Name: Probenahme und Analyse von Tierischen Duftsignalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Probenahme und Analyse tierischer Duftsignale mittels Headspace-SPME und GC-MS. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung flüchtiger Verbindungen zur Erforschung der chemischen Kommunikation bei Tieren.

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Wir danken Keith Holding für seine Unterstützung bei chemischen Analysen am Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, und Ben Mantle für die Produktion des Videos. Wir danken auch Prof. Gloriano Moneti, Dr. Giuseppe Pieraccini und den Mitgliedern des Zentrums für Massenspektrometrie der Universität Florenz, Florenz, sowie Prof. Luca Calamai und Dr. Marco Michelozzi vom ARCA Lab des CNR, Florenz, für ihre Hilfe bei der Einrichtung dieser Methodik. Die Forschungsprojekte, die die im Manuskript beschriebenen Probenahme- und Analysemethoden beinhalteten, wurden durch zwei Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement IDs: 327083, 703611), einen kleinen Zuschuss ("The sensory enriched primate") der Primate Society of Great Britain und einen kleinen Forschungsstipendium ("Dohunter-gatherers have a special sense of smell?")von der British Academy/The Leverhulme Trust an S.V. unterstützt. Die Laborarbeit, die für die Einrichtung dieser Methodik erforderlich war, wurde auch von der jährlichen Finanzierungskonkurrenz der Fakultät für Naturwissenschaften und Technik (Wolverhampton) an S.V. finanziert.

1. Probenentnahme
<ol><li>Probengerüche, die eine der folgenden sind:<ol>
<li>Sammeln Sie spontan, die von gewöhnungsmäßigen Studienteilnehmern (z. B. Zooprimaten) über Duftmarkierung auf Sterilfilterpapier (z. B. Geruchsdrüsengeruchsekrete) oder direkt in Fläschchen (z. B. Urin) freigesetzt werden.</li>
		<li>Sammeln Sie sterile Wattestäbchen nach dem Training der Probanden durch positives Verstärkungstraining.</li>
		<li>Sammeln Sie sterile Wattestäbchen nach der Sedierung der Studienteilnehmer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Proben in sterile 10-ml-Durchstechflaschen mit Schraubverschluss aus Klarglas und versiegeln Sie sie mit Schraubverschlüssen mit FTFE/Silikonsepten. Sofort bei -20 °C lagern. HINWEIS: Es ist wichtig, saubere persönliche Schutzausrüstung wie Nitrilhandschuhe zu verwenden. ändern Sie sie häufig; Vermeiden Sie direkten Hautkontakt mit Proben und Fläschchen. Es wird bevorzugt, brandneue Fläschchen zu verwenden; Im Falle von gebrauchten Fläschchen ist es jedoch wichtig, die Durchstechflaschen vorzureinigen und dann das gleiche Protokoll zu verwenden.</li>
	<li>Nehmen Sie jedes Mal, wenn Duftflecken gesammelt werden, Umweltrohlinge. Sammeln Sie beispielsweise die Probenahmemedien (z. B. Filterpapier oder Tupfer) und eine Kopfraumfläschchen, die während der Probenahme der Umgebung ausgesetzt sind.</li>
</ol>2. Probenvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie Proben im Feld vor, indem Sie mit einer Klinge ein ca. 10 mm großes Quadrat aus einem duftmarkierten Filterpapier oder dem Kopf des Tupfers schneiden und in eine 10-ml-Durchstechflasche mit verschraubtem Kopfraum legen.</li>
	<li>Nachdem jede Probe vorbereitet wurde, entsorgen oder reinigen Sie die Klinge, mit der die Probenahmemedien mit einem geeigneten antibakteriellen Tuch und/oder Alkohol geschnitten und gründlich getrocknet wurden.</li>
	<li>Lagern Sie alle Proben bei -20 °C. HINWEIS: Bevorzugt bei -20 °C oder anderweitig so niedrig wie praktisch möglich im Feld.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Analyse
<ol><li>Die Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und mindestens 1 h auf natürliche Weise auf Raumtemperatur erwärmen lassen.</li>
	<li>Richten Sie die Analysemethode auf dem GC-MS wie folgt ein:<ol>
<li>Befolgen Sie für SPME-Analysebedingungen die Anweisungen des Herstellers, um SPME-Fasern vor der ersten Verwendung zu konditionieren: Faservorbedingung (260 °C für 5 min), Probeninkubation (40 °C für 2 min), Extraktionszeit (15 min), Desorptionszeit (2 min) und Fasernachbedingung (260 °C für 20 min).</li>
		<li>Verwenden Sie die folgenden GC-Bedingungen: Säule (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), Injektortemperatur (270 °C), Durchfluss (1 ml/min), Injektionsmodus (splitless), GC-Ofenprofil (45 °C für 2 min; 4 °C/min bis 170 °C; 20 °C/min bis 300 °C), MSD-Transferleitung (280 °C). HINWEIS: Um die Konsistenz zwischen den Probenretentionszeiten zu verbessern, ist die Analysemethode die Aufbewahrungszeit gesperrt).</li>
		<li>Verwenden Sie die folgenden MSD-Bedingungen: Lösungsmittelverzögerung (2,5 min) und Scanbereich (29 bis 400 amu). HINWEIS: In früheren Protokollen 4 wurde ein Bereich von 10 bis400verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Spülgaszufuhr zur Faserkonditionierungseinheit eingeschaltet ist. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die SPME-Baugruppe korrekt im Auto-Sampler installiert ist und dass sie auf die Auto-Sampler-Trays, die Faserkonditionierungseinheit und den GC-Einlassanschluss ausgerichtet ist. Eine falsche Ausrichtung kann zu einer Beschädigung oder Zerstörung der SPME-Faser führen.</li>
