Name: In Vivo Imaging von Transduktionseffizienzen des Kardialen Peptids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Transduktionseffizienz kardialer Peptide in CD1-Mäusen mit Fluoreszenzbildgebung und Histologie untersuchen. Dieses Protokoll maximiert die Datenerfassung aus einem einzelnen Tier und reduziert den Tierverbrauch erheblich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.Z. und K.S.F. werden vom American Heart Association Scientist Development Award 17SDG33411180 und einem Stipendium der Pitt Innovation Challenge (PInCh®) durch das Clinical and Translational Science Institute der University of Pittsburgh unterstützt.

Der Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigte alle in dieser Veröffentlichung aufgeführten Tierprotokolle, bevor er eines dieser Tierversuche durchführte.
HINWEIS: In diesem Protokoll wird erläutert, wie Ex-vivo-Bioverteilungsstudien unter Verwendung von ex vivo optischer Fluoreszenz-Bildgebung durchgeführt werden können, gefolgt von In-vivo-Bioverteilungsstudien, indem die Organe in Paraffin einbetten, schneiden und fluoreszierende Mikroskopie durchführen. Obwohl CTP als Beispiel verwendet wird, kann diese Methode auf jede fluoreszierende CPP angewendet werden.
1. In-vivo-Bildgebung
<ol><li>Synthetisieren CtP mit Festphasensynthesetechniken9,10 aus einer Peptidsynthese-Anlage mit L-Aminosäuren mit einem N-Terminus mit Cy5.5 und C-terminus amid-capped für erhöhte Stabilität. HINWEIS: Alle synthetisierten CPPs sollten vor der Anwendung11mit einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und/oder matrixgestützter Laserdesorption/Ionisierung (MALDI) charakterisiert werden.</li>
	<li>Eine 1 mM oder 10 mM Stammlösung von CTP in Dimethylsulfoxid (DMSO), aliquot, aliquot herstellen und bei -80 °C lichtgeschützt lagern. HINWEIS: Peptide werden als lyophilisiertes Pulver geliefert. Lyophilisiertes Pulver kann langfristig (6 Monate-2 Jahre) in -20 °C, lichtgeschützt und unter hygroskopischen Bedingungen gelagert werden. Wenn in DMSO aliquoted und gespeichert, Einfrieren-Tau-Zyklen sollten vermieden werden.</li>
	<li>Wiegen und anästhesieren 6 Wochen alte CD1-Mäuse mit 2 L/g Gewebegewicht einer Ketamin/Xylazin-Lösung (100 mg/kg Ketamin und 20 mg/kg Xylazin), die intramuskulär (Hind-Bein) oder intraperitoneal (unteres linkes Quadrant) verabreicht werden. HINWEIS: Ketamin/Xylazin-Lösungen sollten am Tag der Anwendung frisch hergestellt werden. Nicht verwendetes Ketamin/Xylazin sollte entsprechend entsorgt und Mengen verwendet werden, die im Vergleich zu den in einem Protokoll zurückgeworfenen Mengen verwendet werden, da Ketamin eine kontrollierte Substanz ist. Angemessene Anästhesie wird in 5-7 min erreicht werden, wie durch mangelnde Reaktion auf eine Zehenprise beurteilt.</li>
	<li>Berechnen Sie eine Dosis von 10 mg/kg Cy5,5-CTP, verdünnen Sie sie mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) auf nicht mehr als 200 l und injizieren Sie entweder retroorbital oder durch Eine Injektion der Schwanzvene mit einer Insulinspritze(Abbildung 1A).</li>
	<li>Peptid für die vorgegebene Zeit zirkulieren lassen, die zwischen 15 min-6 h liegt.</li>
	<li>Euthanisieren Sie die Maus mit der hohenBCO2-Inhalationsmethode, wie vom Institutional Animal Care and Use Committee angegeben, und öffnen Sie die Brusthöhle mit einer Schere (Abbildung 1B ).2</li>
	<li>Verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Nick in die seitliche, freie Wand des rechten Vorhofs zu legen und 3 ml 10% gepuffertes Formalinphosphat mit einer 26 G Nadel für den doppelten Zweck der Perfusion fixieren die Organe der Maus und Ausspülung roter Blutkörperchen (Abbildung 1C) zu injizieren.</li>
	<li>Sezieren Sie Herz, Lunge, Leber, Nieren, Milz, Dickdarm, Dünndarm, Blase, Eierstöcke/Hoden und Gehirn und legen Sie sie in einzelne Brunnen einer 12 Brunnenplatte für die ex vivo optische Bildgebung(Abbildung 1D).</li>
	<li>Starten Sie die Bildaufnahmesoftware, und klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren, um das System für Bildbeispiele vorzubereiten. Öffnen Sie den Bildgebungsassistenten, wählen Sie Fluoreszenz und dann Filterpaar aus, und wählen Sie dann den Cy5.5-Farbstoff aus der Liste der Farbstoffe aus, um 580 nm Anregung und 620 nm Emissionsfilter anzuwenden. Wählen Sie manuelle Einstellungen für Belichtungsparameter aus, legen Sie dann die Bühnenposition auf B fest, legen Sie die Belichtungszeit auf 1 Sekunde fest, setzen Sie die F/Stop auf 8 und setzen Sie die Binning auf klein. HINWEIS: Die Anregungsemissionsfilter variieren je nach verwendeter Bezeichnung. Die Anregung und Emission des verwendeten Etiketts kann manuell eingegeben werden, damit die Software Anregungs- und Emissionsfilter zuordnen kann. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl zwischen 600-60.000 liegt, um Eine Sättigung zu vermeiden. Je nach eingesetzter Anlage kann eine automatische Erfassungsoptimierung möglich sein. Wenn das System über eine Kompensation zum Vergleich von Bildern verfügt, die mit verschiedenen Einstellungen aufgenommen wurden, können die automatischen Einstellungen verwendet werden. Wenn keine Kompensation verfügbar ist, müssen die Einstellungen in allen Beispielen festgelegt, gespeichert und konsistent verwendet werden.</li>
	<li>Wenn das System vollständig initialisiert ist, ordnen Sie die von Interesse interessierten Organe in eine 12 Wellplatte und legen Sie sie in die optische Bildkammer, um sicherzustellen, dass die Proben für die Bilder nach Belieben angeordnet sind. Wählen Sie Erfassen aus, und wählen Sie dann einen Speicherort für die Bilder aus. Informationen über die Maus können in das Popup-Fenster "Bildbeschriftungen bearbeiten" geschrieben werden.</li>
