Name: Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur induzierten ROS-Produktion in Maushaut mittels mALA-Creme und Rotlicht zur Stimulation von Stammzellnischen. Dieses Verfahren ermöglicht kontrollierte Geweberegeneration und Haarwachstum.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 an JE) und des Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 an JE) aus Spanien unterstützt. EC wurde durch das Atracción de Talento Investigador Stipendium 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid und UAM) unterstützt.

Alle Mäusehaltungs- und Versuchsverfahren müssen in Übereinstimmung mit den lokalen, nationalen und internationalen Gesetzen und Richtlinien für Tierversuche durchgeführt werden.
1. Induktion des Haarwachstums, Induktion von Verbrennungen und Identifizierung langfristiger BrdU-LRCs in den Schwanzhautepithel-Wholemounts
HINWEIS: Verwenden Sie 10 Tage oder 7 Wochen alte C57BL/6-Mäuse, vorzugsweise Wurfgeschwister, für die unten beschriebenen Versuchspläne. Bei allen experimentellen Verfahren werden die Tiere durch 3%ige Isofluran-Inhalation betäubt oder durch Zervixluxation euthanasiert, wie angegeben.
<ol><li>Induktion des Haarwachstums in der Rückenhaut von Mäusen in der zweiten Telogenphase (ca. Tag 50 postnatal)<ol><li>Betäuben Sie Mäuse mit Inhalation von 3% Isofluran. Bestätigen Sie die Volltiefenanästhesie durch das Fehlen eines Pedalreflexes (festes Einklemmen der Zehen). Rasieren Sie bei jeder einzelnen Maus zwei unabhängige, nebeneinander liegende Regionen der Rückenhaut mit einer Haarschneidemaschine und einer Enthaarungscreme (Materialtabelle). Verwenden Sie die linke Seite für die Steuerung und die rechte Seite für die Behandlung. HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass die darunter liegende Rückenhaut nach der Rasur rosa und nicht grau/schwarz ist, ein Indikator für die Melanogenese und den Eintritt in die Anagenphase (Wachstumsphase) bei diesem Mausstamm.</li>
		<li>Gründlich mit PBS waschen, um alle Cremereste zu entfernen, und mit der Induktion der vorübergehenden In-situ-Produktion nichtletaler ROS-Spiegel fortfahren, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.</li>
		<li>Zeichnen Sie das Wachstum der Haarfollikel auf, indem Sie täglich hochauflösende Bilder der Kontroll- und behandelten Hautpartien bei jedem Tier aufnehmen (z. B. mit einer HD-Kamera, die mit einem 5-20-fachen Fernglasobjektiv gekoppelt ist).</li>
	</ol></li>
	<li>Induktion von Verbrennungsläsionen 2. Grades in der hinteren Haut von Mäusen in der zweiten Telogenphase (Ruhephase) (ca. Tag 50 postnatal)<ol><li>Mäuse anästhesieren. Rasieren Sie die gesamte hintere Hautregion jeder einzelnen Maus mit einer Haarschneidemaschine und einer Enthaarungscreme und waschen Sie sie gründlich mit PBS, um alle Cremereste zu entfernen. HINWEIS: Subkutane In-situ-Injektionen von Lidocain 0,5% (2 mg/ml) in steriler Kochsalzlösung, nicht mehr als 7 mg/ml, kurz vor dem Verbrennungsvorgang.</li>
		<li>Eine Messingstange (1 cm Querschnitt) auf 95 °C durch Eintauchen in kochendes Wasser vorwärmen und dann für 5 s auf den zentralen Bereich der dorsalen hinteren Hautoberfläche jeder Maus auftragen.</li>
		<li>Unmittelbar nach der Verbrennungserzeugung injizieren Sie den Tieren intraperitoneal 1 ml physiologische Lösung (0,9 % NaCl) auf eine Heizdecke, um eine Dehydrierung zu verhindern. Lassen Sie die Tiere 24 Stunden lang erholen und fahren Sie mit der Induktion der vorübergehenden In-situ-Produktion nichtletaler ROS-Spiegel fort, wie in Abschnitt 2.3 beschrieben.</li>
		<li>Erfassen Sie das Fortschreiten der Brandwunde durch tägliche Aufnahme hochauflösender Bilder der Kontroll- und behandelten Rückenhautareale bei jedem Tier (z. B. mit einer HD-Kamera, die mit einem 5-20-fachen Fernglasobjektiv gekoppelt ist).</li>
	</ol></li>
	<li>Generierung und Identifizierung von langfristigen BrdU-LRCs im Schwanzhautepithel<ol><li>10/14 Tage alte Wurfgeschwister einmal täglich intraperitoneal (ohne Anästhesie) an 4 aufeinanderfolgenden Tagen mit 50 mg/kg Körpergewicht BrdU gelöst in PBS injizieren. Lassen Sie die Mäuse nach der Markierungsphase 50 bis 60 Tage lang wachsen, bevor Sie mit der Behandlung beginnen. HINWEIS: Verwenden Sie für jede Injektion eine frische Nadel.</li>
