Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben

Die Patientenbindung ist sehr anspruchsvoll und der Arzneimittelstoffwechsel kann von Person zu Person variieren, so dass sich eine objektive Messung des Arzneimittelspiegels als wichtig erweisen kann, um das Auftreten von Resistenzen während der TB-Behandlung zu verhindern. Wenn die Einhaltung genauer und leichter quantifiziert werden könnte, könnten die Gesundheitsdienstleister einen Behandlungsplan entwickeln, der die Entwicklung von Medikamentenresistenzen einschränken würde. Wir haben das erste multiple Analyt-Massenspektrometrie-Panel für mehrere TB-Medikamente in kleinen Haarproben in einem einzigen Test entwickelt.

Unser Multi-Drogen-Panel benötigt nur eine Zwei-Milligramm-Probe pro Patient und verwendet weder festphase Extraktion oder Filterschritt, um einen Verlust des Probenvolumens zu verhindern. Objektive Maßnahmen der Drogenexposition, die früh im Behandlungsverlauf gemessen werden, könnten Kliniker möglicherweise auf Probleme mit einzelnen Medikamenten in der Behandlungstherapie aufmerksam machen. Haarproben müssen am Tag der Analyse für eine genaue Messung des Wirkstoffkonzentrationsniveaus pulverisiert werden.

Um Haarproben zu erwerben, nach schriftlicher Einwilligung in Kenntnis der Sachlage, bereiten Sie Materialien bereit, darunter ein dünnes Etikett, zwei Teilnehmeretiketten, eine Schere, ein aufgeklapptes Stück Aluminiumfolie, ein Alkoholtuch und eine Plastiktüte. Wischen Sie die Klingen der Schere mit einem Alkoholwisch sauber. Gehen Sie auf die Rückseite des Kopfes und heben Sie den oberen Teil des Haares mit einem Haarspange, wenn gewünscht.

Sammeln Sie 30 Haarsträhnen von der Rückseite des Kopfes und isolieren Sie den Strohstrich mit der Hand. Nehmen Sie die Schere auf die Kopfhaut und schneiden Sie den Strohstrich der Haare. Legen Sie den Strohhut des Haares vorsichtig auf die Aluminiumfolie.

Legen Sie das dünne Etikett über das distale Ende der Haarstroh, und kleben Sie es sicher auf die Aluminiumfolie. Das distale Ende ist die Seite am weitesten von der Kopfhaut entfernt. Falten Sie über das Stück Aluminiumfolie auf der Oberseite der Haarstroh und legen Sie ein Teilnehmer-Etikett auf die Aluminiumfolie.

Legen Sie das gefaltete Stück Aluminiumfolie in die Plastiktüte und legen Sie ein weiteres Teilnehmeretikett auf die Plastiktüte. Für die Arzneimittelextraktion aus den Haarproben wägen sie zwei Milligramm jeder Haarprobe in einzeln beschriftete Perlenröhrchen und zwei Milligramm der rohen Haarprobe in jeweils 16 zusätzliche Perlenröhrchen ab. Nach dem Wiegen alle Perlenrohre in einen Perlenmühlenhomogenisator geben und die Proben mit einer Geschwindigkeit von 6,95 Metern pro Sekunde für zwei 30-Sekunden-Zyklen mit einer 15-Sekunden-Ruhezeit zwischen jedem Zyklus homogenisieren.

Nach der zweiten Homogenisierung 500 Mikroliter der entsprechenden internen Standardmischung zu jeder Probe hinzufügen und 500 Mikroliter Methanol in das Matrix-Rohrohr geben. Spike die Kalibrierkurvenrohre mit dem entsprechenden Volumen der Referenzstandardmischung nach der Tabelle und legen Sie alle Rohre in einem 37-Grad-Wasserbad mit sanftem Schütteln für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation den Überstand von jedem Perlenrohr in neue markierte Mikrozentrifugenrohre übertragen und 500 Mikroliter Methanol in die Perlenröhrchen geben.

Wirbeln Sie die Perlenrohre und übertragen Sie die Methanolwäsche auf die entsprechenden Mikrozentrifugenrohre. Zentrifugieren Sie die Proben und übertragen Sie die Überstande vorsichtig in neue Schläuche, ohne die Haarpellets zu stören. Verdampfen Sie die Flüssigkeit in den Rohren auf Trockenheit bei 32 Grad Celsius und rekonstituieren Sie die Proben mit 200 Mikroliter Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Grade-Wasser mit 1% Ameisensäure.

