Einfache Lithographie-freie Einzelzell-Mikromusterung mit Laser-Cut Schablonen
3. April 2020
Dieses Protokoll führt eine lithographiefreie Mikromustermethode ein, die einfach und zugänglich für Personen mit einem begrenzten Bioengineering-Hintergrund ist. Diese Methode verwendet maßgeschneiderte lasergeschnittene Schablonen, um extrazelluläre Matrixproteine in einer Form von Interesse für die Modulation von Zellmorphologien mikromustern zu lassen. Das Verfahren zur Mikromusterung wird mit induzierten pluripotenten Stammzellabgeleiteten Kardiomyozyten demonstriert.
Wir beschreiben eine schablonenbasierte lithographiefreie Einzelzell-Mikromustermethode, die viele Hindernisse im Zusammenhang mit Photolithographie und weicher Lithographie überwindet. Die Schablonen sind wiederverwendbar und der Prozess ist kostengünstig und anpassbar. Diese Methode eröffnete nicht-technischen Forschern einen neuen Weg, um die Zellform und die flächeninduzierte Mechanotransduktion in verschiedenen physiologischen und pathologischen Kontexten zu untersuchen.
Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Mikromusterung von Tausenden von Zellen, die für das Screening von Arzneimitteln mit hohem Durchsatz und die Modellierung von Krankheiten in einer Schale verwendet werden können. Visuelle Demonstration wird die Implantation von zwei entscheidenden Schritten erleichtern: Ablösung von Deckelrutsch von Hydrogel, Trocknen Hydrogel ausreichend vor dem Platzieren der Schablone. Bereiten Sie die Polyacrylamid-Hydrogellösung in einem neuen 50 Milliliter Propylenzentrifugenrohr vor, wie im Manuskript beschrieben.
Als nächstes, um die 5%Photoinitiator-Lösung vorzubereiten, lösen Sie die Zutaten in 700 Mikroliter von 100%Ethanol auf. Die Zutaten sind nicht wasserlöslich, also achten Sie darauf, sich vollständig durch Wirbel aufzulösen. Fügen Sie 300 Mikroliter PBS für ein endgültiges Volumen von einem Milliliter hinzu.
Arbeiten auf Eis, verdünnt Keller Membran Matrix Protein-Stock-Lösung mit eiskalten DMEM F12 Medien oder 1X PBS auf das optimierte Verdünnungsverhältnis. Halten Sie auf Eis für den späteren Gebrauch. Achten Sie bei der Arbeit mit der Kellermembranmatrix darauf, immer auf Eis zu arbeiten und eiskalte Lösungen in gekühlten Pipettenspitzen und -rohren zu verwenden.
Legen Sie eine UV-Tischleuchte in eine biologische Sicherheitshaube. Als nächstes stellen Sie die zuvor vorbereiteten sterilisierten Paraffinfolien auf. Wenn die Paraffinfolien nicht vollständig trocken sind, verwenden Sie ein Vakuum-Aspirationssystem, um Restflüssigkeit zu entfernen.
Mit autoklavierten Zangen legen Sie sechs autoklavierte Abdeckungen auf den Paraffinfilm sechs in jeder Petrischale. Zur Herstellung der UV-verklinkbaren Polyacrylamid-Endlösung die Photoinitiatorlösung mit der Polyacrylamid-Hydrogel-Vorläuferlösung verdünnen. Sterilisieren Sie die Lösung mit einer 50-Milliliter-Filtereinheit mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern.
Dann geben Sie 200 Mikroliter UV-verklinkbare Polyacrylamid-Endlösung auf jede der sechs Glasabdeckungen in den Petrischalen. Mit autoklavierten Zangen, sorgfältig abdecken jeden Abdeckungsslip mit einem zweiten Deckelrutsch, der eine Schicht der Lösung zwischen den beiden Abdeckungen einfängt. Legen Sie die Petri-Schalen mit den Abdeckungen unter die UV-Tischlampe mit dem Deckel unverschlossen.
