Name: Charakterisierung der In-Vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch RNA-Seq-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Erfahren Sie die In-vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch Kontaktinhibition mit RNA-Seq-Analyse. Diese Methode ermöglicht molekulare Einblicke in die epidermale Biologie.

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Diese Forschung wurde von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) unterstützt. (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Stipendium der Radboud University (H.Z.); und Stipendium des Chinesischen Stipendienrates 201406330059 (J.Q.).

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<li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+whole+transcript+and+3%27+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9(2019).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21(2014).</li>
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<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51(2013).</li>
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 <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Induktion der menschlichen Keratinozytendifferenzierung und anschließenden Charakterisierung mittels RNA-Seq-Analysen. In der aktuellen Literatur verwenden viele Studien zur Unterscheidung der menschlichen Keratinozyten zwei andere Methoden, mit einer hohen Kalziumkonzentration oder mit Serum als Methoden zur Differenzierung2,3,23. Ein früherer Bericht verglich diese drei verschiedenen Me...

Menschliche primäre Keratinozyten, die von der menschlichen Haut abgeleitet werden, werden oft als zelluläres Modell verwendet, um die Biologie der Epidermis1,2,3,4zu studieren. Die Schichtung der Epidermis kann durch Keratinozytendifferenzierung modelliert werden, entweder in 2D-Unterschicht-Manier oder 3D-Luftlift-Organotypikmodell2,3,5,6,7. Obwohl 3D-Modelle für die Bewertung der epidermalen Struktur und Funktion immer wichtiger geworden sind, sind 2D-Differenzierungsmodelle aufgrund ihrer Bequemlichkeit und der Möglichkeit, eine große Anzahl von Zellen für Analysen zu generieren, immer noch weit verbreitet.
Verschiedene Bedingungen wurden angewendet, um Keratinozytendifferenzierung in 2D zu induzieren, einschließlich Zugabe von Serum, hoher Kalziumkonzentration, niedrigerer Temperatur und Hemmung der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren2,3. Jede dieser Methoden wurde durch eine Reihe von Keratinozyten-Differenzierungsmarkergenen validiert und erwies sich als wirksam bei der Beurteilung der Keratinozytendifferenzierung, auch unter pathologischen Bedingungen. Diese Induktionsbedingungen zeigen jedoch auch Unterschiede in ihrer Differenzierungseffizienz und Kinetik, wenn bestimmte Panels von Markergenen untersucht werden2,3.
Eine dieser Methoden beinhaltet Keratinozytenkontakthemmung und Erschöpfung der Wachstumsfaktoren im Kulturmedium8. Es hat sich gezeigt, dass Keratinozyten spontan unterscheiden können, wenn Zellen die volle Dichte erreichen.  Der Ausschluss von Wachstumsfaktoren im Kulturmedium kann die Differenzierung weiter verstärken. Die Methode, die Kontakthemmung und erschöpfende Wachstumsfaktoren kombiniert, hat gezeigt, dass sie differenzierte Keratinozyten mit Genexpressionsmustern erzeugt, die der normalen geschichteten Epidermis ähneln, wenn mehrere epidermale Marker verwendet werden3, was darauf hindeutet, dass dieses Modell für die Untersuchung der normalen Keratinozytendifferenzierung geeignet ist. Kürzlich wurden zwei umfassende Genexpressionsanalysen der Keratinozytendifferenzierung mit diesem Modell9,10berichtet. Die Forscher validierten dieses Modell auf molekularer Ebene und zeigten, dass es verwendet werden kann, um normale und kranke Keratinozytendifferenzierung zu untersuchen.
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur In-vitro-Differenzierungsmethode und molekularen Analyse differenzierter Zellen mit RNA-seq. Es veranschaulicht auch die Charakterisierung des Transkriptoms der Zellen am Differenzierungstag 0 (Proliferationsstadium), Tag 2, Tag 4 und Tag 7 (frühe, mittlere bzw. späte Differenzierung). Es wird gezeigt, dass differenzierte Keratinozyten Genexpressionsmuster aufweisen, die Zellen während der epidermalen Schichtung weitgehend ähneln. Um zu untersuchen, ob diese Methode für die Untersuchung der Hautpathologie verwendet werden kann, haben wir dieselbe experimentelle und Analyse-Pipeline eingesetzt, um Keratinozyten zu untersuchen, die Mutationen des Transkriptionsfaktors p63 tragen, die von Patienten mit ektokaktischer, ektodermaler Displasie und Lip-Palate-Syndrom (EEC) abgeleitet werden11,12. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die In-vitro-Differenzierung von Keratinozyten sowie die anschließende bioinformatische Analyse von RNA-seq. Andere Schritte des gesamten Verfahrens wie RNA-Extraktion, RNA-seq Probenvorbereitung und Bibliotheksbau sind gut dokumentiert und können leicht befolgt werden, insbesondere bei verwendung samt vielen häufig verwendeten kommerziellen Kits. Daher werden diese Schritte nur kurz im Protokoll beschrieben. Die Daten zeigen, dass diese Pipeline für die Untersuchung molekularer Ereignisse während der epidermalen Differenzierung in gesunden und kranken Keratinozyten geeignet ist.