Nach dem Wirbeln die flüssigen Proben mit 250 Mikroliter-Einsätzen auf Bernsteinfläschchen übertragen. Für die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie installieren Sie zunächst eine Zwei- bis 100-Millimeter-Säule mit einer Partikelgröße von 2,5 Mikrometern und 100 Angstrom-Porengröße mit polaren, ethergebundenen Phenolperlen vollständig aus porösem Kieselsäure in das Säulenfach. Vergewissern Sie sich, dass in der Spalte auch eine vom Hersteller empfohlene Schutzkassette installiert ist.

Kopieren und fügen Sie die zusammengesetzten Informationen in den MDR-TB LCMS-Methodenübergängen ein. csv-Datei in das Feld im Massenspezifikationsfenster. Erstellen Sie in einer Kalkulationstabelle eine Chargensequenz der Kalibrierkurve, Qualitätskontrollen, Patientenproben, Kalibrierkurven, Qualitätskontrollen, Patientenproben, Kalibrierkurven und Qualitätskontrollen.

Fügen Sie Lösemittel-Rohlingsinjektionen am Anfang und AmEnde des Laufs sowie vor und nach der Kalibrierkurve, Qualitätskontrollen und Patientenproben hinzu. Dann legen Sie mindestens acht Lösemittel-Leerinjektionen in die Injektionen in die Kalibrierkurve und die hochwertige Kontrolldurchstechsons, um die Analytübertragung zu reduzieren. Wenn die Batches abgeschlossen sind, öffnen Sie die Quantifizierungssoftware.

Führen Sie einen Bildlauf durch die Übergänge durch, um sicherzustellen, dass die automatisch ausgewählte Aufbewahrungszeit korrekt ist, und überprüfen Sie, ob die Glausssche Glättung auf 1,5 eingestellt ist. Klicken Sie als Nächstes auf die Kalibrierungskurve und die Regression, und legen Sie den Wartetyp auf eins über x fest. Klicken Sie auf OK, und überprüfen Sie die Kalibrierkurve und die Qualitätskontrollproben, um sicherzustellen, dass die Charge erfolgreich ausgeführt wurde.

Für jeden Quantifier-Referenzanalyten müssen mindestens zwei Drittel der Kalibrierpunkte eine Genauigkeit zwischen 80-120% aufweisen, um zu überprüfen, ob der über der Kalibrierkurve angezeigte R-Wert größer als 0,975 ist. Wenn alle oben genannten Bedingungen erfüllt sind, ist die Charge vorbei und die Proben können quantifiziert werden. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Bearbeiten und auf Gesamte Tabelle kopieren.

Fügen Sie dann die Tabelle in eine Tabelle ein und verwenden Sie den Durchschnitt der berechneten Konzentration der beiden Probeninjektionen, um die gemeldete Konzentration jeder Probe zu bestimmen. Hier ist eine Abbildung eines Chromatogramms mit bestätigten Konzentrationen aller getesteten 11 medikamentenresistenten TB-Medikamente gezeigt. In diesen Zahlen können die extrahierten Ionenchromatogramme für ein bestimmtes Medikament in einem der Kalibratoren beobachtet werden.

Die Quantifizierer- und Qualifiziererübergänge werden verwendet, um das Vorhandensein des Arzneimittels qualitativ zu bestätigen, da das Verhältnis zwischen dem Bereich des Quantifizierers und dem Bereich der Qualifizierer die konstante zwischen den Proben bleibt. Der interne Standard wird ebenfalls überwacht, um sicherzustellen, dass jede Probeninjektion normalisiert wird. In dieser Analyse wurde eine praktische Stichprobe von 15 Haarproben unter einer Gesamtpopulation von 96 Patienten, die medikamentenresistente TB-Medikamente unter direkt beobachteten Therapiebedingungen aus Westkap, Südafrika, einnehmen, untersucht, um repräsentative Konzentrationen von medikamentenresistenten TB-Medikamenten über die niedrigsten und höchsten Werte für jeden Analyten zu bestimmen.

In Ermangelung eines festen Phasenextraktions- oder Filterschritts achten Sie beim Übertragen des Überstandes in die Verdampfungsrohre. Alles, was in die Rohre übertragen wird, kann in die Säule injiziert werden. Da der Rotor des Perlenraptors abfliegen kann, wenn er nicht fest verschraubt oder verriegelt ist, sollten Sie den Rotor vor dem Betrieb doppelt überprüfen.

Im Gegensatz zu antiretroviralen Medikamenten im Bereich HIV bleibt die Beziehung zwischen Derasetik, Adhinetik, Adhinetik und klinischen Ergebnissen von TB-Medikamenten weitgehend unerforscht. Wir haben vermutet, dass einige TB-Medikamente nicht gut im Haar ansammeln. Die Bekämpfung der Metaboliten dieser Medikamente kann ein besseres Verständnis der Patientenhaftung bieten.