Validierung der Nanoporensequenzierung des gesamten Genoms anhand des Usutu-Virus als Beispiel
11. März 2020
Zuvor haben wir ein Protokoll für die Sequenzierung des Amplikon-basierten Ganzgenoms Usutu Virus (USUV) auf einer Nanoporensequenzierungsplattform validiert. Hier beschreiben wir die verwendeten Methoden genauer und bestimmen die Fehlerrate der Nanoporen-R10-Durchflusszelle.
Wir verwenden die virusgenetische Sequenzierung, um zu versuchen, zu verstehen, woher Viren kommen und wie sie sich ausbreiten. Und um diese Daten in Echtzeit nutzen zu können, z. B. während eines Ausbruchs, müssen wir genau verstehen, wie genau die Daten sind, die wir bereitstellen. Die Hauptvorteile dieser Techniken sind, dass es relativ billig ist, es ist schnell, und es ermöglicht Echtzeit-Basis-Codierung, die für die In-Field-Sequenzierung verwendet werden kann.
Diese Methode kann zur zeitnahen Generierung von Sequenzdaten eingesetzt werden, die beispielsweise zur Bestimmung des Ursprungs einer Vielzahl von Krankheitserregern verwendet werden können. Diese Technik kann für Erstbenutzer komplex sein und grundlegende Unix-Kenntnisse sind erforderlich. Speziell für die Installation der verschiedenen Softwarepakete.
Die Visualisierung dieser Methode hilft Benutzern, die Fehlerrate ihrer spezifischen Sequenzierungsprotokolle zu bestimmen. Und um Forschungsfragen zu beantworten. Der Sequenzlauf wird auf einem MinION gestartet, der mit dem MinIT verbunden ist.
Nachdem Sie eine Sequenz auf der Nanopore-Plattform vorgeformt haben, laden Sie die Datenlast in Porechop. Um Eine Kontamination zu vermeiden und die Genauigkeit zu erhöhen, verwenden Sie die Require Unterstrich zwei, unterstreichen Barcodes Flag und geben Sie den Befehl wie angegeben. Verwenden Sie cutadapt nach dem Entmultiplexing, um Primersequenzen und Sequenzen mit einer Länge von weniger als 75 Nukleotiden mit dem angegebenen Befehl zu entfernen.
Verwenden Sie Minimap2, um De-Multiplex-Sequenz-Lesevorgänge mit Minimap2 dem Bedienfeld mit unterschiedlichen Referenzstämmen zuzuordnen. Und verwenden Sie Samtools, um eine Konsenssequenz zu generieren. Für referenzbasierte Ausrichtungen ist es wichtig, eine Explosion vorzuforsen und mit der generierten Konsenssequenz zu suchen, um den nächstgelegenen Referenzstamm zu identifizieren.
Wiederholen Sie dann die referenzbasierte Ausrichtung mit dem nächstgelegenen Referenzstamm als Referenz. Um die erforderliche Leseabdeckung zu ermitteln, um das Fehlerprofil in der Nanopore-Sequenzierung zu kompensieren, wählen Sie die Sequenzzuordnung zu einem Amplicon aus, und verwenden Sie Minimap2, um die Nanopore-Lesevorgänge diesem Amplicon zuzuordnen. Verwenden Sie Samtools, um nur die Lesezuordnung zu Amplicon26 auszuwählen und die bam-Datei mit den angegebenen Befehlen in fastq zu konvertieren.
Wählen Sie zufällig Teilmengen von z. B. 200 Sequenzlesevorgängen tausendmal aus. Alle zufällig ausgewählten Sequenzlesevorgänge werden an Amplicon26 ausgerichtet. Verwenden Sie KMA, um die Sequenzlesevorgänge zu zuordnen und sofort eine Konsenssequenz unter Verwendung der optimierten Einstellungen für die Nanopore-Sequenzierung zu generieren, wie durch die BC-Nanoflagge angegeben.
Um die generierten Konsenssequenzen zu überprüfen, verwenden Sie die angegebenen Befehle. Um die Fehlerrate in den Statistiken dot txt unter der Überschrift Fehlerrate Inkongruenzen Basen zugeordnet anzuzeigen, verwenden Sie den Befehl wie angegeben. Um die Anzahl der Indels anzuzeigen, wird unter der Überschrift Indels pro Zyklus der Befehl wie angegeben angezeigt.