	<li>Nach der Bildgebung die Proben aus der Kammer entfernen und in 10% gepuffertem Formalinphosphat in einem Volumen mindestens 20 Mal so viel Volumen des Gewebes in Szintillationsfläschchen mit Lichtschutz bei Raumtemperatur (RT) aufbewahren.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Bilder, indem Sie Einheiten auf Radiant Efficiency einstellen, dann den 4x3 ROI auswählen und sich anpassen, um jedes Gut in ein Quadrat des ROI gleichmäßig zu passen, gefolgt von einem Klick auf Maß. Öffnen Sie die Registerkarte Grid ROI-Messungen, wählen Sie Export aus, und speichern Sie die Messungen als .cvs-Datei.</li>
</ol>2. Histologie
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 1.1-1.8 aus, um verschiedene Organe zu erhalten. Alternativ können die gleichen Organe, die abgebildet wurden, sofort in Formalin gelegt und für die Schnitte verwendet werden, wie unten beschrieben.
<ol><li>Bewahren Sie jedes Organ einzeln in 10% gepuffertem Formalinphosphat für mindestens 48 h auf, bevor es für die Histologie verarbeitet wird.</li>
	<li>Wenn die Organe nach 48 h ausreichend fixiert sind, übertragen Sie die Organe in Gewebeverarbeitungs- und Einbettkassetten und legen Sie sie in eine Gewebeverarbeitungsmaschine(Abbildung 1E).</li>
	<li>Stellen Sie die Verarbeitungsmaschine so ein, dass das Gewebe für 30 min in 70% Ethanol entwässert wird, gefolgt von 80% Ethanol für 30 min, 95% Ethanol für 30 min, 95% Ethanol für 30 min, 100% Ethanol für 15 min, 100% Ethanol für 20 min und schließlich 100% Ethanol für 20 min.</li>
	<li>Löschen Sie das Gewebe in Xylol 2x, mit 30 min für jede Xylol-Behandlung.</li>
	<li>Infiltrieren Sie das gereinigte Gewebe mit Paraffinwachs 4x bei 60 °C für 30 min bei jeder Behandlung.</li>
	<li>Einbetten in Paraffin mit Metallformen. Füllen Sie die Form mit geschmolzenem Paraffin (bei 65 °C gehalten) und auf eine kalte Platte übertragen. Wenn das Paraffin am unteren Rand der Form zu erstarren beginnt, legen Sie das Organ in das Paraffin (Abbildung 1F).</li>
	<li>Legen Sie eine beschriftete Kassette als Unterlage auf die Form und überfüllen Sie sie mit geschmolzenem Paraffin. Abkühlen lassen, bis es fest ist. Dann lagern Sie den Block über Nacht in einem -20 °C Gefrierschrank, so dass das Wachs weiter schrumpfen kann, um es einfach von den Formen zu entfernen. HINWEIS: Die Blöcke können nun bei RT mit Lichtschutz gelagert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie ein 38 °C-Wasserbad mit destilliertem Wasser vor. Richten Sie das Mikrotom mit einem Klingenwinkel von 6° und einer Schnittdicke von 10 m ein.</li>
	<li>Montieren Sie die Gewebeblöcke in das Mikrotome und beginnen Sie zu schneiden, bis Gewebeabschnitte erhalten sind. Legen Sie die Blöcke dann 5 min nach unten ins Wasser oder bis das Gewebe etwas Feuchtigkeit aufgenommen hat (z. B. wenn im Block eine dünne weiße Umrisslinie des Gewebes erscheint [Abbildung 1G]). HINWEIS: Die Klinge sollte häufig ausgetauscht werden, um die Qualität der Abschnitte zu gewährleisten.</li>
	<li>Legen Sie das Gewebe 10 min auf einen flachen Eisblock und geben Sie es dann in der gleichen Ausrichtung wie in Schritt 2.9 in das Mikrotom zurück. Beginnen Sie mit der Ausführung von Abschnitten, und lassen Sie abgeschnittene Abschnitte lange Abschnitte mit jeweils 6 bis 10 Abschnitten bilden. Entsorgen Sie suboptimale Paraffinbänder, bis ein hochwertiges Band von ausreichender Länge für einen Schlitten hergestellt wird. Optimieren Sie die Schnitte, indem Sie Schnittgeschwindigkeiten, Gewebefeuchtigkeit und Wasserbadtemperatur anpassen, um das Scheren oder Falten der Gewebeabschnitte zu vermeiden. HINWEIS: Abschnitte, in denen Löcher entstehen, in denen Gewebe herausgefallen ist, risse im Gewebe oder enge Falten und Falten im Gewebe sollten verworfen werden.</li>
	<li>Wählen Sie vorsichtig das Qualitätsband der Wahl mit stumpfen Kantenzangen und schweben Sie auf der Oberfläche des 38 °C Wasserbades. Lassen Sie die Abschnitte auf der Oberfläche sitzen, bis sie glätten, wobei darauf geachtet wird, dass sie nicht zu lange bleiben, um zu verhindern, dass das Paraffin zerfällt und den Abschnitt auseinanderreißt.</li>
	<li>Schwimmen Sie die abgeflachten Abschnitte auf die Oberfläche von sauberen Glasgleitern. Legen Sie die Dias 30 min in einen 65 °C-Ofen, um das Wachs zu schmelzen. HINWEIS: Diese Dias können bei RT mit Lichtschutz gelagert werden.</li>
	<li>Deparaffinieren Sie die Dias in Xylol 3x, 10 min für jede Behandlung.</li>
	<li>Rehydrieren Sie das Gewebe in 100% Ethanol für 5 min, gefolgt von 95% Ethanol für 5 min, 70% Ethanol für 5 min, 50% Ethanol für 5 min und schließlich 1x Tris-gepufferter Salin (TBS) für 5 min (Abbildung 1H). Lassen Sie die Rutschen über Nacht trocknen. HINWEIS: Diese Dias können langfristig bei RT gelagert werden, solange sie lichtgeschützt sind.</li>
	<li>Montieren Sie die Dias mit Abdeckungen mit 125 l Montagemedien, die 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), eine Kernfluoreszenzsonde enthalten (Abbildung 1I). Trockenrutschen über Nacht bei RT, lichtgeschützt. HINWEIS: Getrocknete Dias können langfristig bei 4 °C, lichtgeschützt gelagert werden.</li>
	<li>Bilddiagleitet mittels Fluoreszenzmikroskopie. HINWEIS: Gesättigte Bilder sollten vermieden werden, da sie quantitativ nicht nützlich sind. Die Einstellung der Belichtungs- und Verstärkungseinstellungen kann gesenkt werden, um eine Sättigung zu vermeiden. Achten Sie darauf, die gleichen Einstellungen in den verglichenen Beispielen zu verwenden. Vermeiden Sie das Bleichen des Gewebes, indem Sie die Expositionszeiten begrenzen.</li>
</ol>