Die Abdeckung von weißem Papier auf der nicht-weißen Oberfläche ist wichtig, um den UV-Intensitätsverlust zu minimieren. Zum Schutz vor UV-Strahlung, decken Sie die Lampe mit Aluminiumfolie. Photopolymerisieren Sie die Polyacrylamid-Hydrogele für fünf Minuten.
Verwenden Sie eine Rasierklinge, um jedes Paar Deckenlippen sorgfältig zu trennen. Füllen Sie das Reservoir mit sechs Hydrogel-Abdeckungs-Verbundwerkstoffen mit PBS. Nach dem Spülen für fünf Minuten, geben Sie die Hydrogel-Abdeckungsrutsch-Verbundwerkstoffe in die Paraffinfolie in der Petrischale zurück.
Erhalten Sie eine Röhre Sulfo-SANPAH aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Fügen Sie 1, 200 Mikroliter vorgekühlten PBS in das Rohr und mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten. 200 Mikroliter des verdünnten Sulfo-SANPAH in der Petrischale auf den Paraffinfilm geben.
Legen Sie einen Hydrogel-Abdeckungs-Verbundstoff über den Sulfo-SANPAH mit dem Hydrogel, das den Sulfo-SANPAH kontaktiert. Als nächstes legen Sie die Hydrogel-Abdeckungs-Verbundwerkstoffe unter die UV-Lampe und setzen sie für fünf Minuten aus, um den Sulfo-SANPAH zu aktivieren. Wenn sich der Sulfo-SANPAH von orange zu braun dreht und eine erfolgreiche Aktivierung und Einarbeitung anzeigt, fahren Sie innerhalb von 10 Minuten mit den nächsten Schritten fort.
Füllen Sie das Einweg-Polypropylen-Reservoir mit frischem PBS auf. Übertragen Sie die aktivierten Hydrogel-Abdeckungs-Verbundwerkstoffe in das Reservoir und spülen Sie sie kurz aus, um ungebundenes Sulfo-SANPAH zu entfernen. Die Hydrogel-Abdeckungsrutsch-Verbundwerkstoffe auf die Paraffinfolie in die Petrischalen legen und sorgfältig mit sterilen fusselfreien Tüchern abziehen.
Legen Sie eine Schablone auf jeden Hydrogel-Abdeckungs-Verbund. Um eine enge Abdichtung zwischen Schablone und Verbundwerkstoff zu gewährleisten, entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit, indem Sie mit autoklavierten fusselfreien Tüchern dabben. Geben Sie vorsichtig die verdünnte Kellermembran-Matrix-Proteinlösung aus, die 200 Mikroliter auf jedem Hydrogel-Abdeckungsverbund platziert.
Inkubieren Sie die Konstrukte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag die Verbundwerkstoffe auf eine Sechs-Brunnen-Platte übertragen. Eine enge Abdichtung zwischen Hydrogel und Schablone kann leicht validiert werden, indem beobachtet wird, ob die Matrixproteinlösung auf der Schablone erhalten geblieben ist.
Wenn keine enge Dichtung entfällt, führt dies zu einem schnellen Leck der Proteinlösung durch die Löcher. Tauchen Sie die Verbundwerkstoffe vollständig in PBS ein. Mit autoklavierter Pinzette die Schablonen vorsichtig von den Hydrogelen lösen, ohne die Hydrogele zu zerreißen.
Entfernen Sie die PBS aus den Brunnen und füllen Sie die Brunnen mit DMEM auf. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Platte aus dem Inkubator entfernt haben, untersuchen Sie die DMEM.
Wenn das DMEM nicht trübe ist, können die Hydrogel-Abdeckungs-Verbundwerkstoffe für die Zellbeschichtung verwendet werden. Schablonen wurden mit Arrays von Quadraten und Rechtecken hergestellt. Aus den Schablonen und Inseln des Matrixproteins wurden mikrogemusterte Hydrogelsubstrate hergestellt.