		<li>Prozedur wie in Abschnitt 2.3 beschrieben für die Induktion der transienten in situ nichtletalen ROS-Produktion in der Schwanzhaut zu verschiedenen Zeitpunkten vor der Präparation von Gewebe-Wholemounts.</li>
		<li>Um ganze Schwanzepidermis vorzubereiten, euthanasieren Sie Mäuse durch Zervixverrenkung und schneiden Sie die Schwänze mit einer chirurgischen Schere ab.<ol><li>Machen Sie mit einem Skalpell einen geraden Längsschnitt entlang des Schwanzes und ziehen Sie die gesamte Haut als ein Stück von der Wirbelsäule ab. Inkubieren Sie die geschälte Haut in 5 mM EDTA in PBS in 5 ml-Röhrchen für 4 h bei 37 °C und trennen Sie die intakten Epidermisschichten vorsichtig mit einer Pinzette von der Dermis.</li>
			<li>Fixieren Sie das Gewebe in 4%igem Formaldehyd in PBS für mindestens 72 Stunden bei Raumtemperatur (RT) und fahren Sie mit dem BrdU-Nachweis unter Verwendung geeigneter Antikörper fort.</li>
			<li>Verwenden Sie Fluoreszenz-/Konfokalmikroskopie, um LRCs unter allen experimentellen Bedingungen zu identifizieren und zu quantifizieren, einschließlich Lichtkontrollen und photodynamischer Behandlungen zu verschiedenen Zeitpunkten vor der Präparation von Gewebe-Wholemounts, wie zuvor ausführlichbeschrieben 19,20. HINWEIS: Festsitzende Epidermisfolien können bis zu drei Monate lang in PBS mit 0,02 % Natriumazid bei 4 °C gelagert werden. Festsitzende Epidermisschichten können zur Immunlokalisierung der erforderlichen Proteine nach standardmäßigen histologischen Schnittverfahren verwendet werden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Induktion der transienten Produktion von nicht-letalen ROS-Spiegeln in der Haut von Mäusen
HINWEIS: Um eine vorübergehende Produktion von nicht-letalen ROS-Spiegeln in der Haut von Mäusen zu induzieren, wird eine photodynamische Behandlung mit einem Vorläufer des endogenen Photosensibilisators PpIX, in diesem Fall Methylaminolevulinat (mALA), und rotem Licht verwendet.
<ol><li>Um die transiente ROS-Produktion für die Induktion des Haarwachstums in der Rückenhaut einzuschalten, sind die Tiere wie in Abschnitt 1.1 beschrieben vorzubereiten.<ol><li>Tragen Sie ~25 mg mALA in Form einer topischen Creme (Materialtabelle) auf die rechte Region auf, wobei die linke Seite als interne Kontrolle beibehalten wird, um interindividuelle Unterschiede zu vermeiden. 2,5 h im Dunkeln inkubieren, überschüssige Creme gründlich mit PBS abwaschen. Um die Narkosetiefe zu bestätigen, überwachen Sie die Tiere alle 10 Minuten, bis sie sich vollständig erholt haben. HINWEIS: Die Produktion von PpIX in der Rückhaut sollte in situ durch seine rote Fluoreszenz unter blauer Lichtanregung (407 nm) getestet werden.</li>
		<li>Betäuben Sie die Tiere.</li>
		<li>Bestrahlen Sie die gesamte Rückenhaut mit einer geeigneten Rotlichtquelle (Materialtabelle) für eine Gesamtdosis von 2,5−4 J/cm2. Halten Sie die Mäuse bis zu ihrer vollständigen Genesung auf einer Heizdecke und fahren Sie wie in Schritt 1.1.3 beschrieben fort. HINWEIS: Die Bestrahlungsstärke sollte durch Manipulation des Abstands zwischen der Lichtquelle und dem Gewebe eingestellt und mit einem Leistungsenergiemessgerät (Materialtabelle) gemessen werden. Das Experiment gilt als beendet, wenn in einer der unabhängigen rasierten Regionen jedes Tieres volles Haarwachstum beobachtet wird. Das gesamte Verfahren umfasst nur eine einzige Fotobehandlung.</li>
	</ol></li>
	<li>Um die vorübergehende ROS-Produktion zur Heilung von Verbrennungen 2. Grades einzuschalten, sind die Tiere wie in Abschnitt 1.2 beschrieben vorzubereiten.<ol><li>Tragen Sie ~25 mg mALA in Form einer topischen Creme entlang der verbrannten Oberfläche auf, die etwa 4 mm angrenzendes Gewebe umfasst. 2,5 h im Dunkeln inkubieren, überschüssige Creme gründlich mit PBS abwaschen. Um die Narkosetiefe zu bestätigen, überwachen Sie die Tiere alle 10 Minuten, bis sie sich vollständig erholt haben.</li>
		<li>Betäuben Sie die Tiere.</li>
		<li>Bestrahlen Sie die gesamte Rückenhaut mit einer geeigneten Rotlichtquelle für eine Gesamtdosis von 2,5−4 J/cm2. Halten Sie die Mäuse bis zu ihrer vollständigen Genesung auf einer Heizdecke und fahren Sie wie in Schritt 1.2.4 beschrieben fort. HINWEIS: Das experimentelle Verfahren für jedes Tier gilt als abgeschlossen, wenn eine vollständige Heilung der Verbrennung beobachtet wird. Das gesamte Verfahren umfasst nur eine einzige Fotobehandlung.</li>