<ol><li>Green, M., Loewenstein, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+functional+domains+of+chemically+synthesized+human+immunodeficiency+virus+tat+trans-activator+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein.</a> Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).</li>
<li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
<li>Zahid, M., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+penetrating+peptides%3A+therapeutic+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges.</a> Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).</li>
<li>Zahid, M., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+tissue-specific+protein+transduction+domains+using+peptide+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display.</a> Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).</li>
<li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cardiac+specific+protein+transduction+domain+by+in+vivo+biopanning+using+a+M13+phage+peptide+display+library+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice.</a> PLoS One. 5 (8), e12252(2010).</li>
<li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Targeting+Peptide%2C+a+Novel+Cardiac+Vector%3A+Studies+in+Bio-Distribution%2C+Imaging+Application%2C+and+Mechanism+of+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction.</a> Biomolecules. 8 (4), E147(2018).</li>
<li>Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+of+modern+solid+phase+Peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis.</a> Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).</li>
<li>Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+peptides+on+solid+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of peptides on solid phase.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).</li>
<li>Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Synthetic+Peptides+by+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).</li>
<li>Arms, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+Limitations+of+Current+Techniques+for+Analyzing+the+Biodistribution+of+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 802(2018).</li>
<li>Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+whole-body+fluorescence+imaging%3A+Review+of+instruments%2C+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).</li>
<li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choose+your+label+wisely%3A+water-soluble+fluorophores+often+interact+with+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649(2014).</li>
<li>McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Ex+Vivo+Whole-organ+Imaging+and+Quantitative+Tissue+Histology+to+Determine+the+Bio-distribution+of+Fluorescently+Labeled+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54987(2016).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
</ol>

M.Z. und Paul D. Robbins (University of Minnesota, Minnesota, MN, USA) besitzen ein Patent auf die Verwendung von Kardial-Targeting-Peptid als Herzvektor (Herzspezifische Protein-Targeting-Domain, U.S. Patent Serial No. 9,249,184). M.Z. ist auch chief Scientific Officer und mitglied im Verwaltungsrat des Startups Vivasc Therapeutics Inc. und hält erhebliches zukünftiges Eigenkapital.

Tiermodelle sind für die präklinische Arzneimittelentwicklung in jeder Phase des Prozesses von der Identifizierung neuartiger CPPs, Bioverteilungsstudien, Transduktionsmechanismus bis hin zu tests auf Wirksamkeit der gelieferten Ladung unter Verwendung dieser neuartigen CPPs als Vektoren unerlässlich. Es gibt viele häufig verwendete Methoden zur Bewertung der Bioverteilung wie Histologie, nuklearmedizinische Bildgebung (SPECT und PET) und optische Bildgebung in vivo12. Nukleare Bildgebungsverfahren können aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von SPECT- und PET-Kleintiersystemen sowie der Fähigkeit zur Herstellung von Radiolabel-Wirkstoff-Konjugaten, die das Fachwissen eines Radiochemikers erfordern, umständlich sein. Im Gegensatz dazu sind fluoreszierende Etiketten viel einfacher und können kostengünstig mit ihnen arbeiten. Das in diesem Dokument beschriebene Protokoll ermöglicht eine schnelle Analyse der Bioverteilung mit mehreren Methoden. Ex vivo ganze Organ fluoreszierende optische Bildgebung ermöglicht den sofortigen Vergleich der Fluoreszenz über verschiedene Gewebe und Behandlungsgruppen hinweg und kann Organaufnahme und Zeit bis zur Aufnahme von Organen semiquantitativ identifizieren. Quantitative Gewebehistologie erfordert eine umfangreichere Verarbeitung zur Behandlung, Schnitt- und Analyse von Geweben, liefert aber mehr Daten auf mikroskopischer Ebene und ist eine aktuelle Standardtechnik. Es lohnt sich zu beachten, dass ein direkter, quantitativer Vergleich zwischen den beiden Techniken nicht möglich ist, da die Autofluoreszenz, die bei jeder Technik für verschiedene Organe und Anregungswellenlängen gesehen wird, erheblich variiert.
Ein wichtiger Teil dieses Protokolls ist die Auswahl des richtigen Fluorophors, um Kandidaten-CPPs für Experimente zu kennzeichnen. Ein potenzielles Problem ist die Spektrenüberlappung, die problematisch sein kann, wenn mehrere Fluorophore benötigt werden. Die DAPI-Fluoreszenz-Montagemedien und Cy5.5 haben keine überlappenden Spektren. Bei bestimmten Anwendungen, bei denen mehrere Fluorophore benötigt werden, muss jedoch das Risiko von spektralen Überschneidungen sorgfältig geprüft werden. Je nach verwendetem System kann die Fluorophorauswahl eingeschränkt sein. Daher ist die Kenntnis der Systemfähigkeiten von entscheidender Bedeutung. Fluoreszierende optische Systeme werden am besten mit weitroten oder nahinfraroten Fluorophoren aufgrund der hohen Gewebeabsorption kürzerer Wellenlängen13eingesetzt. Fluorophore im Bereich des verbesserten grünen fluoreszierenden Proteins haben eine große Einschränkung, da es eine signifikante Organautofluoreszenz gibt, die bei seiner Anregungswellenlänge gesehen wird, insbesondere im Gehirn- und Lebergewebe. Je nach den Bedingungen eines Experiments werden einige Fluorophore am besten vermieden. Einige wasserlösliche organische Fluorophore haben eine starke Wechselwirkung mit Lipid-Doppelschichten, die falsche Positivwerte verursachen können. Daher ist es ratsam, Schritte zu unternehmen, um festzustellen, ob ein Fluorophor eine starke Affinität zum Gewebe von Interesse hat14. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist die Auswahl der geeigneten Methode der Fluorophorkonjugation, die ein wichtiger Parameter sein kann, der die Ergebnisse beeinflusst. CPPs können am N- oder C-Terminus fluoreszierend durch eine kovalente Bindung zwischen dem N-Terminus des Peptids und der Carboxylgruppe des Farbstoffs wie Cy5.5-NHS gekennzeichnet werden. Es sollte Vorsicht geboten sein, da der Mechanismus der Transduktion der meisten CPPs nicht im Detail verstanden wird und die Konjugation an einem Ende den Aufnahmemechanismus stärker als am anderen Ende beeinflussen kann. Eine weitere Möglichkeit zur Kennzeichnung von CPPs besteht darin, dass der N-Terminus zur Konjugation zu fluoreszierend markiertem Streptavidin biotinylatiert wird. Die Verwendung dieser Strategie hat den Komfort, verschiedene fluoreszierende Streptavidin-Konjugate verwendet werden zu lassen. Eine mögliche Einschränkung dieser Strategie besteht jedoch darin, dass ein Biotin-Streptavidin-Komplex ein großes Konstrukt ist, das möglicherweise die Transduktion beeinträchtigen könnte.
Fluoreszierende optische Bildgebungssysteme sind eine effektive Strategie, um einen effizienten Vergleich der Fluoreszenz zwischen verschiedenen Organen und Behandlungen zu erzeugen, sind aber nicht in der Lage, ein quantitatives Maß für absolute Konzentrationen im Gewebe zu erzeugen. Dies ist auf Lichtstreuungseffekte im Gewebe zurückzuführen, die durch die natürlich vorkommende Vielfalt in Gewebegrößen und Dichten und Unterschiede in der Vaskularität mit variabler Fluoreszenzstreuung noch verstärkt werden. Gewebe-Autofluoreszenz kann auch ein Faktor sein, aufgrund natürlich vorkommenden biochemischen Quellen wie Kollagen, oder diätetische Quellen wie Chlorophyll in Lebensmitteln13.
Histologie ist die am häufigsten verwendete Methode zur Messung der Bioverteilung und kann potenziell verwendet werden, um die Aufnahme in verschiedenen Geweben im Laufe der Zeit genau zu messen und zu vergleichen. Lichtstreuungsprobleme werden mit dieser Methode vermieden, da alle Gewebe auf die gleiche Dicke15geschnitten sind. Ein großer Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, zusätzliche fluoreszierende Etiketten nach der Sektionierung für die Immunhistochemie einzubeziehen. Obwohl die Zugabe eines anderen Fluorophors die Bildgebung schwieriger machen könnte, kann die Verwendung von Fluoreszenzetiketten für die Lokalisierung eines CPP in bestimmten intrazellulären Kompartimenten wie Lysosomen oder Mitochondrien nützlich sein. Ein Antikörper könnte in einem konfokalen Mikroskopieexperiment verwendet werden, um festzustellen, ob ein transduzierter Kandidat CPP mit einer Interessenstruktur kolokalisiert, die das Potenzial eines CPP als Zustellmittel aufzeigen kann. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass die Vorbereitung von Dias aus Organproben zeitaufwändig, arbeitsintensiv und anfällig für menschliches Versagen sein kann12,15. Bei der Abbildung von Dias sollte darauf geachtet werden, dass nicht zu lange derselbe Ort abbildt wird, um Photobleichungen zu vermeiden. Einige Photobleichungen sind je nach Empfindlichkeit des Fluorophors unvermeidlich. Bei jedem Schritt dieses Protokolls ist darauf zu achten, dass die Proben vor Umgebungslicht geschützt und ordnungsgemäß gelagert werden16. Wir empfehlen, Dias bei 4 °C, lichtgeschützt, für zukünftige Bildgebung zu lagern.
Es gibt eine Vielzahl von Methoden zur Messung der Bioverteilung eines KPP-Kandidaten, die spezielle Ausrüstung erfordern und vergleichbare Ergebnisse liefern können, obwohl sie eine komplexere CPP-Kennzeichnung erfordern können. Das in diesem Papier beschriebene Protokoll verwendet zwei kompatible Methoden, um Bioverteilungsdaten im Kontext eines lebenden Systems effizient zu produzieren und gleichzeitig den Erwerb größerer detaillierter Informationen über die Peptidinternalisierung innerhalb von Zellen aus derselben Probe zu ermöglichen und so die Anzahl der für eine Studie benötigten Tiere zu reduzieren. Diese Methoden wurden verwendet, um die oben genannten Daten zu generieren, die zeigen, dass beide Methoden sequenziell bei demselben Tier verwendet werden können, und die Qualität der von jedem erzeugten Daten. Unsere Ergebnisse unterstreichen auch die Unfähigkeit, die Ergebnisse zwischen den beiden Techniken in quantitativer Weise direkt zu korrelieren.

