zur Beschleunigung des Wundheilungsprozesses. In ähnlicher Weise fördern nicht-letale ROS-Spiegel das Haarwachstum nach der Rasur während des zweiten koordinierten Telogens, einer Phase, in der der Haarfollikel refraktär auf Wachstumsreize reagiert. Darüber hinaus wird auch die ROS-Produktion nach Photobehandlungen durch die Anwendung von antioxidativen Verbindungen deutlich reduziert.

Die Herstellung von PP IX in situ durch Expression von roter Fluoreszenz unter Anregung von blauem Licht muss sorgfältig bestätigt werden. Um die ROS-Produktion zu induzieren, muss die Bestrahlungsstärke der roten Lichtquelle korrekt eingestellt werden. im Vergleich zu Gewebe und Gesamtlichtdosis.

Nach der ROS-Induktion können aktuelle biochemische sowie zell- und molekularbiologische Techniken verwendet werden, um gesammelte Proben zu analysieren und die dynamische physiologische Reaktion des Gewebes zu bewerten. Unsere Methodik bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um den physiologischen Effekt einer vorübergehenden Produktion von endogenen ROS in einem Gewebe in vivo zu untersuchen. Dies ist ein neuer experimenteller Ansatz, der für Forscher auf dem Gebiet der ROS-Signalübertragung sehr nützlich sein kann.