	</ol></li>
	<li>Um die vorübergehende ROS-Produktion in der Schwanzhaut einzuschalten, bereiten Sie Mäuse wie in Abschnitt 1.3 beschrieben vor, tragen Sie ~25 mg mALA in Form einer topischen Creme entlang des gesamten Rückengewebebereichs auf und gehen Sie wie in Abschnitt 2.1 für die Rückenhaut beschrieben vor. Führen Sie 24 h, 48 h oder 72 h vor der Euthanasie des Tieres und der weiteren Entnahme ganzer Halterungen der Schwanzhaut Fotobehandlungen und entsprechende Lichtkontrollen durch. ANMERKUNG: Bei allen Versuchsanordnungen ist die ROS-Abhängigkeit des Prozesses unter Verwendung von antioxidativen ROS-Fängern zu testen (z. B. tägliche Inokulation von 100 mg/kg Körpergewicht N-Acetyl-Cystein durch intraperitoneale Injektion einer 20 mg/ml-Lösung in PBS, pH 7,2, beginnend 5 Tage vor mALA-Behandlungen oder alternativ zwei Dosen von 100 mg/ml Ascorbinsäure in 50%igem Ethanol, im Abstand von 30 Minuten, topisch auf die Haut aufgetragen im Zeitintervall zwischen den mALA-Behandlungen und der Rotlichtbestrahlung).</li>
</ol>3. ROS-Nachweis in der Haut
<ol><li>Ex vivo Evaluierung der ROS-Produktion in der Schwanzhaut nach photodynamischer Behandlung mit Hydroethidin HINWEIS: Hydroethidin ist ein nicht fluoreszierendes Molekül, das spezifisch mit ROS reagiert, um den Fluoreszenzfarbstoff 2-Hydroxyethidium (hET) zu produzieren.<ol><li>Ganze Schwanzhäute, die gemäß Abschnitt 1.3.3 erhalten werden, werden 3 h lang bei 37 °C in 5 mM EDTA in PBS-Lösung (Kontrollproben) oder zusätzlich mit 2 mM mALA (photodynamische Behandlungsproben) inkubiert.</li>
		<li>In allen Fällen wird Hydroethidin zu einer Endkonzentration von 3,2 μM aus einem 25 mg/ml-Stamm in Dimethylsulfoxid (DMSO) zugegeben und 1 Stunde lang im Dunkeln bei RT inkubiert.</li>
		<li>Die Schwanzhautproben werden mit den Fingerspitzen über eine Glasoberfläche gespannt und mit 636 nm rotem Licht bei einer Fluenz von 10 J/cm2 bestrahlt.</li>
		<li>Fahren Sie sofort fort, um die Epidermis von der Dermis zu trennen und die Epidermisblätter wie in Abschnitt 1.3.3 beschrieben zu fixieren.</li>
		<li>Bewerten Sie die hET-Rotemission unter einem Fluoreszenz-/Konfokalmikroskop mit grünem, anregendem Licht, nehmen Sie qualitativ hochwertige Bilder auf und fahren Sie mit der weiteren Analyse fort. HINWEIS: Verwenden Sie die hET-Färbung von Gewebeproben ohne photodynamische Behandlung als Negativkontrolle für die hET-Autoxidation.</li>
	</ol></li>
	<li>In-vivo-Nachweis der ROS-Produktion in der Rückenhaut nach Induktion des Haarwachstums und der Heilung von Verbrennungen mit anschließender photodynamischer Behandlung HINWEIS: Dieser Schritt wird unter Verwendung von 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DHF-DA) durchgeführt, einer zelldurchlässigen, nicht fluoreszierenden Verbindung, die nach der Spaltung durch intrazelluläre Esterase-Enzyme spezifisch mit ROS reagiert und den 2′,7′-Dichlorfluorescein (DCF)-Fluoreszenzfarbstoff ergibt.<ol><li>Verwenden Sie Tiere, die für die Induktion des Haarwachstums (Abschnitt 1.1) oder die Heilung von Verbrennungen (Abschnitt 1.2) vorbereitet sind. Unmittelbar vor topischen mALA-Cremebehandlungen (siehe Abschnitte 2.1 und 2.2) topisch 100 μl 1 mg/ml in 50%igem DHF-DA-Ethanol auf alle Zielkontroll-/behandelten Hautbereiche geben, die Haut das Material vollständig aufnehmen lassen und mit der topischen Anwendung der mALA-Creme fortfahren.</li>
		<li>Behandelte Tiere 4 Stunden lang im Dunkeln inkubieren, die topische mALA-Creme gründlich mit PBS von der Haut abwaschen und eine zweite Dosis von 100 μl DHF-DA-Lösung auf die Haut geben. Um die Narkosetiefe zu bestätigen, überwachen Sie die Tiere alle 10 Minuten, bis sie sich vollständig erholt haben.</li>
		<li>Die behandelten Tiere werden 50 Minuten lang im Dunkeln bebrütet, betäubt und die gesamte Rückenhaut mit einer Fluenz von 2,5 bis 4 J/cm2 von 636 nm Rotlicht mit einer LED-Lampe bestrahlt.</li>