<table><tbody><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G2929BA</td><td></td></tr><tr><td>Rinder-Hypophysenextrakt (BPE)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Teil des bulletKit</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>qPCR-Maschine</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Teil der bulletKit</td></tr><tr><td>Ethanolamin >= 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Hochempfindliche DNA-Chips</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Lonza</td><td></td><td>Teil des bulletKit</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Lonza</td><td></td><td>Teil des bulletKit</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA-Synthese</td><td>Bio rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Library Quant Kit</td><td>Roche</td><td>07960255001</td><td>Low Concentration Measure Kit</td></tr><tr><td>KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase</td><td>Roche</td><td>KK8540</td><td>RNAseq kit</td></tr><tr><td>KGM Gold Keratinocyte Growth Medium</td><td>BulletKit Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>deNovix</td><td>DS-11 FX (Modell)</td><td>Nanodrop und Qbit für DNA- und RNA-Messungen</td></tr><tr><td>NEXTflex DNA-Barcodes -24</td><td>Illumnia</td><td>NOVA-514103</td><td>6 bp lange Primer</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung der in-vitro-differenzierung menschlicher primärkeratinozyten durch rna-seq-analyse

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Humane primäre Keratinozyten werden oft als In-vitro-Modelle für Studien über epidermale Differenzierung und verwandte Krankheiten verwendet. Es wurden Methoden zur In-vitro-Differenzierung von Keratinozyten berichtet, die in zweidimensionalen (2D) untergetauchten Weisen unter Verwendung verschiedener Induktionsbedingungen kultiviert wurden. Hier wird ein Verfahren zur 2D-In-vitro-Keratinozytendifferenzierungsmethode durch Kontaktinhibition und anschließende molekulare Charakterisierung durch RNA-seq beschrieben. Kurz gesagt, Keratinozyten werden in definierten Keratinozyten Medium mit Wachstumsfaktoren ergänzt, bis sie vollständig konfluent sind angebaut. Die Differenzierung wird durch enge Kontakte zwischen den Keratinozyten induziert und durch den Ausschluss von Wachstumsfaktoren im Medium weiter stimuliert. Anhand von RNA-Seq-Analysen wird gezeigt, dass beide 1) differenzierten Keratinozyten während der Differenzierung unterschiedliche molekulare Signaturen aufweisen und 2) das dynamische Genexpressionsmuster bei der epidermalen Schichtung weitgehend Zellen ähnelt. Was den Vergleich mit der normalen Keratinozytendifferenzierung betrifft, so weisen Keratinozyten, die Mutationen des Transkriptionsfaktors p63 tragen, veränderte Morphologie und molekulare Signaturen auf, die mit ihren Differenzierungsfehlern übereinstimmen. Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur 2D-In-vitro-Keratinozytendifferenzierung und deren molekulare Charakterisierung, wobei der Schwerpunkt auf der bioinformatischen Analyse von RNA-seq-Daten liegt. Da die RNA-Extraktion und die RNA-Seq-Verfahren gut dokumentiert sind, steht dieses Protokoll nicht im Mittelpunkt. Das experimentelle Verfahren der In-vitro-Keratinozytendifferenzierung und bioinformatischen Analyse-Pipeline kann verwendet werden, um molekulare Ereignisse während der epidermalen Differenzierung in gesunden und kranken Keratinozyten zu untersuchen.