Zellinseln wurden ebenfalls erhalten. Zum Beispiel Inseln von vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten. Die Matrixproteinkonzentration spielte eine wesentliche Rolle bei der Erzeugung richtiger Muster.
Eine optimale Konzentration führte zu einer homogenen Verteilung von Proteinen. Suboptimale Matrixproteinlösungskonzentrationen führten zu suboptimalen Mustern. Es ist wichtig, die Vorderseite der Schablone zu verwenden.
Wenn die Rückseite der Schablone verwendet wird, erhöht sich die Größe der Matrixproteininseln aufgrund der Richtung des Laserschneidens. Während die Verwendung der Rückseite der Schablone die Breite der rechteckigen Muster nicht signifikant beeinflusste, erhöhte sich die Höhe signifikant, was zu einer Verringerung des beabsichtigten Seitenverhältnisses führte. Schablonenbasierte Musterung wurde auf Siliziumelastomersubstrate angewendet.
Die gemusterten Kardiomyozyten auf Siliziumelastomersubstraten wurden durch Immunzytochemie des Kardialtroponins T bei geringer Vergrößerung und durch sarkomisches Protein Alpha-Actinin bei hoher Vergrößerung visualisiert. Die schablonenbasierte Musterung wurde auch auf Muster zwei Kardiomyozyten nebeneinander auf Hydrogele mit unterschiedlichen Steifigkeiten angewendet. Die Entdeckung von vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen und entsprechenden Differenzierungsprotokollen hat dies zu einem idealen in vitro menschlichen Modell für die Untersuchung von Onkogenese und Pathogenese gemacht.
Eine wesentliche Einschränkung der Verwendung des IPS-Systems ist jedoch das Fehlen von Struktur für die Mikroumgebung, die eine besondere biochemische Zusammensetzung und Steifigkeit hat, um mit Zellen zu interagieren. Die Musterung kann mit Traktionskraftmikroskopie und Immunzytochemie-Assays kombiniert werden, um die Struktur und Funktion der Kardiomyozyten zu charakterisieren. Die Analyse von IPS-abgeleiteten Zelltypen, in unserem Fall Kardiomyozyten, in einer physiologischeren Morphologie eröffnet Möglichkeiten, herausfordernde Kardiomyozyten in Kulturgericht zu studieren.
Die Technik kann auch auf viele andere Systeme wie und hochklassare Siebplatten angewendet werden. Form und Substrat lassen sich leicht an die Anwendung anpassen.
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Übersicht
Dieses Protokoll stellt eine schablonengestützte, lithographiefreie Mikromusterungsmethode vor, die für Forscher mit begrenzter Erfahrung in der Biotechnik zugänglich ist. Die Methode verwendet wiederverwendbare, lasergeschnittene Schablone zur Mikromusterung von extrazellulären Matrixproteinen und ermöglicht die Modulation von Zellmorphologien, insbesondere bei induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbiologie
- Biotechnik
- Stammzellenforschung
Hintergrund
- Traditionelle Photolithographie- und Weichlithographiemethoden können komplex und kostspielig sein.
- Diese neue Methode ist darauf ausgelegt, kostengünstig und anpassbar zu sein.
- Sie ermöglicht es Nicht-Ingenieuren, Zellform und Mechanotransduktion zu erforschen.
- Mikromusterung kann auf Tausende von Zellen für Hochdurchsatzanwendungen angewendet werden.
Zweck der Studie
- Eine einfache Methode für die Mikromusterung bereitstellen, die für ein breiteres Spektrum von Forschern zugänglich ist.
- Studien zur Zellmorphologie und Mechanotransduktion in verschiedenen Kontexten zu erleichtern.
- Hochdurchsatz-Arzneimittelscreening und Krankheitsmodellierung zu ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Herstellung der Polyacrylamid-Hydrogellösung.