</ol>4. Analyse
<ol><li>Platzieren Sie eine leere Headspace-Durchstechflasche (um als Systemleer zu fungieren) an der ersten Position des GC-MS-Auto-Sampler-Fachs. Platzieren Sie den Umgebungsrohling an der zweiten Position des Auto-Sampler-Fachs. Legen Sie die zu analysierenden Proben in die nachfolgenden Positionen des Automatischprobenfachs.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Analysesequenz, um jede Probe innerhalb des Probenfachs zu analysieren.<ol>
<li>Wählen Sie auf dem MassenHunter-Startbildschirm Sequenz | Lastfolge.</li>
		<li>Füllen Sie die Sequenztabelle für alle Rohlinge und Proben aus, indem Sie die entsprechenden Informationen einfügen. Speichern Sie die abgeschlossene Sequenztabelle. HINWEIS: Die genauen Informationen für die Sequenztabelle hängen von der Formatierung der Labore für die Tabelle ab. Zu den Mindestinformationen gehören normalerweise Probentyp, Probenname, Standort und Nummer der Durchstechflasche, Analysemethode und Speicherort und Name der Datendatei (die Zuweisung eines Datendateinamens, der mit dem Probennamen übereinstimmt, erleichtert die zukünftige Datenverarbeitung). Während der Analyse können weitere Proben zur Sequenz hinzugefügt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die Sequenz aus, indem Sie Sequenz | Ablauffolge.</li>
	<li>Nach der Analyse werden die Proben so schnell wie möglich in den Gefrierschrank zurückgespendet. HINWEIS: Es kann möglich sein, Proben erneut zu analysieren, aber es sollte beachtet werden, dass einige flüchtige Komponenten während der ersten Analyse vollständig extrahiert wurden und einige Verbindungen bei 40 ° C einer thermischen und bakteriellen Zersetzung unterzogen wurden, so dass das resultierende Chromatogramm möglicherweise nicht vollständig repräsentativ für die ursprüngliche Duftmarkierung ist.</li>
</ol>5. Datenanalyse
HINWEIS: Die anfängliche Datenanalyse umfasst die Integration von Chromatogrammen, um Retentionszeit- und Peak-Flächendaten zu erhalten, zusammen mit der vorläufigen Identifizierung von Peaks mit der ChemStation-Software und NIST (National Institute of Standards and Technology) Massenspektraldatenbanken, Version MSD F.01.01.2317. Die Datenanalyse kann entweder manuell oder durch eine halbautomatische Methode durchgeführt werden. Wenn die halbautomatische Methode verwendet wird, ist es manchmal von Vorteil, ein gewisses Maß an manueller Datenanalyse durchzuführen, um vorläufige Identifizierungen zu überprüfen.
<ol><li>Öffnen Sie die Datendatei, indem Sie in der linken Navigationsleiste auf die entsprechende Datei klicken. Das Gesamtionenchromatogramm (TIC) wird im oberen Fenster des Datenanalysebildschirms angezeigt.</li>
	<li>Um das TIC mit dem RTE-Integrator zu integrieren, wählen Sie Chromatogramm | Integrieren.</li>
	<li>Passen Sie die Integrationsparameter so an, dass Spitzen, die größer als 3 x Grundlinienrauschen sind, integriert werden. Wählen Sie Chromatogramm-| MS Signal Integration Parameter. Passen Sie in der Ausgabebox die minimale Spitzenfläche entsprechend an (1.0 führt in unseren Beispielen zu akzeptablen Ergebnissen).</li>
	<li>Um Spitzen zu identifizieren und einen zusammenfassenden Bericht zu generieren, wählen Sie Berichte exportieren | Bibliothekssuchergebnisse melden sich an XLS. HINWEIS: Die zu durchsuchenden Spektralbibliotheken müssen zusammen mit der Anzahl der anzuzeigenden Bibliotheksabweichungsabweichung in der Software voreingestellt werden, bevor eine Bibliothekssuche durchgeführt werden kann.</li>
	<li>Der resultierende Tabellenkalkulationsbericht enthält Integrationsdaten für jeden Peak und eine vorläufige Spektralbibliothekszuordnung zur Zuweisung der Identität. In der Regel sollte die Übereinstimmung zwischen Bibliotheksqualität und Bibliothek >80 sein, um die vorläufige Identifizierung zu akzeptieren. Speichern Sie die Tabelle.</li>
	<li>Identifizieren Sie einen Peak direkt aus dem TIC.<ol>
<li>Wählen Sie den Peak of Interest.</li>
		<li>Wenn der Peak klein ist, zoomen Sie hinein, indem Sie ein Feld um den Peak zeichnen, indem Sie die linke Maustaste gedrückt halten, das Feld über den Peak strecken und loslassen.</li>
		<li>Platzieren Sie die Cursorlinie so, dass sie sich am höchsten Punkt des Gipfels (oder kurz danach) befindet.</li>
		<li>Doppelklicken Sie mit der rechten Maustaste und das Massenspektrum für den Peak erscheint im unteren Fenster des Datenanalysebildschirms.</li>
		<li>Um die Spektralbibliothek zu durchsuchen, bewegen Sie den Cursor an eine beliebige Stelle im Spektralfenster und doppelklicken Sie mit der rechten Maustaste. Die Suchergebnisse der Bibliothek werden in einem neuen Fenster angezeigt.</li>