		<li>Unmittelbar nach der Bestrahlung sind die in der Haut erzeugten ROS-Werte mit einem In-vivo-Bildgebungssystem zu beurteilen (Materialtabelle). Stellen Sie das Filterfeld auf 445−490 nm Anregung und 515−575 nm Emission ein, nehmen Sie qualitativ hochwertige Bilder auf und fahren Sie mit der weiteren Analyse fort. HINWEIS: Verwenden Sie die DHF-DA-Färbung von Gewebeproben ohne photodynamische Behandlung als Negativkontrolle für die DHF-DA-Autoxidation.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Blázquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+1O2+optical+excitation%3A+A+tool+for+redox+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology.</a> Redox Biology. 13, 39-59 (2017).</li>
<li>Valko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).</li>
<li>Sena, L. A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Roles+of+Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species.</a> Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).</li>
<li>Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+Destroyers+or+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: Destroyers or messengers.</a> Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).</li>
<li>Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+from+health+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Swiss+Medical+Weekly%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: from health to disease.</a> Swiss Medical Weekly. 142, 13659(2012).</li>
<li>Speakman, J. R., Selman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+free-radical+damage+theory%3A+Accumulating+evidence+against+a+simple+link+of+oxidative+stress+to+ageing+and+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan.</a> BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).</li>
<li>Fernandez, V., Videla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+aspects+of+cellular+antioxidant+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Biochemical aspects of cellular antioxidant systems.</a> Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).</li>
<li>Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+enzymes+and+their+implications+in+pathophysiologic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes.</a> Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+Family+of+ROS-Generating+NADPH+Oxidases%3A+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li>
<li>Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+Regulation+of+Reactive+Oxygen+Species+Generation+by+Nox+Family+NADPH+Oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).</li>
<li>Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+A+radical+role+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: A radical role in development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).</li>
<li>Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development%3A+Passive+or+active%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+stress+and+signaling+during+vertebrate+embryonic+development%3A+Regulation+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+prime+Drosophila+haematopoietic+progenitors+for+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation.</a> Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li>
<li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+Neural+Stem+Cells+Have+High+Endogenous+ROS+Levels+that+Regulate+Self-Renewal+and+Neurogenesis+in+a+PI3K%2FAkt-Dependant+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li>
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<li>Hamanaka, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species+Promote+Epidermal+Differentiation+and+Hair+Follicle+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development.</a> Science Signaling. 6 (261), 8(2013).</li>
<li>Carrasco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+of+ROS+Production+in+situ+Transiently+Activates+Cell+Proliferation+in+Mouse+Skin+and+in+the+hair+Follicle+Stem+Cell+Niche+Promoting+Hair+Growth+and+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).</li>
<li>Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+on+a+transient+endogenous+ROS+production+in+mammalian+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues.</a> Methods. , 109(2016).</li>
<li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
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</ol>