- Verwendung von lasergeschnittenen Schablone für die Mikromusterung.
- Ablösen des Deckglases vom Hydrogel.
- Trocknen des Hydrogels vor der Schablonenablage.
Hauptergebnisse
- Die Methode mustert erfolgreich extrazelluläre Matrixproteine.
- Sie zeigt die Fähigkeit, Zellmorphologien effektiv zu modulieren.
- Hochdurchsatzanwendungen sind mit diesem Ansatz machbar.
- Visuelle Demonstrationen verbessern das Verständnis des Protokolls.
Schlussfolgerungen
- Diese lithographiefreie Methode vereinfacht den Mikromusterungsprozess.
- Sie eröffnet neue Wege für die Forschung in Zellbiologie und Mechanotransduktion.
- Das Protokoll eignet sich für ein breites Spektrum von Anwendungen in der biomedizinischen Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This lithography-free stencil-based micropatterning method addresses accessibility barriers in single-cell analysis, enabling broader R&D teams to study mechanotransduction and cell fate determination without specialized microfabrication expertise. By supporting high-throughput patterning of thousands of cells, it enhances predictive confidence in target validation and phenotypic screening workflows. The approach reduces technical complexity and cost, facilitating scalable adoption in early discovery and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modulating cell shape and size to study mechanotransduction pathways in disease-relevant systems.
- Operational Value: Provides a robust, inexpensive platform for functional target validation using iPSC-derived cardiomyocytes and other cell types.
- Predictive Confidence: Supports portfolio triage by generating quantitative morphological and functional readouts that de-risk mechanistic assumptions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by creating standardized micropatterned substrates with controlled extracellular matrix presentation.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through reusable laser-cut stencils and consistent hydrogel-based protein patterning.
- Scalability: Supports high-throughput screening readiness by patterning arrays of up to 2,000 cells per experiment, facilitating dose-response and phenotypic profiling.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applies to iPSC-derived cardiomyocytes, enabling study of adult-like rectangular morphologies that better model physiological mechanotransduction in cardiac disease contexts.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by allowing assessment of cell structure and function across substrate stiffnesses, supporting biomarker alignment and risk-adjusted advancement.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in phenotype-genotype relationships by isolating the effect of cell geometry on signaling pathways, improving predictive value for in vivo translation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, providing standardized cell preparation for mechanistic and phenotypic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise control of cell shape and area to study mechanotransduction in iPSC-derived models.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via reproducible micropatterning of thousands of cells, enabling reliable compound screening in disease modeling applications.
- Analytics: Generates measurable outputs such as cell alignment, protein island formation, and morphological metrics that help teams compare conditions across genetic or pharmacological perturbations.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing patterning on tunable substrates (e.g., silicon elastomer) to assess stiffness-dependent responses, relevant to fibrotic or ischemic cardiac models.
- Enterprise Reuse: Positions the stencil-based approach as a reusable capability across projects, reducing redundant setup and enabling cross-team adoption in mechanobiology and phenotypic screening platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through controlled single-cell micropatterning.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability through reusable stencils and hydrogel-based patterning compatible with standard cell culture workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of shape-dependent phenotypic responses, reducing late-stage biological risk in cardiovascular and mechanotransduction-focused programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating high-content, morphology-linked data that inform target selection and lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture and molecular biology expertise; no specialized microfabrication training needed.
- Depends on access to UV light source, laser-cut stencil fabrication (outsourcable), and standard hydrogel reagents (e.g., acrylamide, Sulfo-SANPAH).
- Necessitates cross-team standardization of stencil orientation and hydrogel preparation to ensure consistent protein patterning and aspect ratio control.
- Adaptation considerations include substrate compatibility (e.g., glass, elastomers) and extracellular matrix protein optimization for specific cell types.
- Practical limitations include the need for careful stencil handling to avoid hydrogel tearing and precise timing during Sulfo-SANPAH activation to ensure efficient protein immobilization.