Die Zellplasmamembran ist eine semipermeable Barriere, die für die Zellintegrität und das Überleben unerlässlich ist und dazu dient, das Innere der Zelle zu regulieren, indem sie die Bewegung von Substanzen in die Zelle steuert. Obwohl überlebenswichtig, stellt es auch eine Barriere für die Lieferung von Fracht an die Zelle dar. 1988 wurde gezeigt, dass der Transaktivator des Transkriptionsproteins (Tat) des humanen Immundefizienzvirus in kultivierte Zellen gelangte und die virale Genexpression1,2förderte, wobei die für diese Transduktion verantwortlichen Domänen auf eine Arginin- und Lysin-reiche 13-Aminosäure-Region der dritten Helix3 beschränkt waren. Es folgten Untersuchungen, die die Fähigkeit des Tat-Peptids zeigten, funktionelle Galactosidase in mehrere Zelltypen zu tragen4. Seit der ersten Beschreibung hat die Anzahl der zelldurchdringenden Peptide dramatisch zugenommen. Diese Transduktionsdomänen sind natürlich vorkommende oder synthetische kurze Peptide, typischerweise 6 bis 20 Aminosäuren lang, die in der Lage sind, funktionelle Ladungen über Zellmembranen zu transportieren. Diese Ladungen können von anderen kleinen Peptiden, Volllängenproteinen, Nukleinsäuren, Nanopartikeln, Viruspartikeln, fluoreszierenden Molekülen und Radioisotopen5reichen. Die anfänglichen CPPs beschrieben waren nicht zellspezifisch, mit Tat von mehreren Zelltypen aufgenommen und sogar die Blut - Hirn-Schranke4überqueren , wodurch sein therapeutisches Potenzial begrenzt. Um zellspezifische CPPs zu identifizieren, haben die Forscher phagendisplay unter Verwendung großer, kommerziell erhältlicher Phagenbibliotheken6durchgeführt. Unsere eigene Arbeit mit einer kombinatorischen In-vitro- und In-vivo-Phagenanzeige-Methodik führte zur Identifizierung eines CPP namens Cardiac Targeting Peptid (CTP)7, eines 12-Aminosäure- und nicht natürlich vorkommenden Peptids (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH), das das Herz mit Spitzenaufnahme bei 15 min nach einer peripheren intravenösen Injektion8angreift. Mit immunfluoreszierender Kolokalisierung mit Actin, einem intrazellulären Marker, und Ausschluss von Laminin, einem Zellmembranmarker, zeigten wir, dass CTP nach einer intravenösen Injektion in Maus-Kardiomyozyten verinnerlicht wird7. Zusätzlich inkubierten wir vom Menschen induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete schlagende Kardiomyozyten mit dual-labeled CTP, gekennzeichnet mit 6-Carboxyfluorescein an seinem C-Terminus und Rhodamine an seinem N-Terminus durch eine Esterverbindung, die nur durch intrazelluläre Esterasen abgeführt werden konnte. Schnelle Ansammlung von Rhodinin in schlagende Kardiomyozyten wurde innerhalb von 15 min bei der konfokalen Mikroskopie8beobachtet.
In diesem Artikel stellen wir zwei ergänzende Methoden vor, mit denen die Bioverteilung verfolgt und die gewebespezifische Internalisierung von CPPs am Beispiel von CTP bestätigt werden kann. Für diese Methoden wurde CTP synthetisiert, am N-Terminus fluoreszierend mit Cyanin5.5 (CY5.5) und Amid-capped am C-Terminus für eine höhere Peptidstabilität gekennzeichnet. Die beiden verwendeten Methoden sind in vivo fluoreszierende optische Bildgebungssysteme und fluoreszierende Mikroskopie von Gewebeabschnitten. Beide Methoden sind sehr nützlich bei der Untersuchung der Bioverteilung, Aufnahme und Eliminierung von fluoreszierend markierten CPPs. Der Vorteil der Bewertung der Bioverteilung mit diesen Methoden gegenüber anderen, wie der Einzelphotonen-Emissionstomographie (SPECT) oder der Positronenemissionstomographie (PET), besteht darin, dass eine zeitintensive Radiokennzeichnung von CPPs im Vergleich zur fluoreszierenden Kennzeichnung, die relativ einfach und in allen Peptidsyntheseanlagen im Routineeinsatz ist, nicht erforderlich ist. Der Einsatz von In-vivo-Bildgebung erzeugt schnell Bioverteilungsdaten im Kontext eines lebenden Systems, während die Schnitte über die Erhaltung morphologischer Details detailliertere Informationen über die Peptidaufnahme und Lokalisierung innerhalb der Zellen liefern. Dieses Protokoll kann auf eine Vielzahl von Organen und Geweben wie Herz, Lunge, Leber, Niere, Gehirn, Milz, Magen, Dickdarm, Dünndarm, Skelettmuskel, Knochen, Hoden/Eierstöcke und Augen angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>10% gepuffertes Formalinphosphat</td><td>ThermoFisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP2471-1</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Zellkulturplatte</td><td>ThermoFisher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS Lösung</td><td></td><td></td><td>10x TBS wird 1:10 mit deionisiertem Wasser verdünnt. Diese Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden.</td></tr><tr><td>20 mL Szintillationsfläschchen</td><td>Wheaton</td><td>334173</td><td></td></tr><tr><td>26G Nadeln</td><td>Becton Dickinson</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>28G 0,5ml Insulinspritzen</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>3mL Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>CD1 Mäuse</td><td>Charles River</td><td>022</td><td>6 bis 12 Wochen alter Albino, weibliche Mäuse</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>ThermoFisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5-CTP-amid</td><td></td><td></td><td>Hergestellt durch Peptidsynthese, konjugiert mit Cy5.5-Fluorophor und gereinigt mittels HPLC. Lyophilisiertes Pulver wird in DMSO in einer Konzentration von 10 mM rekonstituiert. Nach der Rekonstitution bei -80 °C lagern.</td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin HCl 100mg/ml</td><td>KetaVed</td><td>NDC 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin/Xylazin-Lösung</td><td></td><td></td><td>Ketamin-HCl wird 1:1 mit Xylazin gemischt, um eine Stammlösung herzustellen, die 50 mg/ml Ketamin und 10 mg/ml Xylazin enthält. Diese Lösung wird vor jedem Gebrauch frisch gemacht.</td></tr><tr><td>Leica RM2235 Rotationsmikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>ThermoFisher</td><td>B9992000TN</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Sigma</td><td>P3808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Lumina S5 IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS148588</td><td></td></tr><tr><td>Sparkle Optical Lens Cleaner</td><td>ThermoFisher</td><td>NC0090079</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Processing/ Einbettkassetten</td><td>ThermoFisher</td><td>NC9499605</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP Verarbeitungsmaschine</td><td>Tissue-Tek</td><td>VIP 5A-F1</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin 20 mg/mL</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Xylole</td><td>ThermoFisher</td><td>X5-4</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging von transduktionseffizienzen des kardialen peptids

