Kombinierte Infusion und Stimulation mit zyklischer Fast-Scan-Voltammetrie (CIS-FSCV) zur Beurteilung der ventralen Tegmental-Area-Rezeptor-Regulation von phasischem Dopamin

Dieser Ansatz kann dazu beitragen, die Rolle des spezifischen ventralen tegmentalen Bereichs, der somatodendritischen Rezeptoren und der phasischen Dopaminfreisetzung im Nucleus accumbens aufzuklären. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass Fragen zur Kontrolle der Rezeptorfunktion über die phasische Dopaminfreisetzung im intakten Gehirn beantwortet werden können. Die Optimierung der Position der Kohlefaser-Mikroelektrode und des bipolaren Stimulators kann eine Herausforderung sein, und einige Ratschläge für Anfänger sind die Aufnahme im dorsalen Striatum.

Aufgrund der Verwendung und Manipulation mehrerer Arten von Elektroden, einschließlich Aufzeichnungs-, Referenz- und Stimulationselektroden, ist eine visuelle Anleitung, wann und wo diese Elektroden implantiert werden, nützlich. Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf den Pedalreflex reagieren, reinigen Sie die Kopfhaut einer anästhesierten Ratte mit drei aufeinanderfolgenden Jodopovidon- und 70%igen Ethanol-Peelings. Schneiden Sie nach dem letzten Peeling mit einer sterilisierten Spitzpinzette und einer chirurgischen Schere genug Kopfhautgewebe ab, um Platz für die implantierten Elektroden zu schaffen.

Reinigen Sie die freiliegende Schädeloberfläche vorsichtig mit sterilisierten Wattestäbchen-Applikatoren, bevor Sie zwei bis drei Tropfen 3%iges Wasserstoffperoxid auftragen, um Lambda und Bregma zu identifizieren. Verwenden Sie als Nächstes einen Ein-Millimeter-Bohrer, der auf etwa 20.000 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, um ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern zu bohren, das 2,5 Millimeter vor und 3,5 Millimeter seitlich des Bregmas verläuft. Implantieren Sie eine 3,2 Millimeter lange Schraube mit einem Außendurchmesser von 1,59 Millimetern etwa zur Hälfte in das Loch, bis die Schraube fest sitzt.

Bohren Sie als Nächstes ein Referenzelektrodenloch mit einem Durchmesser von einem Millimeter in die linke Hemisphäre, 1,5 Millimeter vorne und 3,5 Millimeter lateral des Bregmas. Führen Sie etwa zwei Millimeter Referenzdraht in das Loch ein, während Sie den Draht um und unter den Kopf der implantierten Schraube wickeln. Implantieren Sie dann die Schraube vollständig und stecken Sie die Referenzelektrode fest.

Bohren Sie in der rechten Hemisphäre ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern, 1,2 Millimeter vorne und 1,4 Millimeter lateral des Bregmas und entfernen Sie die Dura vorsichtig mit einer Pinzette. Für die Stimulationselektrode bohren Sie ein quadratisches Loch zwei Millimeter anterior-posterior und fünf Millimeter medial-lateral, zentriert bei 5,2 Millimeter posterior und einen Millimeter lateral zum Bregma. Senken Sie die bipolare Stimulationselektrodenführungskanüle mit stereotaktischen Armstäben fünf Millimeter unter die Dura ab.

Senken Sie die Kohlefaser-Mikroelektrode mit den stereotaktischen Armstäben vier Millimeter unter der Dura am hintersten Teil des Striatums ab und verbinden Sie den Referenzdraht und die Kohlefaser mit einem Potentiostaten. Legen Sie dann 15 Minuten lang bei 60 Hertz eine Dreieckswellenform mit minus 0,4 bis 1,4 Volt und 400 Volt pro Sekunde an, gefolgt von einem 10-minütigen Stimulus bei 10 Hertz. Um die Position der Stimulationselektrode zu optimieren, stellen Sie den Stimulator so ein, dass er eine bipolare elektrische Wellenform mit einer Frequenz von 60 Hertz, 24 Impulsen, einem Strom von 300 Mikroampere und einer Impulsbreite von zwei Millisekunden pro Phase erzeugt.