Alle kommerziellen Anwendungen der in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren sind durch ein CSIC-UAM-Patent (EP2932967A1) geschützt, das von EC, MIC und JE verfasst und an Derma Innovate SL zur kommerziellen Nutzung lizenziert wurde. JE und JJM haben eine beratende Position bei Derma Innovate SL.

In dieser Arbeit stellen wir eine Methodik vor, die eine transiente Aktivierung der endogenen ROS-Produktion in vivo in der Haut von Mäusen mit physiologischen Effekten ermöglicht. Die Methodik basiert auf einem photodynamischen Verfahren, um eine kontrollierte und lokale Stimulation des endogenen Photosensibilisators PpIX zu induzieren (Abbildung 1B). Dieser experimentelle Ansatz ist ein interessantes Werkzeug zur Untersuchung der ROS-Biologie in In-vivo-Versuchssystemen, der einen signifik...

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind das Ergebnis der chemischen Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser und umfassen Singulett-Sauerstoff, Superoxid-Anion, Wasserstoffperoxid und das Hydroxylradikal 1,2,3. ROS haben aufgrund ihrer extrem chemisch reaktiven Natur eine sehr kurze Lebensdauer. In aeroben Organismen werden ROS zufällig in den Zellen als großes undichtes Nebenprodukt der aeroben Atmung (Elektronentransportkette) in den Mitochondrien gebildet. Die vorübergehende Anhäufung hoher ROS-Konzentrationen in der Zelle führt zu einem oxidativen Stresszustand, der die irreversible Inaktivierung von Proteinen, Lipiden und Zuckern und die Einführung von Mutationen im DNA-Molekül 2,3,4,5 provozieren kann. Die allmähliche Anhäufung oxidativer Schäden in Zellen, Geweben und ganzen Organismen nimmt mit der Zeit stetig zu und wurde mit der Induktion von Zelltodprogrammen, verschiedenen Pathologien und dem Alterungsprozess in Verbindung gebracht 2,3,4,6.
Aerobe Organismen haben stetig effiziente molekulare Mechanismen entwickelt, um die übermäßige ROS-Akkumulation in Zellen und Geweben zu bekämpfen. Zu diesen Mechanismen gehören Mitglieder der Superoxiddismutase (SOD)-Proteinfamilie, die die Superoxidradikal-Dismutation in molekularen Sauerstoff und Wasserstoffperoxid katalysieren, sowie verschiedene Katalasen und Peroxidasen, die den antioxidativen Pool (Glutathion, NADPH, Peroxiredoxin, Thioredoxin7,8) nutzen, um die anschließende Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Wasser und molekularen Sauerstoff zu katalysieren.
Mehrere Berichte unterstützen jedoch die Rolle von ROS als Schlüsselkomponenten molekularer Schaltkreise, die kritische Zellfunktionen regulieren, einschließlich Proliferation, Differenzierung und Mobilität 2,3,4. Dieses Konzept wird durch die anfängliche Identifizierung und Charakterisierung von ROS-produzierenden Mechanismen in aeroben Organismen, einschließlich Lipoxygenasen, Cyclooxygenasen und NADPH-Oxidasen, weiter unterstützt 9,10. In diesem Sinne spielen ROS eine aktive Rolle während der Embryonalentwicklung von Wirbeltieren 11,12,13 und Schlüsselrollen für diese Moleküle bei der Regulation spezifischer physiologischer In-vivo-Funktionen wurden in verschiedenen experimentellen Systemen beschrieben, einschließlich des Differenzierungsprogramms von hämatopoetischen Vorläuferzellen in Drosophila14, der heilenden Induktion bei Zebrafischen oder der Schwanzregeneration bei Xenopus-Kaulquappen 15. Bei Säugetieren waren ROS am Selbsterneuerungs-/Differenzierungspotenzial von neuralen Stammzellen in einem Neurosphärenmodellbeteiligt 16 und an der Deregulierung der intestinalen Stammzellfunktion während der Darmkrebsentstehung17. In der Haut wurde die ROS-Signalgebung mit der epidermalen Differenzierung und der Regulierung der Hautstammzellnische und des Wachstumszyklus der Haarfollikel in Verbindung gebracht18,19.
In dieser Perspektive ist eine wesentliche experimentelle Einschränkung zur Bestimmung der physiologischen Rolle von ROS in biologischen Systemen, sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen, das Fehlen geeigneter experimenteller Werkzeuge, um eine kontrollierte Produktion dieser Moleküle in Zellen und Geweben zu induzieren, die ihrer physiologischen Produktion als sekundäre Signalboten genau ähneln. Derzeit beinhalten die meisten experimentellen Ansätze die Verabreichung von exogenen ROS, meist in Form von Wasserstoffperoxid. Wir haben kürzlich einen experimentellen Ansatz implementiert, um eine transiente, nicht-letale In-vivo-Produktion von endogenen ROS in der Maushaut einzuschalten, basierend auf der Verabreichung von Vorläufern des endogenen Photosensibilisators Protoporphyrin IX (PpIX; z.B. Aminolaevulinsäure oder ihr Methylderivat Methylaminolevulinat) und einer weiteren Bestrahlung der Probe mit rotem Licht, um die in situ Bildung von ROS aus intrazellulärem molekularem Sauerstoff zu induzieren (Abbildung 1). Dieses photodynamische Verfahren kann effizient genutzt werden, um residente Stammzellnischen zu stimulieren, wodurch die Regenerationsprogramme des Gewebes aktiviertwerden 19,20 und der Weg für neue therapeutische Modalitäten in der regenerativen Hautmedizin eröffnet wird. Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung des Protokolls und zeigen repräsentative Beispiele für die Stimulation von Stammzellnischen, gemessen als Erhöhung der Anzahl von Langzeit-5-Brom-2'-Desoxyuridin (BrdU)-Markierungsretentionszellen (LRCs) in der Wölbungsregion des Haarfollikels19,21 und die anschließende Aktivierung von Regenerationsprogrammen (Beschleunigung des Haarwachstums und der Heilung von Verbrennungen), die durch transiente, nicht-letale ROS-Produktion in der Haut des C57Bl6-Mausstamms.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlorfluorescindiacetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>5'-bromo-2'-deoxiuridin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5002-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bromodeoxyuridin-Fluorescein</td><td>Roche</td><td>11202693001</td><td></td></tr><tr><td>Enthaarungscreme (z.B. Veet)</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>In-Vivo-Bildgebungssystem, z. B. IVIS Lumina 2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mALA in Form einer topischen Creme, z. B. METVIX Crema 160 mg/g</td><td>Galderma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power Energiemessgerät (z. B. ThorLabs Modell PM100D)</td><td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rote Lichtquelle, z. B. 636 nm Aktilite LED-Lampe</td><td>Photocure ASA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stimulation von stammzellnischen und geweberegeneration in der haut von mäusen durch schaltbare protoporphyrin ix-abhängige photogeneration reaktiver sauerstoffspezies in situ

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur induzierbaren in vivo Photogenerierung von endogenen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Haut von Mäusen. Diese transiente Produktion von ROS in situ aktiviert effizient die Zellproliferation in Stammzellnischen und stimuliert die Geweberegeneration, was sich stark in der Beschleunigung von Verbrennungsheilungs- und Haarfollikelwachstumsprozessen manifestiert. Das Protokoll basiert auf einer regulierbaren photodynamischen Behandlung, bei der das Gewebe mit Vorstufen des endogenen Photosensibilisators Protoporphyrin IX behandelt und das Gewebe unter streng kontrollierten physikalisch-chemischen Parametern weiter mit rotem Licht bestrahlt wird. Insgesamt stellt dieses Protokoll ein interessantes experimentelles Werkzeug zur Analyse der ROS-Biologie dar.