Normale Keratinozytendifferenzierung und RNA-Seq-Analyse In diesem Experiment wurden Keratinozytenlinien, die von fünf Individuen abgeleitet wurden, für Differenzierungs- und RNA-Seq-Analysen verwendet. Abbildung 1 fasst das experimentelle Verfahren der Differenzierung und der RNA-Seq-Analyseergebnisse zusammen. Abbildung 1Azeigt einen Überblick über die In-vitro-Differenzierungsverfahren normaler Keratinozyten und Zellmorphologieveränderunge...

Hier wird ein schrittweises Verfahren zur In-vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch Kontakthemmung dargestellt, gefolgt von einer Charakterisierung auf molekularer Ebene durch RNA-seq-Analyse.

Charakterisierung der In-Vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch RNA-Seq-Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren, das zwei Teile enthält. Erstens eine monolayer 2D-Keratinozytendifferenzierungsmethode in vitro durch Kontakthemmung. Zweitens, seine molekulare Charakterisierung durch RNA-seq.Die 2D-In-vitro-Differenzierungsmethode ist einfach und einfach durchzuführen. Es kann verwendet werden, um epidermale Differenzierung zu studieren, vor allem, wenn eine große Anzahl von Zellen notwendig sind. Zum Beispiel in der epigenomischen Analyse.Die detaillierte RNA-Seq-Analyse-Pipeline ist klar und transparent für Forscher mit grundlegenden Bioinformatik-Fähigkeiten und kann für jede Massen-RNA-Seq-Analyse verwendet werden. Beachten Sie bei der erstmaligen Durchführung des Differenzierungsprotokolls, dass die Aussaatdichte schwierig sein kann. Probieren Sie mehrere Sädichten aus, um herauszufinden, welche mit Ihrer Zelllinie am besten funktioniert.Beginnen Sie mit der Vorbereitung keratinozyten Wachstumsmedium oder KGM und 500 Milliliter jeweils Proliferationsmedium und Differenzierungsmedium nach Manuskriptrichtungen. Samen primäre Keratinozyten mit einer Dichte von 5 bis 20 000 Zellen pro Zentimeter quadratisch und fügen genug Proliferationsmedium, um die Zellen zu decken. Zwei Tage nach der Aussaat die Zellen mit dem Proliferationsmedium erfrischen.Überprüfen Sie die Zellen regelmäßig unter dem Mikroskop und erfrischen Medium jeden zweiten Tag. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, induzieren Sie eine Differenzierung, indem Sie das Medium in das Differenzierungsmedium ändern. Um Zellen für weitere RNA-Analysen zu sammeln, waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS und fügen Sie dann einen Lysepuffer hinzu.Sammeln Sie Zellen an den Differenzierungstagen Null, zwei, vier und sieben. Nach der RNA-Isolation werden doppelsträngige cDNA umgewandelt und RNA-Seq-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation vorbereitet. Nach der Sequenzierung werden die Sequenzlesungen heruntergeladen und dem menschlichen Genom zugeordnet.Nach dem Herunterladen und Installieren von R-Paketen, generieren Sie eine Kontotabelle aus der readpergene.out. und schreiben Sie eine Beispieldatendatei mit allen Dateinamen, dem Tag der Differenzierung und anderen relevanten Beispieldaten. Ein Beispiel finden Sie in den zusätzlichen Codierungsdateien.Verwenden Sie dann die Zähltabelle und die Beispieldaten, um ein Deseq2-Objekt zu generieren, das sowohl die zählbaren als auch die Beispieldaten enthält. Normalisieren Sie für die Normalisierung der Genexpression die Zähltabelle im deseq2-Objekt entweder mit Deseq2RLD- oder VST-Normalisierung. Während die RLD-Normalisierung bevorzugt wird, ist die VST-Normalisierung viel schneller.Verwenden Sie die dist-Funktion in R, um den Stichprobenabstand basierend auf den normalisierten Lesezählintensitäten zu zeichnen und dann hclust clustering basierend auf dem Stichprobenabstand durchzuführen. Zeichnen Sie als Nächstes die Heatmap mit der pheatmap-Funktion. Schließlich generieren Sie eine Prinzipkomponentenanalyse oder ein PCA-Diagramm der normalisierten Lesezählintensitäten