Microwaving und Fluorophor-Tyramid für Multiplex-Immunostainierung auf Maus-Adrenals – Verwendung von unkonjugierten Primärantikörpern aus den gleichen Wirtsarten

Immunostaining ist weit verbreitet in der biomedizinischen Forschung verwendet, um den Standort eines Proteins von Interesse zu identifizieren. Multiplex-Immunostaining kann mehrere Ziele auf derselben Probe mit verschiedenen primären Antikörpern erkennen. Der Vorteil dieser Methode ist die Verwendung allgemein verfügbarer Puffer zur Eliminierung der Antikörper-Kreuzreaktivität, die eine Immunfärbung mit zwei oder mehr nicht gekennzeichneten Primärantikörpern derselben Wirtsart ermöglicht.

Demonstriert wird das Verfahren von Sophia Zheng, einer Doktorandin, und Qiongxia Lyu, einer Gastwissenschaftlerin meines Labors. Vor der Färbung, de-Wachs und rehydrieren formalin-fixierte Paraffin-eingebettete Dias mit fünfminütigen Eintauchen in jede Lösung wie angegeben. Nach dem zweiten destillierten Wassereintauchen die Dias in 275 Milliliter kochender Natriumcitratlösung auf den Boden einer Pipettenkippe mit Deckel legen und die Box acht Minuten lang in eine 700-Watt-Mikrowelle bei 75% Leistung legen.

Öffnen Sie am Ende der Behandlung den Deckel und lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die Dias mit drei fünfminütigen Wärten von frischem PBST in einem Coplin-Glas waschen. Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, schütteln Sie nach dem letzten Waschen den überschüssigen PBST von jedem Dia und bedecken die Dias mit einem ausreichenden Volumen einer geeigneten Blockierlösung. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer die überschüssige Blockierlösung von jedem Dia schütteln und 250 Mikroliter des ersten primären Antikörpers von Interesse in jede Probe hinzufügen.

Um ein Austrocknen der Proben zu verhindern, können die Dias mit einem Stück Paraffinfolie bedeckt sein. Nach einer nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer die Dias dreimal mit frischem PBST fünf Minuten pro Waschgang waschen. Schütteln Sie den überschüssigen PBST ab und bedecken Sie dann schnell jeden Schlitten mit 250 Mikrolitern einer geeigneten Sekundärantikörperlösung für eine einstündige Inkubation in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur.

Am Ende der Inkubation die Dias dreimal in frischem PBST waschen, wie gezeigt, und 250 Mikroliter frisch zubereiteter Streptavidin-Meerrettichperoxidase zu jeder Rutsche hinzufügen. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur die Dias dreimal in frischem PBST waschen. Dann schütteln Sie den überschüssigen PBST ab und bedecken Sie jeden Schlitten mit 250 Mikroliter frisch zubereiteter Fluorophor-Tyramid-Lösung.

Eine Minute später tauchen Sie die Dias in frisches PBST ein, gefolgt von drei zweiminütigen Wärten in frischem PBST. Nach der letzten Wäsche einige Tropfen einer Eins-zu-Eins-Glyzerin-zu-PBS-Lösung auf die Abschnitte auftragen und durch Fluoreszenzmikroskopie auf das Vorhandensein eines Fluoreszenzsignals überprüfen. Um den ersten Antikörperkomplex abzustreifen, legen Sie die mit Antikörperbeschrifteten beschrifteten Dias mindestens acht Minuten lang in 275 Milliliter kochende Natriumcitratlösung.

Am Ende der Behandlung öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die Dias dreimal mit PBST für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Um für das zweite Zielprotein von Interesse zu färben, nach der Blockierung für unspezifische Bindung wie gezeigt, beschriften Sie jede Probe mit 250 Mikroliter des zweiten primären Antikörpers von Interesse bei vier Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Morgen die Dias dreimal fünf Minuten in frischem PBST pro Wäsche waschen, bevor sie jede Rutsche mit 250 Mikrolitern einer geeigneten Sekundärantikörperlösung für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur bedecken.

Am Ende der Inkubation die Dias dreimal in frischem PBST waschen, wie gezeigt, und 250 Mikroliter frisch zubereiteter Streptavidin-Meerrettichperoxidase zu jeder Rutsche hinzufügen. Um das Signal für das zweite Zielprotein von Interesse zu entwickeln, behandeln Sie nach drei PBST-Washes die Dias mit dem fluorophorkonjugierten Tyramid in einem anderen Fluoreszenzspektrum. Um die Tyramidsignalentwicklung zu stoppen, tauchen Sie die Dias in PBST ein.

Dann färben Sie die Proben mit einem geeigneten Kernfarbstoff. Für die Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie, montieren Sie jeden Kernfarbstoff beschrifteten Schlitten mit einem Tropfen eines geeigneten Montagemediums in einem Deckelschlupf. Verwenden Sie das 4X-Objektiv, um das Gewebe auf der Folie zu lokalisieren.

Wechseln Sie zum 10-Fach-Objektiv für die Bildgebung und passen Sie die Belichtungszeit mit der Lichtquelle zwischen 40 und 80 % Intensität auf 100 bis 400 Millisekunden an. Dann erhalten Sie Bilder in jedem Kanal, ohne die Bühne zu bewegen. Die Bilder von jedem Kanal können zu einem Multiplex-Fluoreszenzbild zusammengeführt werden.

Ohne Stripping zwischen der ersten und sekundären Antikörperfärbung nimmt die zweite Färbung von Tyrosinhydroxylase Signale vom ersten Zielprotein auf, was zu einer falsch positiven Tyrosinhydroxylase-Färbung führt, z. B. in dieser Probe innerhalb der Nebennierenrinde. Um die Antikörper-Kreuzreaktivität in der Meerrettichperoxidase aus der ersten Immunostainierung zu entfernen, kann ein- und achtminütiges Mikrowellen-vermitteltes Abisolieren durchgeführt werden, was zu sauberen doppelten Färbungsergebnissen führt. In Negativkontrollproben wird kein signifikantes Signal aufgenommen.

Acht-Minuten-Stripping im kochenden Citratpuffer ist auch ausreichend, um Antikörper-Kreuzreaktivität für viele Antikörper häufig in der Nebenniere verwendet zu beseitigen. In einigen Fällen ist jedoch immer noch ein schwaches falsch positives Signal nachweisbar, und eine Erhöhung der Mikrowellenbehandlung um 20 Minuten kann den Antikörper-Kreuzreaktivität noch nicht vollständig entfernen. Bei der Fluoreszenz-Bildgebung ist es wichtig, die Stufe beim Umschalten der Kanäle nicht zu bewegen.

Es kann jedoch notwendig sein, den Fokus neu zu justieren, um klare Bilder von jedem Kanal zu erhalten. Stellen Sie für jeden Kanal sicher, dass Sie die Belichtungszeit anpassen, um sicherzustellen, dass die Signale ohne überbelichtete Pixel oder Bereiche in den Bildern angemessen belichtet werden. Während des Färbevorgangs ist es wichtig, die Dias von der Entwachsung hydratisiert zu halten und die Dias können mehrmals mit den gleichen Abisolierverfahren entfernt werden, um Multiplexfärbung zu ermöglichen.