Die topische Verabreichung des mALA-Vorläufers in die Rücken- und Schwanzhaut der Maus führt zu einer signifikanten Akkumulation von PpIX im gesamten Gewebe und spürbar im Haarfollikel, wie die rötlich-rosa Fluoreszenz dieser Verbindung unter blauer Lichtanregung (407 nm) zeigt (Abbildung 2A,C). Die anschließende Bestrahlung des behandelten Gewebes mit rotem Licht (636 nm) bei einer Fluenz von 2,5−4 J/cm2 fördert die vorübergehende Produktion von ROS im Gewebe, in...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die vorübergehende In-vivo-Produktion von nicht-letalen Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Haut von Mäusen zu induzieren und so die physiologischen Reaktionen im Gewebe weiter zu fördern.

Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Unsere Methodik ist die erste, die ein zuverlässiges experimentelles Werkzeug zur Induktion einer transienten Aktivierung einer endogenen reaktiven Sauerstoffspezies oder ROS-Produktion in einem Gewebe in vivo bereitstellt. Unsere Methodik bietet ein robustes, benutzerfreundliches und nicht-invasives Verfahren, das eine konsistente Produktion physiologisch stimulierender ROS-Spiegel in der Haut ermöglicht, wobei im Wesentlichen eine rote Lichtquelle verwendet wird. Da die physiologische Induktion von ROS in der Haut die Bedürfnisse des Gewebestamms erfüllt, haben wir unsere Methodik für die Hautregenerationstherapie, einschließlich guter Heilung und Haarwachstum, weiter angewendet.Die Biologie und Signalübertragung von ROS ist derzeit ein Forschungs-Hotpot. Eine wesentliche Einschränkung bei der Untersuchung der ROS-Funktion in vivo ist der Mangel an geeigneten Werkzeugen, um eine kontrollierte endogene ROS-Produktion zu induzieren. UNSERE Methodik ist benutzerfreundlich und einfach, aber alle Geräte, Lampe, IV, IS usw., müssen angemessen kalibriert werden.Kritische chemische Ausgangsstoffe müssen frisch sein und alle Schritte oder das Protokoll müssen strikt befolgt werden. Um das Haarwachstum auf der Rückenhaut von Mäusen in der zweiten Telogenphase zu induzieren, nachdem nach Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf den Pedalreflex bei etwa Tag 50 postnatalen Wurf Mate C57 schwarzen sechs Mäusen, verwenden Sie einen Rasierer und eine Enthaarungscreme, um zwei unabhängige nebeneinander liegende Hautregionen vom Rücken jeder Maus zu entfernen. Entfernen Sie nach einigen Minuten die Creme mit PBS und erfassen Sie das Haarfollikelwachstum durch die tägliche Aufnahme von hochauflösenden Bildern der Kontroll- und behandelten dorsalen Hautbereiche jedes Tieres.Um die Entstehung von Verbrennungen zweiten Grades auf der Rückenhaut von Mäusen in der zweiten Telogenphase zu induzieren, entfernen Sie die Haare vom Rücken der Maus. Einen Messingriegel mit einem Durchmesser von einem Zentimeter in kochendem Wasser auf 95 Grad Celsius erhitzen und den Riegel fünf Sekunden lang auf den zentralen Bereich der Maushaut auftragen. Unmittelbar nach der Entstehung der Verbrennung injizieren Sie den Tieren intraperitoneal einen Milliliter physiologischer Lösung, um eine Dehydrierung zu verhindern und den Mäusen zu ermöglichen, sich 24 Stunden lang zu erholen, bevor sie mit der Behandlung fortfahren.Für die Erzeugung von BrdU-markierten Retentionszellen oder LRCs injizieren 10 oder 14 Tage alte Wurfgeschwister an vier aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich intraperitoneal mit 50 Milligramm BrdU pro Kilogramm Körpergewicht in PBS. Lassen Sie die Mäuse nach der Markierungsphase 50 bis 60 Tage lang entwickeln, bevor Sie die Behandlung anwenden. Um die vorübergehende Produktion von nicht-letalen reaktiven Sauerstoffspezies oder ROS-Spiegeln in der Maushaut für eine Haarwuchsanalyse zu induzieren, tragen Sie nach der Aufnahme eines Ausgangsbildes des Haarwachstums topisch etwa 25 Milligramm mALA-Creme auf die rechte rasierte Hautregion auf und legen Sie das Tier 2,5 Stunden lang in die Dunkelheit.Am Ende der Photosensibilisatoren-Behandlung entfernen Sie gründlich überschüssige Creme mit PBS und bestätigen Sie die PP9-Produktion in situ durch rote Fluoreszenzexpression unter Blaulichtanregung, dann bestrahlen Sie die gesamte Rückenhaut mit einer geeigneten roten Lichtquelle für eine Gesamtdosis von 2,5 bis 4 Joule pro Quadratzentimeter. Lassen Sie die Mäuse dann auf einer Heizdecke mit Überwachung bis zum vollständigen Liegen erholen, bevor Sie die Tiere in ihre Käfige zurückbringen. Um die transiente ROS-Produktion für die Heilung von Verbrennungen zweiten Grades einzuschalten, tragen Sie etwa 25 Milligramm mALA-Creme auf die rechte Verbrennungsoberfläche und etwa vier Millimeter angrenzendes Gewebe auf und legen Sie die Tiere wie gezeigt 2,5 Stunden lang im Dunkeln.Bestrahlen Sie nach dem Entfernen der Creme die gesamte Rückenhaut und lassen Sie die Mäuse sich unter Überwachung erholen, wie gezeigt. Um eine vorübergehende ROS-Produktion in der Schwanzhaut zu induzieren, tragen Sie etwa 