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

Seit der ersten Beschreibung von Proteintransduktionsdomänen, auch bekannt als zelldurchdringende Peptide, vor über 25 Jahren besteht großes Interesse an der Entwicklung dieser Peptide, insbesondere zellspezifischer, als neuartige Vektoren für die Bereitstellung diagnostischer und therapeutischer Materialien. Unsere bisherige Arbeit mit Phagen-Display identifizierte ein neuartiges, nicht natürlich vorkommendes, 12 Aminosäure-langes Peptid, das wir als Herz-Targeting-Peptid (CTP) bezeichneten, aufgrund seiner Fähigkeit, normales Herzgewebe in vivo mit Spitzenaufnahme in nur 15 min nach einer intravenösen Injektion zu transduzieren. Wir haben detaillierte Bioverteilungsstudien durchgeführt, indem wir CTP mit Fluorophorcyan5.5 gekennzeichnet injiziert haben, so dass es für verschiedene Zeiträume zirkulieren kann, und mehrere Organe einschläfern, fixieren und sektionieren, gefolgt von fluoreszierender Mikroskopie-Bildgebung. In dieser Publikation beschreiben wir diese Prozesse sowie die Ex-vivo-Bildgebung von geernteten Organen mittels eines In-vivo-Bildgebungssystems im Detail. Wir bieten detaillierte Methoden und Praktiken für die Durchführung von Transduktions- und Bioverteilungsstudien am Beispiel von CTP.