		<li>Um die Hintergrundgeräusche aus einem Interessenspektrum zu entfernen, doppelklicken Sie zunächst mit der rechten Maustaste auf den betreffenden Peak. Doppelklicken Sie dann mit der rechten Maustaste in einen Bereich ohne Spitzen unmittelbar vor dem Peak of Interest. Wählen Sie Chromatogramm-| Subtrahieren Sie Spektren. Das subtrahierte Spektrum wird im unteren Fenster des Datenanalysebildschirms angezeigt und zeigt "(-)" neben den SCAN-Daten im Fensterkopf an.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wyatt, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWyatt%2C+TD+%22Pheromones+and+Animal+Behavior%3A+Chemical+Signals+and+Signatures%22">Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).</li>
<li>Heymann, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neglected+sense-olfaction+in+primate+behavior%2C+ecology%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution.</a> American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).</li>
<li>Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22secret%22+in+secretions%3A+Methodological+considerations+in+deciphering+primate+olfactory+communication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication.</a> American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).</li>
<li>Vaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sternal+gland+scent-marking+signals+sex%2C+age%2C+rank+and+group+identity+in+captive+mandrills%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills.</a> Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).</li>
<li>Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dung+odours+signal+sex%2C+age%2C+territorial+and+oestrous+state+in+white+rhinos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).</li>
<li>Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+phylogenetic+signal+in+milliped+chemical+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Systematics+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses.</a> Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).</li>
<li>Kimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+substances+in+feces%2C+urine+and+urine-marked+feces+of+feral+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses.</a> Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).</li>
<li>Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+signals+during+pregnancy%3A+a+possible+chemical+basis+for+mother-infant+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition.</a> Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+of+scent-gland+secretions+in+an+Old+World+monkey+%28Mandrillus+sphinx%29%3A+influence+of+sex%2C+male+status%2C+and+individual+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity.</a> Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odour+signals+MHC+genotype+in+an+Old+World+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Odour signals MHC genotype in an Old World monkey.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).</li>
<li>Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawliszyn%2C+J+%22Solid+phase+microextraction%3A+theory+and+practice%22">Solid phase microextraction: theory and practice</a>. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).</li>
<li>Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+scent-marking+in+captive+red-ruffed+lemurs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs.</a> American Journal of Primatology. 81 (1), 22951(2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Verwendung von Kontrollproben, sowohl Umweltkontrollen, die zum Zeitpunkt der Probenentnahme erstellt wurden, als auch Systemrohlinge, sind entscheidend für die Interpretation der Duftmarkenproben. Alle Peaks, die der Sampling-Umgebung oder dem Instrumentssystem zugeschrieben werden, müssen von den Duftmarkenproben ausgeschlossen werden, so dass nur die Peaks von Interesse in jede Interpretation einbezogen werden. Diese Kontrollen können auch eine Rolle bei der Bewertung und Überwachung des "Zustands" der Instrumente...

Über die chemischen Veränderungen, die den olfaktorischen Signalen bei Tieren zugrunde liegen, ist sehr wenig bekannt1,auch wegen methodischer Herausforderungen bei der Erfassung und Quantifizierung flüchtiger chemischer Geruchsprofile2. Bei der Arbeit mit hochkomplexen, chemischen Matrizen gibt es mehrere mögliche Fallstricke; Dazu gehören bei der Probenahme und Analyse der Geruchsproben3.
Am Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, führen wir die Analyse von Gerüchen und Duftmarken durch, um zu verstehen, wie sie von Tieren verwendet werden können. Wir kombinieren Semiochemie mit Verhaltensökologie, Endokrinologie und Zytologie, um die Rolle von olfaktorischen Signalen in der Tierkommunikation besser zu verstehen.