25 Milligramm mALA-Creme entlang des gesamten dorsalen Gewebebereichs der mit BrdU behandelten Mäuse auf und bestrahlen Sie die Rückenhaut des Schwanzes, wie gezeigt. Nachdem Sie die Mäuse eingeschläfert haben, entnehmen Sie die Schwanzhaut für den BrdU-Nachweis.Entnehmen Sie mit einem Skalpell den Schwanz von jedem Tier, machen Sie dann gerade Längsschnitte und schälen Sie die gesamte Haut in einem Stück von der Wirbelsäule. Inkubieren Sie die geschälten Hautstücke in fünf millimolaren EDTA und PBS und fünf Milliliter-Röhrchen für vier Stunden bei 37 Grad Celsius, um die sorgfältige Trennung der intakten Epidermisschichten von der Dermis mit einer Pinzette zu ermöglichen. Fixieren Sie das getrennte Gewebe mindestens 72 Stunden lang bei Raumtemperatur in 4%Formaldehyd und PBS.Markieren Sie dann das fixierte Gewebe mit den fluoreszenzkonjugierten Antikörpern, bevor Sie das Gewebe durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie gemäß Standardprotokollen sichtbar machen, um LRCs unter jeder experimentellen Bedingung zu identifizieren und zu quantifizieren. Für die ex vivo-Bewertung der ROS-Produktion wird nach der Ernte von Mausschwanzhautstücken, wie gezeigt, das unbehandelte Kontrollgewebe und fünf millimolare EDTA und PBS allein inkubiert und die photodynamischen Behandlungsproben in EDTA mit zwei millimolaren mALA ergänzt. Als nächstes fügen Sie jedem Gewebesatz Hydroethidin in einer Endkonzentration von 3,2 Mikromolaren hinzu und inkubieren Sie alle Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.Am Ende der Inkubation dehnen Sie die Schwanzhautproben mit den Fingerspitzen über eine Glasoberfläche und bestrahlen das behandelte Gewebe mit 636 Nanometern rotem Licht bei einer Fluenz von 10 Joule pro Quadratzentimeter. Trennen Sie am Ende der Behandlung sofort die Epidermis von der Dermis und fixieren Sie die Epidermisfolien mindestens 72 Stunden lang bei Raumtemperatur in 4% Formaldehyd und PBS. Am Ende der Fixierung wird die rote 2-Hydroxyethidium-Emission durch Fluoreszenzmikroskopie mit grünem, anregendem Licht bewertet, um die Aufnahme hochwertiger Bilder zu ermöglichen.Für den In-vivo-Nachweis der ROS-Produktion in der Rückenhaut werden unmittelbar nach der Rotlichtbestrahlung 100 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter DH-FDA und 50 % Ethanol auf alle Zielkontroll- und behandelten Hautbereiche aufgetragen. Die topische Verabreichung des mALA-Vorläufers auf die Rücken- und Schwanzhaut der Maus führt zu einer signifikanten Akkumulation von Protoporphyrin IX im gesamten Gewebe und spürbar im Haarfollikel, wie die rötlich-rosa Fluoreszenz dieser Verbindung unter Anregung von blauem Licht zeigt. Die anschließende Bestrahlung des behandelten Gewebes mit rotem Licht fördert die vorübergehende Produktion von ROS im Gewebe, insbesondere im Wölbungsbereich des Haarfollikels.Das Einschalten der nicht-letalen ROS-Produktion in der Maushaut in vivo führt zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl von LRCs in der Wölbungsregion des Haarfollikels zwei Tage nach der photodynamischen Behandlung. Bemerkenswert ist, dass der Anstieg der LRC-Zahlen vorübergehend ist und sechs Tage nach der Behandlung wieder auf ein normales Niveau zurückkehrt. Die vorübergehende ROS-Produktion beschleunigt die Hautheilung nach einer Verbrennung zweiten Grades.Die Quantifizierung der allmählichen Reduktion der geschädigten Haut zeigt die Robustheit und statistische Signifikanz des Gewebes zur Beschleunigung des Wundheilungsprozesses. In ähnlicher Weise fördern nicht-letale ROS-Spiegel das Haarwachstum nach der Rasur während des zweiten koordinierten Telogens, einer Phase, in der der Haarfollikel refraktär auf Wachstumsreize reagiert. Darüber hinaus wird auch die ROS-Produktion nach Photobehandlungen durch die Anwendung von antioxidativen Verbindungen deutlich reduziert.Die Herstellung von PP IX in situ durch Expression von roter Fluoreszenz unter Anregung von blauem Licht muss sorgfältig bestätigt werden. Um die ROS-Produktion zu induzieren, muss die Bestrahlungsstärke der roten Lichtquelle korrekt eingestellt werden. im Vergleich zu Gewebe und Gesamtlichtdosis.Nach der ROS-Induktion können aktuelle biochemische sowie zell- und molekularbiologische Techniken verwendet werden, um gesammelte Proben zu analysieren und die dynamische physiologische Reaktion des Gewebes zu bewerten. Unsere Methodik bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um den physiologischen Effekt einer vorübergehenden Produktion von endogenen ROS in einem Gewebe in vivo zu untersuchen. Dies ist ein neuer experimenteller Ansatz, der für Forscher auf dem Gebiet der ROS-Signalübertragung sehr nützlich sein kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein umfassendes und detailliertes Protokoll darüber bereitzustellen, wie genetisch veränderte menschliche organotypische Haut aus epidermalen Keratinozyten und devitalisierter menschlicher Dermis erzeugt werden kann.