Mit diesem Protokoll behandelten wir drei Mäuse mit einer Dosis von 10 mg/kg Cy5,5-CTP durch eine retroorbitale Injektion (Abbildung 1A). Nachdem das Peptid 15 min zirkulieren konnte, wurden die Mäuse mit einerCO2-Kammer eingeschläfert, die Brust durch einen mittleren Sternotomieschnitt geöffnet, das rechte Vorhof genickt und die Mäuseperfusion mit 3 ml 10% phosphatgepuffertem Formalin fixiert (Abbildung 1B,C). Nach der Fixierung wurden Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz und Gehirn seziert und in einer 12-Well-Platte für ex vivo optische Fluoreszenz-Bildgebung angeordnet(Abbildung 1D und Abbildung 2A). Drei Kontrollmäuse ohne Injektionen wurden ebenfalls durchblutet, seziert und abgebildet(Abbildung 1B-D und Abbildung 2B). Die für jeden Organsatz erfassten Fluoreszenzdaten können verglichen werden, da die Anzahl in die Strahlungseffizienz, die relative Fluoreszenzeinheit der Bildgebungssoftware, umgewandelt wird. Diese Daten können quantifiziert werden, um sowohl qualitative Bilder als auch quantitative Daten für jedes betreffende Organ(Abbildung 2C) über verschiedene Zeitpunkte für Bioverteilungsstudien hinweg zu liefern. Die Autofluoreszenz verschiedener Organe als Reaktion auf unterschiedliche Anregungswellenlängen wird in Abbildung 3A-Egezeigt. Kürzere Anregungswellenlängen, wie z. B. verbessertes grünes fluoreszierendes Protein (EGFP), sind mit einer höheren Autofluoreszenz, insbesondere in Leber und Gehirn, verbunden als weitrote (Cy5.5) oder nahe Infrarot (Cy7) Anregungswellenlängen (Abbildung 3). Die abgebildeten Organe wurden in 10% Phosphat gepuffertes Formalin bei RT für mindestens 48 h fixiert, gefolgt von einer Übertragung auf Gewebeverarbeitungs- und Einbettkassetten (Abbildung 1E). Die Organe wurden in einer Gewebeverarbeitungsmaschine verarbeitet und paraffiniert, in mit Paraffin gefüllten Formen positioniert, auf einer Stufe von -20 °C eingefroren und über Nacht bei -20 °C gelagert (Abbildung 1F). Die Proben wurden geschnitten (Abbildung 1G) und mit Lösungsaustausch behandelt, um das Gewebe zu rehydrieren (Abbildung 1H). Die vorbereiteten Dias wurden dann mit DAPI-Fluoreszenz-Montagemedium montiert (Abbildung 1I). Einmal trocken, in der Regel über Nacht, wurden die Dias mit fluoreszierender Mikroskopie abgebildet. Repräsentative Bilder jedes Organs von einer Maus sind in Abbildung 4Adargestellt. Die Bilder von verschiedenen Organen wurden mit identischen Einstellungen aufgenommen, um einen Vergleich zwischen Mäusen zu ermöglichen und eine Quantifizierung zu ermöglichen (Abbildung 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig1.jpg"> Abbildung 1: Ernte von Mausorganen für ex vivo optische Fluoreszenz-Bildgebung und -Schnitte. (A) Wild-Typ-Maus retro-orbital mit CTP-Cy5.5 injiziert. (B) Maus seziert mit Brust geöffnet, rechte Vorhof geschnappt, für Perfusionsfixierung. (C) Herz injiziert mit 3 ml 10% gepuffertem Formalinphosphat zur Perfusionsfixierung des Tieres. (D) Von Interesse verwendete und in einer 12-Well-Platte angeordnete Organe für die fluoreszierende optische Bildgebung. (E) Herz in eine Kassette geladen und mit einem Gewebeprozessor verarbeitet. (F) Herz eingebettet in Paraffin. (G) Herz auf einem Mikrotom geschnitten. (H) Dias, die durch eine Reihe von Lösungsaustauschen entparaffiniert werden. (I) Abschnitte, die mit Abdeckungen mit DAPI eingehängt sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Bilder von behandelten und Kontrollorganen. (A) Organe einer Maus, die mit 10 mg/kg CTP-Cy5.5 behandelt wurden. (B) Organe einer unbehandelten Steuermaus. (C) Quantifizierung der Fluoreszenz für jeden Organsatz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Unbehandelte Mausorgane, die mit unterschiedlichen Anregungsemissionswellenlängen abgebildet sind, um zu zeigen, wie längere Wellenlängen weniger Autofluoreszenz erzeugen. (A) Cy7: 740-790. (B) Cy5.5: 660-710. (C) Cy5: 620-670. (D) Cy3: 520-570. (E) EGFP: 480-520. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig4.jpg"> Abbildung 4: Transduktion von Herz, Lunge, Leber und Niere nach intravenöser Injektion bei Mäusen. Wildtyp-Mäuse wurden mit 10 mg/kg Cy5,5-CTP oder einem zufälligen Peptid (RAN-Cy5.5) injiziert und zu den angegebenen Zeitpunkten eingeschläfert. (A) Die Peak-Transduktion des Herzgewebes wurde bei 15 min mit einer stetigen Abnahme der Fluoreszenz im Laufe der Zeit beobachtet. Einige Kapillaraufnahme wurde in der Lunge mit robuster Transduktion in der Leber sowie an den Nierenglomerularkapillaren festgestellt, letztere impliziert einen nierenrenalen Mechanismus der Ausscheidung. (B) Die Quantifizierung der fluoreszierenden Intensität zeigt eine signifikant erhöhte Herzaufnahme von CTP-Cy5.5 gegenüber RAN-Cy5.5. Skalenbalken = 500 m. Diese Zahl wurde von Zahid et al.8geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Wir beschreiben Protokolle zur Bewertung des Grades der Transduktion durch zelldurchdringende Peptide unter Verwendung von Ex-vivo-Bildgebungssystemen, gefolgt von Paraffineinbettung, Schnitt- und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie am Beispiel von Kardial-Targeting-Peptid. In unserem Protokoll kann ein einzelnes Tier verwendet werden, um beide Arten der bildgebenden Bewertung der gleichen Organe zu erwerben, wodurch die Anzahl der Tiere, die für Studien benötigt werden, um die Hälfte wird.