Wir haben eine Methodik entwickelt und dann Gerüche und Markierungen von einer Vielzahl von Arten analysiert, darunter mehrere nichtmenschliche Primaten (z. B. Kronenmakis, Rotrüschenmakis, japanische Makaken, Olivenpaviane, Schimpansen) und andere Säugetiere (dh Katzen, Kühe). Wir haben eine Vielzahl von Proben gesammelt und analysiert, darunter Urin, Kot, Haare und Geruchssekrete. Diese Gerüche und Duftmarken bestehen aus komplexen Mischungen von Verbindungen, und daher muss jede Methodik, die für ihre Analyse verwendet wird, eine Form von Trenntechnik enthalten. Wie dargestellt, kommen sie auch in einer Reihe von Matrizen vor, die den Einsatz von Techniken zur Extraktion der interessierenden Komponenten erfordern.
Frühere Studien von Vaglio et al.4 und anderen Autoren5 verwendeten die dynamische Headspace-Extraktion (DHS) mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), während die direkte Lösungsmittelextraktion6 und komplexe Lösungsmittelextraktionen7 ebenfalls verwendet wurden. Insbesondere beinhaltet die dynamische Headspace-Probenahme das Spülen des Headspace mit einem bekannten Volumen an Inertgas, das letztendlich alle flüchtigen Verbindungen entfernt, mit Ausnahme derjenigen, die eine starke Affinität zur Probenmatrix aufweisen (z. B. polare Verbindungen in bässrigen Proben).
Für die aktuelle Methodik haben wir die Technik der Headspace-Festphasen-Mikroextraktion (HS-SPME) in Verbindung mit GC-MS übernommen. Insbesondere haben wir die Methodik entwickelt und verbessert, die Vaglio et al. bereits in ihrem vorherigen GC-MS-Labor8,9,10verwendet haben.
Lösemittellose Extraktionstechniken sind sehr effektiv für die Analyse kleiner, leicht flüchtiger Verbindungen (die sonst leicht aus einer Probe verloren gehen können), da diese Methoden Verbindungen auf einem stabilen, festen Phasenträger immobilisieren. Das HS-SPME verwendet eine mit einem Adsorbenspolymer beschichtete Faser, um flüchtige Verbindungen im Probenkopfraum einzufangen oder gelöste Verbindungen durch Eintauchen in eine wässrige biologische Flüssigkeit zu extrahieren11. Die Polymerbeschichtung bindet die Verbindungen nicht stark, daher können sie durch Erhitzen im Einspritzanschluss des GC entfernt werden. Diese Methode ist leistungsfähiger als Lösungsmittelextraktionstechniken und auch effektiver als DHS.
Im aktuellen Ansatz sind Proben in Glasfläschchen enthalten. Diese Fläschchen werden auf eine Temperatur von 40 °C erwärmt, um die Körpertemperatur des Tieres zu simulieren, um die flüchtigen Bestandteile der Duftmarke zu fördern, um den Kopfraum der Durchstechflasche einnahm. Eine SPME-Faser, die mit 65 μm Polydimethylsiloxan/Divinylbenzol (PDMS/DVB)-Sorptionsmittel beschichtet ist, wird der Headspace-Umgebung ausgesetzt und flüchtige Komponenten aus der Probe werden an die Faser adsorbiert. Beim Erhitzen der Faser im Einlass eines GC-MS werden die flüchtigen Komponenten von der Faser dezentriert und dann durch den GC getrennt. Massenspektrale Fragmentierungsmuster werden für jede Komponente mit hilfe der MS erhalten. Durch den Vergleich dieser Massenspektren mit Massenspektraldatenbanken kann es möglich sein, die Bestandteile der Duftmarke vorläufig zu identifizieren. Durch den Einsatz eines Auto-Samplers sind wir in der Lage, mehrere Proben in Chargen konsistent zu analysieren.
Da jede Art von SPME-Faser eine unterschiedliche Affinität zu polaren Chemikalien aufweist, wird die Faser normalerweise in Abhängigkeit von der Polarität und / oder dem Molekulargewicht der chemischen Zielverbindungen ausgewählt. Darüber hinaus werden die GC-Bedingungen in Abhängigkeit von der Art der GC-Säule und den Eigenschaften der chemischen Zielverbindungen geändert.
Diese Technik ermöglicht die semi-quantitative Analyse der flüchtigen Bestandteile von Duftmarkierungen, indem sie die Trennung und vorläufige Identifizierung der Komponenten in der Probe ermöglicht, gefolgt von der Analyse von Spitzenflächenverhältnissen, um nach Trends zu suchen, die Komponenten der Duftmarkierung bezeichnen könnten, die an der Signalisierung beteiligt sein können.