mit der plotPCA-Funktion von deseq2.PCA dient als Werkzeug in der explorativen Datenanalyse und kann verwendet werden, um Entfernung und Verbindung zwischen verschiedenen Proben zu visualisieren. Führen Sie eine hochvariable Genexpressionsanalyse mit der rowVars-Funktion durch, die die Top 500 hochvariablen Gene extrahiert, indem sie die Varianz zwischen Proben aus verschiedenen Zeitpunkten ordnet. Diese Gene weisen die höchste Standardabweichung ihrer normalisierten Intensität über Tage der Differenzierung auf.Führen Sie k-means Clustering auf den hochvariablen Genen durch, um sie nach verschiedenen Expressionsmustern zu gruppieren. Visualisieren Sie die Gene in einer Heatmap mit dem pheatmap-Paket. Die in der Heatmap dargestellte Intensität ist die normalisierte Deseq2-Intensität mit subtrahierter Medianwert.Generieren Sie eine Liste der exprimierten Hintergrundgene, die alle Gene mit mehr als 10 Zählungen in einer einzigen Probe enthält, und erstellen Sie eine Liste mit Genen aus jedem Cluster. Führen Sie schließlich eine Gene Ontology-Analyse mit GOrilla durch. Verwenden Sie die Hintergrundgenliste als Hintergrundsatz und die Liste der hochvariablen Gene in Clustern als Zielsatz, und klicken Sie dann auf suchangereicherte GO-Begriffe.Alternativ können fortgeschrittenere R-Benutzer den PaketclusterProfiler verwenden, um die GO-Terminologieanreicherungsanalyse zu automatisieren. Keratinozytenlinien, die von fünf Individuen abgeleitet wurden, wurden zur Differenzierung in RNA-Seq-Analysen verwendet. Die Hauptkomponentenanalyse zeigte, dass Keratinozyten, die sich einer Differenzierung unterziehen, unterschiedliche allgemeine Genexpressionsprofile miteinander verbunden hatten.Hochvariable Gene wurden gruppiert, um die Dynamik und Muster der Genexpression während der Differenzierung zu visualisieren. Jeder Gencluster wurde durch die Keratinozytendifferenzierungs-Kennzeichengene repräsentiert und die Gene Ontology-Anmerkung zeigte einen deutlichen Unterschied in den Genfunktionen. Im zweiten Experiment wurden Zellmorphologie und Genexpressionsunterschiede zwischen Keratinozyten aus gesunden Kontrollen und Zelllinien von Patienten mit P63-Mutationen verglichen.Die Hauptkomponentenanalyse zeigte, dass die Kontrollzelllinien eindeutig einem Differenzierungsmuster folgten, aber das Genexpressionsmuster mutierter Zellen während der Differenzierung bleibt weitgehend dem von proliferierenden oder undifferenzierten Zellen ähnlich. In der Clustering-Analyse wurden Gene in Cluster eins in Kontrollzellen und teilweise downreguliert in Patientenzellen, die R204W- und R279H-Mutationen trugen, aber in Zellen, die R304W trugen, hoch verblieben. Diese Gene spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der Zellproliferation, wie die Gene Ontology-Analyse zeigt.Cluster zwei Gene wurden zuerst eingeführt und anschließend in Kontrollzellen nach unten reguliert. Diese Gene sind wahrscheinlich an der Keratinozytendifferenzierung beteiligt, da epidermale Differenzierungs- und Keratinisierungsfunktionen für diesen Cluster stark angereichert waren. Gene in Cluster drei wurden erst am Ende der Differenzierung in Kontrollzellen induziert, was darauf hindeutet, dass sie eine Rolle in der äußersten Schicht der Epidermis spielen können.Bei der Analyse von RNA-seq-Daten ist es wichtig, vorher zu wissen, was zu erwarten ist. Dies wird Ihnen sowohl bei der Interpretation der Qualitätskontrolle und des PCA-Plots als auch bei der Bewertung helfen, ob Ihre Ergebnisse sinnvoll sind. Unsere Methoden können sowohl in der epidermalen Biologie als auch in anderen biologischen Systemen zur Untersuchung der Gentranskription eingesetzt werden.

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Forschung

JoVE Journal

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Genetik

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