Senken Sie den Stimulator vorsichtig in Schritten von 0,2 Millimetern von 5 bis 7,8 Millimetern unter die Dura ab und stimulieren Sie den VTA bei jedem Schritt. Senken Sie die bipolare Stimulationselektrodenführungskanüle weiter ab, bis eine Stimulation eine phasische Dopaminfreisetzung an der Kohlefaser-Mikroelektrode im dorsalen Striatum erzeugt. Sobald eine Dopaminfreisetzung beobachtet wurde, senken Sie die Kohlefaser-Mikroelektrode bis sie mindestens sechs Millimeter unter der Dura in den hintersten Teil des Kerns des Nucleus accumbens ab.

Wenn die Elektrode in Position ist, stimulieren Sie den VTA und zeichnen Sie die Spitzenamplitude des Dopamin-Peaks auf, senken oder heben Sie dann die Kohlefaser-Mikroelektrode auf die Stelle, die die größte Dopaminfreisetzung erzeugt, und stellen Sie sicher, dass der Höhepunkt der Dopaminreaktion als klarer Oxidationspeak bei 0,6 Volt und als Reduktionspeak bei minus 0,2 Volt dargestellt wird. Sobald die Position der Kanüle aus Kohlefaser und Stimulationselektrode optimiert wurde, stimulieren Sie das Tier alle drei Minuten für 20 bis 30 Minuten. Nachdem Sie eine stabile Basislinie erreicht haben, senken Sie die innere Kanüle vorsichtig von Hand in die Führungskanüle ab, die bereits in den bipolaren Stimulator eingepasst ist, und machen Sie zwei bis drei zusätzliche Basisaufnahmen, um zu bestätigen, dass das Einführen der Kanüle keine Veränderung des evozierten Signals verursacht hat.

Sobald ein Ausgangsansprechen festgestellt wurde, verwenden Sie eine Spritzenpumpe und eine Mikrospritze, um 0,5 Mikroliter der interessierenden Arzneimittellösung über einen Zeitraum von zwei Minuten in die VTA zu infundieren. Lassen Sie die innere Kanüle nach der Infusion mindestens eine Minute lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie entfernen, und zeichnen Sie die Reaktion weiterhin alle drei Minuten auf, um die Auswirkungen nach der Infusion zu messen. Wie in diesen repräsentativen Farbdiagrammen gezeigt, verändert die Kochsalzinfusion die stimulierte phasische Dopaminfreisetzung nicht.

Die Infusion von NMDA führt zu einem robusten Anstieg der stimulierten phasischen Dopaminfreisetzung, während der kompetitive NMDA-Rezeptor-Antagonist AP5 einen robusten Abfall bewirkt. Sowohl der nicht-kompetitive nikotinische Acetylcholinrezeptor-Antagonist Mecamylamin als auch der nicht-selektive kompetitive muskarinische Acetylcholin-Rezeptor-Antagonist Scopolamin erzeugen eine robuste Abnahme der stimulierten phasischen Dopaminfreisetzung. In dieser Grafik ist eine Zusammenfassung der Auswirkungen der getesteten Medikamente im Laufe der Zeit zu sehen.

Die Infusionskanüle muss vorsichtig in die bipolare Stimulationselektrode eingeführt werden. Andernfalls kann es zu übermäßigen Schäden kommen, die zu künstlichen Veränderungen der phasischen Dopaminfreisetzung führen. Dieser Ansatz hat es den Forschern ermöglicht, die spezifischen Rezeptormechanismen, durch die die phasische Dopaminfreisetzung in vivo reguliert wird, genauer zu untersuchen.