Die wichtigsten Stärken dieses aktuellen Ansatzes sind:
<ul style="list-style-type: square;"><li>Der Bereich der Probentypen, die analysiert werden können.</li>
	<li>Es sind keine aufwändig-aufbereitung oder Extraktionen erforderlich.</li>
	<li>Die Fähigkeit, flüchtige Komponenten zu analysieren.</li>
	<li>Die Fähigkeit, die Komponenten einer Mischung zu trennen.</li>
	<li>Um die erkannten Komponenten identifizieren zu können.</li>
	<li>Die Fähigkeit, semi-quantitative und potenziell quantitative Informationen über die erkannten Komponenten bereitzustellen.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>10-ml-Autosampler-Fläschchen</td><td>Agilent</td><td>5188-5392</td><td>10-ml-Fläschchen mit Schraubverschluss und</td></tr><tr><td>18-mm-Fläschchenkappen</td><td>Agilent</td><td>8010-0139</td><td>Magnetisch mit PTFE/Silikon-Septen</td></tr><tr><td>Autosampler Agilent</td><td></td><td>GC120 PAL-Autosampler</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarsäule</td><td>Agilent</td><td>HP5-MS</td><td>30 m x 0,25 mm; 0,25 & Mikro; m</td></tr><tr><td>Datenanalysesoftware</td><td></td> <td>Agilent-ChemStation</td><td></td></tr> <tr><td>Gaschromatograph</td><td>Agilent</td><td>7890B</td><td></td></tr><tr><td>Einlasssepten</td><td>Agilent</td><td>5182-3442</td><td>Merlin Microseal</td></tr><tr><td>Massenselektiver Detektor</td><td>Agilent</td><td>5977A</td><td></td></tr><tr><td>Reporting-Software</td> <td>Microsoft-Excel</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Spektralbibliothek</td><td>NIST</td><td>-</td><td>NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library</td></tr><tr><td>Suchprogramm für Spektralbibliotheken</td><td>NIST-MS</td><td></td> <td>Search v.2.2</td></tr><tr><td>Splitless Inlet</td><td>Liner Agilent</td><td>5190-4048</td><td></td></tr><tr><td>SPME-Fasern</td><td>Agilent</td><td>SU57345U</td><td>65 &micro; m PDMS/DVB-Faser</td></tr></tbody></table>

probenahme und analyse von tierischen duftsignalen

Sampling and Analysis of Animal Scent Signals

Wir haben eine effektive Methodik für die Probenahme und Analyse von Geruchssignalen entwickelt, indem wir Headspace-Festphasen-Mikroextraktion in Verbindung mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie verwenden, um zu verstehen, wie sie in der Tierkommunikation verwendet werden können. Diese Technik ermöglicht die semi-quantitative Analyse der flüchtigen Bestandteile von Geruchssekreten, indem sie die Trennung und vorläufige Identifizierung der Komponenten in der Probe ermöglicht, gefolgt von der Analyse von Spitzenflächenverhältnissen, um nach Trends zu suchen, die Verbindungen bedeuten könnten, die an der Signalisierung beteiligt sein könnten. Die wichtigsten Stärken dieses aktuellen Ansatzes sind die Bandbreite der probentypen, die analysiert werden können; das Fehlen eines Bedarfs an komplexer Probenvorbereitung oder -extraktion; die Fähigkeit, die Bestandteile einer Mischung zu trennen und zu analysieren; die Identifizierung der erkannten Komponenten; und die Fähigkeit, semi-quantitative und potenziell quantitative Informationen über die erkannten Komponenten bereitzustellen. Die Haupteinschränkung der Methodik bezieht sich auf die Stichproben selbst. Da die Komponenten von spezifischem Interesse flüchtig sind und diese leicht verloren gehen oder ihre Konzentrationen verändert werden können, ist es wichtig, dass die Proben nach ihrer Entnahme angemessen gelagert und transportiert werden. Dies bedeutet auch, dass die Lagerungs- und Transportbedingungen der Proben relativ kostspielig sind. Diese Methode kann auf eine Vielzahl von Proben angewendet werden (einschließlich Urin, Kot, Haar- und Geruchssekreten). Diese Gerüche bestehen aus komplexen Mischungen, die in einer Reihe von Matrizen vorkommen, und erfordern daher den Einsatz von Techniken, um die einzelnen Komponenten zu trennen und die Verbindungen von biologischem Interesse zu extrahieren.

Nach diesem Protokoll identifizierten wir vorläufig insgesamt 32 flüchtige chemische Verbindungen aus der Analyse von 14 ano-genitalen Duftmarken, die spontan auf Filterpapier von Rotrüschenmakis (Varecia variegata rubra) freigesetzt wurden, und verglichen Geruchsprofile mit Merkmalen des Signalgebers12. Natürlich vorkommende flüchtige Verbindungen wie Kohlenwasserstoffe, Terpene, Terpenalkohole und Ketone waren in diesen Profilen vorhanden und enthielten Verbindungen, von denen zuvor fes...

Wir haben eine effektive Methodik für die Probenahme und Analyse von Geruchssignalen entwickelt, um zu verstehen, wie sie in der Tierkommunikation verwendet werden können. Insbesondere verwenden wir Headspace-Festphasen-Mikroextraktion in Verbindung mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie, um die flüchtigen Bestandteile von Tiergerüchen und Geruchsmarkierungen zu analysieren.

Probenahme und Analyse von Tierischen Duftsignalen

We have developed an effective methodology for sampling and analysis of odor signals, by using headspace solid-phase microextraction coupled with gas ...