In Vivo Imaging von Transduktionseffizienzen des Kardialen Peptids

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

Unser Protokoll ermöglicht es uns, die Bioverteilung zu verfolgen und die gewebespezifische Internalisierung eines von Interesse sindden Peptids mit zwei separaten, aber komplementären Methoden zu bestätigen. Wir können dieses Protokoll verwenden, um die von einem einzelnen Tier erhaltenen Daten zu maximieren und quantitative axiale Fluoreszenz-Bildgebungsdaten zu erfassen. Zusätzlich können wir qualitative Mikroskopbilder erhalten.Nach dem Erwerb fester Phase synthetisierte C-terminus Amid Kappe CTPs mit einem N-Terminus mit Cy5.5 aus einer Peptid-Synthese-Anlage beschriftet, machen eine ein oder 10 Millimolar-Lagerlösung aliquot von CTP in Dimethylsulfoxid für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius vor Licht geschützt. Am Tag des Experiments eine Dosis von 10 Milligramm pro Kilogramm Cy5,5 CTP in 200 Mikroliter PBS in eine Insulinspritze laden. Wiegen Sie eine Maus und geben Sie das Peptid intravenös in die anästhesierte sechs Wochen alte weibliche CD1-Maus.Lassen Sie das Peptid für den vorgegebenen versuchsreichen Zeitraum zirkulieren, bevor Sie die Maus mit einer Hochstrom-CO2-Kammer einschläfern und mit einer Schere die Brusthöhle öffnen und einen kleinen Nick in der seitlichen freien Wand des rechten Vorhofs machen. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Meter-Nadel ausgestattet ist, um drei Milliliter 10% gepuffertes Formalinphosphat durch die linksventrikuläre Spitze zu durchdringen, um das Gewebe zu fixieren und alle roten Blutkörperchen auszuspülen. Dann sammeln Sie Das Herz, die Lunge, die Leber, die Nieren, die Milz, den Groß- und Dünndarm, die Blase, die Eierstöcke oder hoden und das Gehirn in einzelne Brunnen einer 12-Well-Platte für die ex vivo optische Bildgebung.Für die In-vivo-Bildgebung der CTP-Transduced-Bilder starten Sie die Bildaufnahmesoftware und klicken Sie auf Initialisieren, um das System für die Bildgebung vorzubereiten. Öffnen Sie den Bildgebungsassistenten, und wählen Sie Fluoreszenz und Filterpaar aus. Klicken Sie auf Namen, Farbstoffe, Zyanid und Cy5, um die Anregungs- und Emissionsparameter festzulegen.Und klicken Sie auf Manuelle Einstellungen, um die Belichtung auf eine Sekunde, das Binning auf klein, das F/Stop auf acht und das Sichtfeld auf 15 Zentimeter festzulegen. Klicken Sie auf Erfassen, und legen Sie den Ordner fest, in dem die Beispiele gespeichert werden sollen. Fügen Sie die entsprechenden experimentellen Informationen im Fenster Bildbeschriftungen bearbeiten hinzu, und klicken Sie auf OK. Das aufgenommene Bild wird angezeigt.Stellen Sie die Geräte auf Strahlungswirkung s. Doppelklicken Sie auf das Bild, und klicken Sie auf Korrekturen und Adaptive Fluorescent Background Subtraction. Passen Sie die Schwelle an, um nur die interessierten Organe mit Violett abzudecken.Alternativ können Sie mit der rechten Maustaste klicken und Crop Area auswählen, um ein Feld mit allen von Interesse interessierten Beispielen zu zeichnen. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, übertragen Sie die Proben in Szintillationsfläschchen mit 10% gepuffertem Formalinphosphat in einem Volumen von mindestens 20 Mal so viel wie das Gewebe und lagern Sie die Gewebe bei Raumtemperatur, die vor Licht geschützt ist, für mindestens 48 Stunden. Um die Bilder zu quantifizieren, stellen Sie die Einheiten auf Strahlungseffizienz und die Region von Interesse auf vier mal drei.Passen Sie das Feld Bereich von Interesse an, um alle Brunnen gleichmäßig abzudecken, und klicken Sie auf "Interessenbereiche messen". Klicken Sie dann auf Grid Region of Interest Measurements, um die Zellen des Interessenbereichs abzugleichen, und klicken Sie auf Exportieren, um die Daten in einer Text- oder CSV-Datei zu speichern. Wenn die Organe nach mindestens 48 Stunden ausreichend fixiert sind, übertragen Sie die Proben in Gewebeverarbeitungs- und Einbettkassetten und laden Sie die Kassetten in eine Gewebeverarbeitungsmaschine.Stellen Sie den Prozessor so ein, dass das Gewebe wie angegeben mit Ethanol dehydriert wird, gefolgt von der Reinigung mit zwei 30-minütigen Xylol-Behandlungen und Paraffin-Infusion enden sie mit vier 30-minütigen Paraffin-Behandlungen. Entfernen Sie nach der letzten Paraffinbehandlung das Gewebe von der Verarbeitungsmaschine. Legen Sie die Gewebe in einzelne Metallformen und linie jede Form mit geschmolzenem Paraffin.Legen Sie die Formen auf eine kalte Platte. Wenn das Paraffin am Boden der Form zu erstarren beginnt, legen Sie die Organe in das Paraffin. Wenn alle Organe platziert sind, legen Sie eine beschriftete Kassette als Unterlage auf die Form und überfüllen Sie die Formen mit geschmolzenem Paraffin.Lassen Sie das Paraffin abkühlen, bis es fest ist, bevor Sie die Blöcke über Nacht bei minus 20 Grad Celsius lagern. Am nächsten Morgen ein Mikrotom mit einem Klingenwinkel von sechs Grad und einer Schnittdicke von 10 Mikrometern aufstellen und die Gewebeblöcke in das Mikrotom einbauen. Beginnen Sie mit dem Schneiden, bis Abschnitte, die das Gewebe enthalten, erhalten sind, und legen Sie die Blöcke nach unten in einem 38 Grad Celsius destillierten Wasserbad für fünf Minuten oder bis das Gewebe etwas Feuchtigkeit absorbiert hat.Wenn ein dünner weißer Umriss des Gewebes im Block erscheint, legen Sie das Gewebe für 10 Minuten auf einen flachen Eisblock, bevor Sie es in der gleichen Ausrichtung an das Mikrotom zurückgeben, wie es gerade geladen wurde. Beginnen Sie mit dem Abrufen von Slices, sodass abgeschnittene Abschnitte lange Bänder mit jeweils sechs bis zehn Abschnitten bilden können. Um eine erfolgreiche Gewebesektionserfassung zu gewährleisten, halten Sie den Block hydratisiert.Bringen Sie den Block auf das Eis zurück, wenn die Schnittqualität schlecht ist oder zu sinken beginnt. Entsorgen Sie suboptimale Paraffinbänder, bis ein hochwertiges Band von ausreichender Länge für einen Schlitten hergestellt wird. Verwenden Sie eine stumpfe Kante, um Qualitätsbänder in ein 38 Grad Celsius Wasserbad zu übertragen und lassen Sie die Abschnitte auf der Oberfläche des destillierten Wassers sitzen, bis sie sich nur glätten.Die abgeflachten Abschnitte auf die Oberfläche eines sauberen Glasschlittens schwimmen und das Wachs 30 Minuten in einem 65-Grad-Celsius-Ofen schmelzen. Um die Dias zu entparaffinisieren, behandeln Sie die Proben dreimal mit Xylol für 10 Minuten pro Behandlung. Nach der letzten Xylol-Behandlung rehydrieren Sie das Gewebe mit fünfminütigen absteigenden Ethanol-Eintauchen, gefolgt von einem fünfminütigen Eintauchen in tris-gepufferte Saline.Nachdem die Dias über Nacht trocknen können, montieren Sie die Abschnitte mit Abdeckungen und 125 Mikroliter Montagemedium, ergänzt durch DAPI, und trocknen Sie die Dias über Nacht vor Licht geschützt, bevor sie durch Fluoreszenzmikroskopie gezwitschert werden. Nach der Fixierung sind Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz und Gehirn von Versuchs- und Kontrolltieren in einer 12-Well-Platte für die ex vivo optische Fluoreszenz-Bildgebung angeordnet. Bei umwandlung der Zählungen in Strahlungseffizienz können die Fluoreszenzdaten für jeden Organsatz quantifiziert werden.Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Organe Autofluoreszenz als Reaktion auf unterschiedliche Anregungswellenlängen zeigen. Kürzere Anregungswellenlängen wie verbessertegrüne fluoreszierende Proteine sind mit höheren Konzentrationen der Autofluoreszenz vor allem in der Leber und im Gehirn als weitrote oder nah-Infrarot Anregung Wellenlängen verbunden. Formalin Fixierung und Paraffineinbettung von Gewebeabschnitten aus jedem Organ ermöglicht die immunfluorochemische Analyse von Zellmarkern von Interesse sowie die Quantifizierung von Immun- oder Stromalzellen von Interesse in jedem Gewebe.Passen Sie die Bildeinstellungen an, um eine Sättigung zu vermeiden und Die Einstellungen nachzuverfolgen, und wenden Sie dann die gleichen Erfassungseinstellungen auf andere Stichproben im gleichen Experiment an, um Konsistenz und Genauigkeit zu erzielen. Immunhistochemie kann auch auf den Gewebeabschnitten durchgeführt werden, wenn ein Kandidat zelldurchdringendes Peptid mit einer Struktur oder einem Protein von Interesse kolokalisiert.