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Wir beschreiben eine nicht-invasive in Vivo imaging-Protokoll, das schlanke und kostengünstige, Verwendung von L-012, eine Chemolumineszenz Luminol-Analog, zu visualisieren und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzielte eine excisional Wunde Mausmodell zu quantifizieren.

In Vivo Bildgebung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Murine Wunde Modell

Wir schlagen eine Protokoll, die zeigt, wie man differenzieren induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Keratinozyten und Fibroblasten und generieren eine organoide 3D Haut mit diesen Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll enthält einen zusätzlichen Schritt einem humanisierten Mäuse-Modell zu erzeugen. Die hier vorgestellten Technik verbessert die dermatologische Forschung.

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Kultivierung epidermaler Sphäroide in 3D-Suspensionskultur. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen für den Einsatz in einer Vielzahl von epithelialen Gewebetypen und für die Modellierung mehrerer menschlicher Krankheiten und Zustände.

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Hier beschreiben wir ein optimiertes Direktreprogrammierungssystem für Melanozyten und ein hocheffizientes, konzentriertes Virusverpackungssystem, das eine reibungslose direkte Reprogrammierung gewährleistet.

Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten

Traditionell wird die Zellkultur auf planaren Substraten durchgeführt, die die natürliche Umgebung von Zellen in vivo schlecht nachahmen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Zellkultursubstraten mit physiologisch relevanten gekrümmten Geometrien und mikrostrukturierten extrazellulären Proteinen, die systematische Untersuchungen der zellulären Erfassung dieser extrazellulären Hinweise ermöglicht.

Erzeugung von Multicue-Zellmikroumgebungen durch UV-Photostrukturierung von dreidimensionalen Zellkultursubstraten

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Verwendung von Hydrogel als dreidimensionales (3D) Zellkulturgerüst für die ADSC-Kultur (Adipose-Derived Stem Cells) demonstriert und Photobiomodulation (PBM) einführt, um die Proliferation von ADSCs innerhalb der 3D-Kulturumgebung zu verbessern.

Dreidimensionale Zellkultur von aus Fett gewonnenen Stammzellen in einem Hydrogel mit Photobiomodulationsaugmentation

Die Kombination aus iterativem Bleaching-Extends-Multiplexity (IBEX) und einem kommerziellen Nukleotidmarkierungsassay (Click-iT EdU) ermöglicht den Nachweis und die Kategorisierung von sich teilenden Zelltypen in hochdynamischen Prozessen in fixierten gefrorenen murinen Gewebeschnitten. Darüber hinaus ermöglicht eine neuartige Open-Source-Bildverarbeitungspipeline eine Bilderfassung und -analyse mit hohem Durchsatz.

Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analyse-Workflow zur Bewertung von Hautzell-Phänotypen und Proliferationszuständen in Gewebeproben

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Hautorganoiden, die Haarfollikel aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen enthalten, unter Verwendung eines planaren, physiologisch relevanten Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultursystems, um die Hautarchitektur und -funktion zu replizieren.

Erzeugung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten planaren haartragenden Hautorganoiden unter Verwendung eines Luft-Flüssig-Grenzflächenkultursystems

Diese Methode untersucht, wie seneszente Hautfibroblasten gesunde Fibroblasten beeinflussen. Die Seneszenz wird durch UVB-Exposition induziert, und das konditionierte Medium wird auf normale Fibroblasten angewendet. Sie hilft dabei, bioaktive Verbindungen zu bewerten, die auf veränderte Zell-zu-Zell-Kommunikation bei der Hautalterung abzielen.

Neue Kombination von Antioxidantien zur Wiederherstellung gesunder interzellulärer Kommunikation in einem in-vitro-Modell unter Verwendung eines konditionierten Mediums aus alter Zellen

Erfahren Sie eine Methode zur induzierten ROS-Produktion in Maushaut mittels mALA-Creme und Rotlicht zur Stimulation von Stammzellnischen. Dieses Verfahren ermöglicht kontrollierte Geweberegeneration und Haarwachstum.

Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ (Video) | JoVE Journal

Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

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