Die Rolle, die Geruch in der Tierkommunikation spielt, wird derzeit unterschätzt und daher wenig untersucht. Insbesondere über die chemischen Veränderungen, die den olfaktorischen Signalen bei Tieren, einschließlich Menschen, zugrunde liegen, ist sehr wenig bekannt. Und diese sind auch auf methodische Herausforderungen zurückzuführen, die Erfassung und Quantifizierung chemischer Verbindungen von Gerüchen, die von Tieren zur Kommunikation verwendet werden.Bei der Arbeit mit hochkomplexen chemischen Gemischen gibt es mehrere potenzielle Herausforderungen, darunter auch bei der Probenahme und Analyse der Geruchsproben. Wir führen die Analyse von Gerüchen durch, die von Tieren verwendet werden, um zu verstehen, wie sie von ihnen verwendet werden können, wenn sie miteinander kommunizieren. Wir kombinierten Zytochemie mit Bioökologie Endokrinologie und Zytologie, um unser Verständnis der Rolle des Geruchs in der Tierkommunikation zu verbessern.Für unsere aktuelle Methodik in Wolverhampton haben wir die Technik der Headspace-Festphasenmikrostruktur in Verbindung mit der Gaschromatographie-Massenspektrometrie übernommen, die auf der in der Vergangenheit verwendeten Methodik aufbaut und eine unsichtbare Methodik verwendet. Probengerüche werden auf eine der folgenden Arten gesammelt. Eine, spontan freigesetzte Probengerüche von gewöhnungsmäßigen Studienteilnehmern.Zum Beispiel sammeln Zooprimaten Duftdrüsengeruchssekrete durch Duftmarkierung auf Sterilem Filterpapier oder Urinproben direkt in Fläschchen. Zweitens, nach dem Training sammeln studienteilnehmer durch die Verwendung von positiver Verstärkung Geruchssekrete, indem sie Duftblick mit sterilen Wattestäbchen reiben. Drittens sammeln die Probanden nach der Sedierung der Studienteilnehmer Geruchssekrete, indem sie Duftdrüsen mit sterilen Wattestäbchen reiben, durch Proben in sterile 10-Milliliter-Schraubverschlüsse, Klarglasfläschchen und Dichtung mit Schraubverschlüssen mit P T F E Silikonsektor.Lagern Sie die Fläschchen sofort bei minus 20 Grad Celsius. Beachten Sie, dass es wichtig ist, dass während der Probenahme saubere persönliche Schutzausrüstung wie Nitrilhandschuhe verwendet wird. Wechselhandschuhe vermeiden häufig den direkten Hautkontakt mit Proben und Fläschchen.Es wird bevorzugt, brandneue Fläschchen zu verwenden. Im Falle von gebrauchten Fläschchen ist es jedoch wichtig, die Durchstechflaschen vorzureinigen und dann das gleiche Protokoll zu verwenden. Nehmen Sie jedes Mal, wenn Duftmarken gesammelt werden, Umweltrohlinge.Setzen Sie dazu während der Probenahme ein unbenutztes Filterpapier oder Wattestäbchen und Fläschchen der Umwelt aus. Proben werden im Feld vorbereitet. Für ein duftendes Filterpapier schneiden Sie ein ca. 10 Millimeter Quadrat aus dem Papier und legen Sie es in eine 10 Milliliter Schraubenkopfraumfläschchen.Für einen Tupfer den Tupferkopf ganz am Ende des Tupferschaftes abschneiden und in eine Kopfraumfläschchen legen. Nachdem jede Probe vorbereitet wurde, entsorgen oder reinigen Sie die Klinge, um die Probenahmemedien mit einem geeigneten antibakteriellen Tuch und/oder Alkohol zu schneiden und trocknen Sie gründlich ab. Lagern Sie alle Proben bei minus 20 Grad Celsius.Beachten Sie, dass Proben bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden sollten, aber im Feldlager bei der niedrigsten Temperatur möglich ist und so kurz wie möglich auf minus 20 Grad Celsius übertragen wird. Vor der Analyse die Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und mindestens eine Stunde lang auf natürliche Weise auf Raumtemperatur laufen lassen. Richten Sie die Analysemethoden auf dem GCMS wie folgt für SPMS-Analysebedingungen ein, befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um SBME-Fasern vor der ersten Verwendung zu konditionieren.Es ist wichtig, dass die SBME-Baugruppe korrekt im Automatisch-Probenehmer installiert ist und dass sie auf die Faserkonditionierungseinheit und den GC-Einlassanschluss ausgerichtet ist. Eine falsche Ausrichtung kann zu einer Beschädigung oder Zerstörung der Sbme-Faser führen. Stellen Sie sicher, dass die Barschgaszufuhr zur Faserkonditionierungseinheit eingeschaltet ist.Um die Konsistenz zwischen den Probenaufbewahrungszeiten zu verbessern, ist die Analysemethode die Verweilzeit gesperrt, fügen Sie die Probenfläschchen in das Auto-Sampler-Tray ein leeres Kopfraum-Fläschchen ein, um als Systemrohling in der ersten Position