in-vivo-imaging-transduction-efficiencies-cardiac-targeting

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Echokardiographie geführten perkutanen intramyokardiale Injektion stellt einen effizienten, zuverlässigen und anzielbare Modalität für die Lieferung von Gentransfermittel oder Zellen in die Maus-Herz. Nach der Schritte in diesem Protokoll dargelegt, kann der Bediener schnell kompetente werden in diesem vielseitigen, minimal-invasive Technik.

Ultraschall-geführte Transthorakale intramyokardiale Injection in Mäuse

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Bildgebung lebender Zellen mit primären neonatalen Kardiomyozyten von Ratten nach lentiviraler und adenoviraler Transduktion mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie. Dies ermöglicht detaillierte Beobachtungen zellulärer Prozesse in lebenden Kardiomyozyten.

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Bild-Zellen, die das grün fluoreszierende Protein-markierten Angiotensin Typ 1a-Rezeptoren während der Endozytose durch Angiotensin-II-Behandlung eingeleitet werden. Diese Technik beinhaltet die Kennzeichnung Lysosomen mit einem zweiten Fluoreszenzmarker, und dann Software die Co-Lokalisierung des Rezeptors und Lysosom in drei Dimensionen über die Zeit zu analysieren, verwendet.

Live Cell Imaging und 3D-Analyse von Angiotensin-Rezeptor-Typ 1a Handel Transfizierte humane embryonale Nierenzellen mittels konfokaler Mikroskopie

Neue therapeutische Strategien in der kardialen regenerativen Medizin erfordern umfangreiche und detaillierte Studien in großen präklinischen Tiermodellen, bevor sie für den Einsatz beim Menschen betrachtet werden können. Hier zeigen wir eine perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektionstechnik bei Kaninchen, die ist wertvoll für Hypothesentests die Wirksamkeit solcher neuartiger Therapien.

Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion und Zelle-Lieferung in einem großen präklinischen Modell

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.

Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

Morphologische Veränderungen treten in immunreagierenden Fibroblastenzellen nach aktivierung auf und fördern Veränderungen bei der Zellrekrutierung. Verwendung von 2-Photonen-Bildgebung in Verbindung mit einem gentechnisch veränderten Fibroblasten-spezifischen Protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) Mauslinie und grün fluoreszierend markiert Lipopolysaccharid-FITC, können wir hochspezifische Aufnahme von Lipopolysaccharid in dermalen Fibroblasten und morphologischen...

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Dieses Protokoll stellt eine einfache und kohärente Möglichkeit dar, ein Gen von Interesse mit modRNA nach Myokardinfarkt bei Mäusen vorübergehend zu regulieren.

Lieferung von Modified mRNA in einem Myokardinfarkt-Mausmodell

Die myokardiale Gentherapie bei ischämischen Herzerkrankungen ist vielversprechend für zukünftige Therapeutika. Hier stellen wir ein Großtiermodell vor, um die Wirksamkeit der Gentherapie im ischämischen Herzen zu evaluieren.

Großtiermodell zur Evaluierung der Wirksamkeit der Gentherapie beim ischämischen Herzen

Das vorliegende Protokoll beschreibt drei Methoden zur Verabreichung kardioaktiver Therapeutika in einem Schweinemodell. Weibliche Landrassenschweine erhielten die Behandlung entweder: (1) Thorakotomie und transepikardiale Injektion, (2) kathetergestützte transendokardiale Injektion oder (3) intravenöse Infusion über die osmotische Minipumpe der Jugularvene.

Verabreichung kardioaktiver Therapeutika in einem Schweine-Myokardinfarkt-Modell

Der Haarfollikel ist ein hochkomplexes Anhängsel der Haut mit einer Vielzahl von Zelltypen. Der Follikel wird ständig dem Fahrrad durch das Leben des Organismus einschließlich Wachstum und Resorption mit einem Wachstum abhängig von bestimmten Stammzellen. Die Ausrichtung der Follikel durch Gene und Stammzellen, um seine Eigenschaften zu ändern, insbesondere die Art der Haarschaft ist, diskutiert. Haarfollikel-Delivery-Systeme beschrieben werden, wie Liposomen und virale Vektoren für die...

Gezielte Expression von GFP in den Haarfollikel mit Ex Vivo viralen Transduktion

Erfahren Sie, wie Sie die Transduktionseffizienz kardialer Peptide in CD1-Mäusen mit Fluoreszenzbildgebung und Histologie untersuchen. Dieses Protokoll maximiert die Datenerfassung aus einem einzelnen Tier und reduziert den Tierverbrauch erheblich.

In Vivo Imaging von Transduktionseffizienzen des Kardialen Peptids

Weitere Videos entdecken