Charakterisierung der In-Vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch RNA-Seq-Analyse
16. Mai 2020
Hier wird ein schrittweises Verfahren zur In-vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch Kontakthemmung dargestellt, gefolgt von einer Charakterisierung auf molekularer Ebene durch RNA-seq-Analyse.
In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren, das zwei Teile enthält. Erstens eine monolayer 2D-Keratinozytendifferenzierungsmethode in vitro durch Kontakthemmung. Zweitens, seine molekulare Charakterisierung durch RNA-seq.
Die 2D-In-vitro-Differenzierungsmethode ist einfach und einfach durchzuführen. Es kann verwendet werden, um epidermale Differenzierung zu studieren, vor allem, wenn eine große Anzahl von Zellen notwendig sind. Zum Beispiel in der epigenomischen Analyse.
Die detaillierte RNA-Seq-Analyse-Pipeline ist klar und transparent für Forscher mit grundlegenden Bioinformatik-Fähigkeiten und kann für jede Massen-RNA-Seq-Analyse verwendet werden. Beachten Sie bei der erstmaligen Durchführung des Differenzierungsprotokolls, dass die Aussaatdichte schwierig sein kann. Probieren Sie mehrere Sädichten aus, um herauszufinden, welche mit Ihrer Zelllinie am besten funktioniert.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung keratinozyten Wachstumsmedium oder KGM und 500 Milliliter jeweils Proliferationsmedium und Differenzierungsmedium nach Manuskriptrichtungen. Samen primäre Keratinozyten mit einer Dichte von 5 bis 20 000 Zellen pro Zentimeter quadratisch und fügen genug Proliferationsmedium, um die Zellen zu decken. Zwei Tage nach der Aussaat die Zellen mit dem Proliferationsmedium erfrischen.
Überprüfen Sie die Zellen regelmäßig unter dem Mikroskop und erfrischen Medium jeden zweiten Tag. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, induzieren Sie eine Differenzierung, indem Sie das Medium in das Differenzierungsmedium ändern. Um Zellen für weitere RNA-Analysen zu sammeln, waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS und fügen Sie dann einen Lysepuffer hinzu.
Sammeln Sie Zellen an den Differenzierungstagen Null, zwei, vier und sieben. Nach der RNA-Isolation werden doppelsträngige cDNA umgewandelt und RNA-Seq-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation vorbereitet. Nach der Sequenzierung werden die Sequenzlesungen heruntergeladen und dem menschlichen Genom zugeordnet.
Nach dem Herunterladen und Installieren von R-Paketen, generieren Sie eine Kontotabelle aus der readpergene.out. und schreiben Sie eine Beispieldatendatei mit allen Dateinamen, dem Tag der Differenzierung und anderen relevanten Beispieldaten. Ein Beispiel finden Sie in den zusätzlichen Codierungsdateien.
Verwenden Sie dann die Zähltabelle und die Beispieldaten, um ein Deseq2-Objekt zu generieren, das sowohl die zählbaren als auch die Beispieldaten enthält. Normalisieren Sie für die Normalisierung der Genexpression die Zähltabelle im deseq2-Objekt entweder mit Deseq2RLD- oder VST-Normalisierung. Während die RLD-Normalisierung bevorzugt wird, ist die VST-Normalisierung viel schneller.
Verwenden Sie die dist-Funktion in R, um den Stichprobenabstand basierend auf den normalisierten Lesezählintensitäten zu zeichnen und dann hclust clustering basierend auf dem Stichprobenabstand durchzuführen. Zeichnen Sie als Nächstes die Heatmap mit der pheatmap-Funktion. Schließlich generieren Sie eine Prinzipkomponentenanalyse oder ein PCA-Diagramm der normalisierten Lesezählintensitäten mit der plotPCA-Funktion von deseq2.
PCA dient als Werkzeug in der explorativen Datenanalyse und kann verwendet werden, um Entfernung und Verbindung zwischen verschiedenen Proben zu visualisieren. Führen Sie eine hochvariable Genexpressionsanalyse mit der rowVars-Funktion durch, die die Top 500 hochvariablen Gene extrahiert, indem sie die Varianz zwischen Proben aus verschiedenen Zeitpunkten ordnet. Diese Gene weisen die höchste Standardabweichung ihrer normalisierten Intensität über Tage der Differenzierung auf.
Führen Sie k-means Clustering auf den hochvariablen Genen durch, um sie nach verschiedenen Expressionsmustern zu gruppieren. Visualisieren Sie die Gene in einer Heatmap mit dem pheatmap-Paket. Die in der Heatmap dargestellte Intensität ist die normalisierte Deseq2-Intensität mit subtrahierter Medianwert.
Generieren Sie eine Liste der exprimierten Hintergrundgene, die alle Gene mit mehr als 10 Zählungen in einer einzigen Probe enthält, und erstellen Sie eine Liste mit Genen aus jedem Cluster. Führen Sie schließlich eine Gene Ontology-Analyse mit GOrilla durch. Verwenden Sie die Hintergrundgenliste als Hintergrundsatz und die Liste der hochvariablen Gene in Clustern als Zielsatz, und klicken Sie dann auf suchangereicherte GO-Begriffe.
Alternativ können fortgeschrittenere R-Benutzer den PaketclusterProfiler verwenden, um die GO-Terminologieanreicherungsanalyse zu automatisieren. Keratinozytenlinien, die von fünf Individuen abgeleitet wurden, wurden zur Differenzierung in RNA-Seq-Analysen verwendet. Die Hauptkomponentenanalyse zeigte, dass Keratinozyten, die sich einer Differenzierung unterziehen, unterschiedliche allgemeine Genexpressionsprofile miteinander verbunden hatten.