des Auto-Sampler-Trays zu fungieren. Platzieren Sie den Umgebungsrohling an der zweiten Position und legen Sie dann alle verbleibenden Proben für die Analyse in die nachfolgenden Positionen des automatischen Probenahmefachs. Erstellen Sie eine Analysesequenz, um jede Probe innerhalb des Probenfachs zu analysieren.Wählen Sie auf dem Startbildschirm des Massenjägers die Sequenz für die Menüleiste aus und laden Sie dann die Sequenz aus dem Dropdown-Menü. Eine leere Sequenztabelle wird angezeigt, um die Sequenztabelle für alle Leerzeichen und Samples zu vervollständigen, indem die entsprechenden Informationen als abgeschlossene Sequenztabelle gespeichert werden. Beachten Sie, dass die genauen Informationen für die Sequenztabelle von der Formatierung der Tabelle durch die Laboratorien abhängen.Zu den Mindestinformationen gehören normalerweise der Beispieltypname, der Dateispeicherort und die Anzahl der Analysemethode sowie der Speicherort der Datendatei sowie die Namenszuweisung eines Datendateinamens, der mit dem Beispielnamen bei der zukünftigen Datenverarbeitung übereinstimmt. Während der Analyse können weitere Proben zur Sequenz hinzugefügt werden. Führen Sie die Sequenz aus, indem Sie sequenz aus der Menüleiste auswählen, und führen Sie dann sequenz aus.Nach der Analyse wurden die Proben so schnell wie möglich in den Gefrierschrank zurückgebracht. Beachten Sie, dass es möglich sein kann, Proben erneut zu untersuchen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass einige flüchtige Komponenten während der ersten Analyse vollständig extrahiert wurden und einige Verbindungen bei 40 Grad Celsius einer thermischen und bakteriellen Zersetzung unterzogen worden sein können.Daher ist das Ergebnis im Chromatogramm möglicherweise nicht vollständig repräsentativ für die ursprüngliche Duftmarkierung. Die anfängliche Datenanalyse umfasst die Integration von Chromatogrammen, um Retentionszeit- und Peak-Flächendaten zu erhalten, zusammen mit der vorläufigen Identifizierung von Peaks mit Cam-Station-Software und Nest-Massenspektraldatenbanken. Die Datenanalyse kann entweder manuell oder durch eine halbautomatische Methode durchgeführt werden.Wenn die halbautomatische Methode verwendet wird, ist es manchmal von Vorteil, ein gewisses Maß an manueller Datenanalyse durchzuführen, um vorläufige Identifizierungen zu überprüfen. Um die Datenanalyse zu starten, öffnen Sie die Datendatei, indem Sie in der linken Navigationsleiste auf die entsprechende Datei klicken. Das Gesamtionenchromatogramm TIC wird im oberen Fenster des Datenanalysebildschirms angezeigt.Um den TIC mit dem RTE-Integrator zu integrieren, wählen Sie zuerst Chromatogramm aus der Menüleiste und dann Integrator aus dem Dropdown-Menü, ein Popup-Fenster öffnet sich und wählen Sie den RTE-Integrator aus. Gehen Sie zurück zum Chromatogramm-Menü und wählen Sie nun Integrieren. Um die Integrationsparameter so anzupassen, dass Spitzen oder mehr als das Dreifache des Basislinienrauschens integriert sind, wählen Sie erneut Chromatogramm aus der Menüleiste und dann MS Signal-Integrationsparameter aus dem Dropdown-Menü.Passen Sie im Popup-Feld die minimale Spitzenfläche entsprechend an 1.0 führt in unseren Beispielen zu akzeptablen Ergebnissen. Um Spitzen zu identifizieren und einen Zusammenfassendbericht zu generieren, wählen Sie Berichte aus der Menüleiste exportieren und dann Den Bericht über die Suchergebnisse in XLS mit Bibliothek aus. Beachten Sie, dass die zu durchsuchenden Spektralbibliotheken zusammen mit der Anzahl der anzuzeigenden Bibliotheksabweichungsabweichung in der Software voreingestellt werden müssen, bevor eine Bibliothekssuche durchgeführt werden kann.Der resultierende Tabellenkalkulationsbericht enthält Integrationsdaten für jeden Peak und eine vorläufige Spektralbibliothekszuordnung zur Zuweisung der Identität. In der Regel sollte die Bibliotheksqualität oder Bibliothekskennung größer als 80 sein, um die vorläufige Identifizierung zu akzeptieren. Speichern Sie die Tabelle.Um einen Peak direkt aus dem TIC zu identifizieren, wählen Sie den Peak of Interest aus. Wenn der Peak klein ist, zoomen Sie hinein, indem Sie ein Feld um den Peak zeichnen, indem Sie die linke Maustaste gedrückt halten, strecken Sie das Feld über den Peak und lassen Sie die Maustaste los. Platzieren Sie die Cursorlinie so, dass sie sich am höchsten Punkt des Gipfels oder kurz danach befindet.Doppelklicken