Hochvariable Gene wurden gruppiert, um die Dynamik und Muster der Genexpression während der Differenzierung zu visualisieren. Jeder Gencluster wurde durch die Keratinozytendifferenzierungs-Kennzeichengene repräsentiert und die Gene Ontology-Anmerkung zeigte einen deutlichen Unterschied in den Genfunktionen. Im zweiten Experiment wurden Zellmorphologie und Genexpressionsunterschiede zwischen Keratinozyten aus gesunden Kontrollen und Zelllinien von Patienten mit P63-Mutationen verglichen.
Die Hauptkomponentenanalyse zeigte, dass die Kontrollzelllinien eindeutig einem Differenzierungsmuster folgten, aber das Genexpressionsmuster mutierter Zellen während der Differenzierung bleibt weitgehend dem von proliferierenden oder undifferenzierten Zellen ähnlich. In der Clustering-Analyse wurden Gene in Cluster eins in Kontrollzellen und teilweise downreguliert in Patientenzellen, die R204W- und R279H-Mutationen trugen, aber in Zellen, die R304W trugen, hoch verblieben. Diese Gene spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der Zellproliferation, wie die Gene Ontology-Analyse zeigt.
Cluster zwei Gene wurden zuerst eingeführt und anschließend in Kontrollzellen nach unten reguliert. Diese Gene sind wahrscheinlich an der Keratinozytendifferenzierung beteiligt, da epidermale Differenzierungs- und Keratinisierungsfunktionen für diesen Cluster stark angereichert waren. Gene in Cluster drei wurden erst am Ende der Differenzierung in Kontrollzellen induziert, was darauf hindeutet, dass sie eine Rolle in der äußersten Schicht der Epidermis spielen können.
Bei der Analyse von RNA-seq-Daten ist es wichtig, vorher zu wissen, was zu erwarten ist. Dies wird Ihnen sowohl bei der Interpretation der Qualitätskontrolle und des PCA-Plots als auch bei der Bewertung helfen, ob Ihre Ergebnisse sinnvoll sind. Unsere Methoden können sowohl in der epidermalen Biologie als auch in anderen biologischen Systemen zur Untersuchung der Gentranskription eingesetzt werden.
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Übersicht
Dieser Artikel präsentiert ein schrittweises Verfahren für die In-vitro-Differenzierung menschlicher primärer Keratinozyten durch Kontaktinhibition, gefolgt von molekularer Charakterisierung mittels RNA-Seq-Analyse.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Genomik
Hintergrund
- Keratinozyten sind essentiell für die epidermale Differenzierung.
- Das Verständnis ihrer Differenzierung ist entscheidend für die Hautbiologie.
- RNA-Seq bietet Einblicke in Genexpressionsprofile.
- Kontaktinhibition ist ein Schlüsselmechanismus bei der Zelldifferenzierung.
Ziel der Studie
- Eine zuverlässige Methode für die Keratinozytendifferenzierung in vitro zu entwickeln.
- Die molekularen Veränderungen während der Differenzierung zu charakterisieren.
- Studien in der epidermalen Biologie und verwandten Bereichen zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- In-vitro-Kultur menschlicher primärer Keratinozyten.
- Induktion der Differenzierung durch Kontaktinhibition.
- RNA-Seq-Analyse für molekulare Charakterisierung.
- Bewertung der Genexpressionsänderungen während der Differenzierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Differenzierung von Keratinozyten wurde erreicht.
- Verschiedene Genexpressionsprofile wurden mittels RNA-Seq identifiziert.
- Kontaktinhibition induzierte effektiv die Differenzierung.
- Die Methode ist für großangelegte Studien geeignet.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen unkomplizierten Ansatz für die Keratinozytendifferenzierung.
- RNA-Seq-Analyse offenbart wichtige molekulare Erkenntnisse.
- Diese Methode kann die Forschung in der Hautbiologie und Epigenetik vorantreiben.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Robust in vitro differentiation and RNA-seq profiling of human primary keratinocytes provide a scalable platform for dissecting epidermal biology and disease mechanisms. This workflow enables high-confidence target validation and mechanistic de-risking at the discovery stage, supporting translational continuity for dermatological and epithelial research portfolios. The approach facilitates quantitative, reproducible molecular characterization essential for early-stage decision-making in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of differentiation pathways and gene regulatory networks in human keratinocytes.
- Supports functional target validation by linking gene expression dynamics to phenotypic outcomes.
- Facilitates mechanistic de-risking for candidate targets implicated in epidermal disorders.
- Provides a quantitative framework for portfolio triage based on molecular signatures.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, reproducible 2D keratinocyte differentiation systems for downstream assays.
- Delivers standardized RNA-seq outputs for benchmarking compound or genetic perturbation effects.
- Enables high-throughput readiness for screening gene expression modulators in disease-relevant contexts.
- Supports platform reuse across multiple cell lines and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro gene expression patterns with in vivo epidermal stratification for translational relevance.
- Enables comparative analysis of healthy versus disease-mutant keratinocytes for biomarker discovery.
- Supports risk-adjusted advancement of targets with validated differentiation phenotypes.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven gene expression analysis and functional validation in human keratinocytes.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification through quantitative transcriptomic profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical outputs such as PCA, clustering, and GO enrichment to compare differentiation states and conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant biology by modeling patient-derived mutations and phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable workflow adaptable to diverse keratinocyte lines and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes differentiation and RNA-seq analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early molecular de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of dermatology and epithelial biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, RNA-seq library preparation, and bioinformatics analysis.
- Needs access to next-generation sequencing platforms and computational infrastructure for data processing.
- Demands cross-team standardization of seeding density, differentiation timing, and data normalization.
- Adaptable to various keratinocyte lines and patient-derived models with protocol optimization.
- Dependent on robust quality control and statistical analysis to ensure data interpretability.