Sie, die rechte Maustaste und das Massenspektrum für den Peak erscheinen im unteren Fenster des Datenanalysebildschirms. Um eine Spektralbibliothek zu durchsuchen, bewegen Sie den Cursor an eine beliebige Stelle im Spektralfenster und doppelklicken Sie mit der rechten Maustaste, die Suchergebnisse der Bibliothek werden in einem neuen Fenster angezeigt. Um zuerst das Hintergrundrauschen aus einem Interessierensbereich zu entfernen, doppelklicken Sie mit der rechten Maustaste auf den betreffenden Peak und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste in einem Bereich ohne Peaks unmittelbar vor dem Peak of Interest auf die Schaltfläche Subtrahieren im Menüband oder wählen Sie Chromatogramm für die Menüleiste und subtrahieren Sie dann Spektren aus dem Dropdown-Menü.Das subtrahierte Spektrum wird im unteren Fenster des Datenanalysebildschirms angezeigt und zeigt einen Bindestrich neben den Scandaten in der Fensterüberschrift an. Nach diesem Protokoll identifizierten wir vorläufig insgesamt 32 flüchtige chemische Verbindungen aus der Analyse von 14 genitalen Duftmarken, die spontan von roten Rüschenmakis auf Filterpapier freigesetzt wurden, und verglichen Geruchsprofile mit Merkmalen des Signalgebers, die natürlich vorkommende flüchtige Verbindungen wie Kohlenwasserstoffe, Terpene, Turpinalkohole und Ketone in diesen Profilen vorhanden waren und die Verbindungen enthalten, die zuvor als Sexualhormone und Hinweise auf die Fitness gefunden worden waren. bei anderen Tierarten. Die Verbindungen, die vorläufig identifiziert wurden, sind in Tabelle eins aufgeführt.Repräsentative Chromatogramme, eines von einer Kontrolle und eines von einer Lima-Duftmarke, sind in Abbildung eins dargestellt. Die Anzahl und relative Häufigkeit der Komponenten variierte von Probe zu Probe bei verschiedenen Studienteilnehmern. In allen Proben waren jedoch sechs Verbindungen mit der Bezeichnung A bis F auf dem Chromatogramm vorhanden.Diese Verbindungen wurden jeweils auf Höhe zu E's Insel ein hexanaler Parakristall sechs Paramentha zwei acht Farbstoff eins zwei Pinen vier und Pentodecan gebogen. Die Ergebnisse dieser Studie deuteten darauf hin, dass rote Rüschenmakis gesendete Markierungen verwenden, um Informationen über Geschlecht und weibliches Alter zu vermitteln, wobei eine genitale Markierung keine Rolle bei der soziosexuellen Kommunikation spielt. Ein weiteres repräsentatives Ergebnis nach der Verwendung dieses Protokolls war unsere Studie zur Fruchtbarkeitswerbung durch weibliche Olivenpaviane.Wir identifizierten insgesamt 74 flüchtige Verbindungen aus der Analyse von 395 weiblichen Pavian-Vaginalgeruchsproben. Dazu gehörten eine Reihe von natürlich vorkommenden geruchsintensiven flüchtigen Verbindungen wie Ketone, Alkohole, Aldehyde, Terpene, flüchtige Fettsäuren und Kohlenwasserstoffe. Typische Chromatogramme, die verwendet werden, um leere Troll- und weibliche Pavian-Vaginalgeruchsproben aus fruchtbaren und nicht fruchtbaren Perioden zu vergleichen, sind in Abbildung zwei dargestellt.Wir untersuchen die Zusammenhänge zwischen vaginalen Geruchsprofilen und sexueller Empfänglichkeit weiblicher Paviane. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sich die Gesamtmenge des vaginalen Geruchs mit der Fruchtbarkeit unterscheidet, was darauf hindeutet, dass der Geruch eine Rolle bei der Signalisierung der weiblichen Pavianfruchtbarkeit spielen könnte. Wir fanden auch Unterschiede im vaginalen Geruch zwischen Gruppentypen, aber wir konnten die Auswirkungen der Gruppenzusammensetzung, der weiblichen Altersaltersgleichheit nicht unterscheiden.Es sind die kombinierten Vorteile der Probenahme und Verwendung des GCMS. Die Verwendung der Festphasen-Mikroextraktion im Kopfraum ermöglicht es also, eine breite Palette verschiedener Proben mit GCMS zu analysieren. Wir sind in der Lage, die Komponenten dieser komplexen Markierungen zu trennen und dann jede dieser einzelnen Komponenten mit dem Massenspektrometer zu identifizieren.Und dann, so ist die ganze kombinierte Technik sehr leistungsfähig und gibt uns viele Informationen über diese Duftmarkierungen, die in der Vergangenheit eine Menge Probenvorbereitungsextraktion erforderlich gewesen wären, um die Ergebnisse zu erhalten.

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Forschung

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Verhalten

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