Mit der neueren Durchflusszelle in Kombination mit dem Basisfarb-Flipflop führt eine 40-fache Leseabdeckung zu identischen Ergebnissen im Vergleich zur Illumina-Sequenzierung. Eine Leseabdeckung von 30 Mal ergibt eine Fehlerrate von 0,02%, was einem Fehler in jedem sequenzierten 585. 000 Nukleotiden entspricht. Während eine Leseabdeckung von 20 Mal zu einem Fehler in jedem 63 führt, sequenzierten 529 Nukleotide.
Eine Leseabdeckung von 10 Mal führt zu einem Fehler in jedem 3, 312 Nukleotide sequenziert. Das bedeutet, dass über 3 Nukleotide pro vier Usutu-Virusgenome als falsch bezeichnet werden. Bei einer Leseberichterstattung über 30 Mal werden keine Indels beobachtet.
Eine Leseabdeckung von 20 Mal führt zu den Erkennungen einer Indelposition, während eine Leseabdeckung von 10-mal zu Indels in 29 Positionen führt. Das Wichtigste, was Man sich merken sollte, ist, dass Updates in der Software, obwohl nicht immer offensichtlich, häufig auftreten und die Ergebnisse beeinflussen können. Es gibt mehrere Optionen von Software zu verwenden.
Wir haben die am häufigsten verwendeten Programme demonstriert. Aber verschiedene Software und verschiedene Versionen dieser Software können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Wir haben Ihnen ein Beispiel gezeigt, wie wir die Qualität der von uns generierten Sequenzdaten überprüfen.
Und das ist entscheidend für eine zuverlässige Unterstützung von Ausbrüchen.
Übersicht
Diese Studie beschreibt ein validiertes Protokoll für die ampliconbasierte Ganzgenomsequenzierung des Usutu-Virus (USUV) unter Verwendung einer Nanoporen-Sequenzierplattform. Die Methoden werden detailliert beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf der Bestimmung der mit der Nanoporen-Flowcell R10 verbundenen Fehlerrate liegt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Virologie
- Genomik
- Sequenzierungstechnologie
Hintergrund
- Verständnis von Virusursprüngen und -ausbreitung durch genetische Sequenzierung.
- Bedeutung der Datengenauigkeit während Ausbrüchen.
- Vorteile der Nanoporensequenzierung: Kosteneffizienz und Geschwindigkeit.
- Komplexität für Erstanwender, die über grundlegende Unix-Kenntnisse verfügen müssen.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Methodik für die USUV-Sequenzierung bereitstellen.
- Die Fehlerquoten der Nanoporensequenzierung bewerten.
- Die Genauigkeit von Sequenzierungsprotokollen verbessern.
Verwendete Methoden
- Verwendung von MinION und MinIT für die Sequenzierung.
- Datenverarbeitung mit Porechop und cutadapt zur Entfernung von Primern.
- Zuordnung der Sequenzen mit Minimap2 und Erstellung konsensbasierter Sequenzen mit Samtools.
- Bewertung der Fehlerquoten und Positionen von Indels basierend auf variierenden Abdeckungstiefen der Reads.
Hauptergebnisse
- Eine Abdeckung der Sequenzierung von 30-facher Tiefe führt zu einer Fehlerquote von 0,02 %.
- Höhere Abdeckung (über 30-fach) zeigt keine Insertionen/Deletionen (Indels).
- Niedrigere Abdeckung führt zu vermehrten Fehlern und Indels.
- Software-Updates können die Sequenzierungsergebnisse erheblich beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- Die Nanoporensequenzierung ist eine geeignete Methode zur Echtzeitanalyse im Ausbruchsfall.
- Das Verständnis der Fehlerquoten ist entscheidend für die zuverlässige Datenerzeugung.
- Unterschiedliche Softwareversionen können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die genaue Sequenzierung viraler Genome ist entscheidend für die Echtzeit-Reaktion auf Ausbrüche und die genomische Epidemiologie. Das Verständnis plattformspezifischer Fehlerquoten ermöglicht die zuverlässige Erzeugung von Daten für gesundheitspolitische Entscheidungen. Die Validierung der Nanoporensequenzierung gegenüber etablierten Plattformen gewährleistet Vertrauen in die Verfolgung von Krankheitserregern und die Analyse von Übertragungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Virusursprüngen und Übertragungswegen durch Genomsequenzierung mit hoher Genauigkeit.
- Operationaler Wert: Unterstützt die schnelle Überprüfung von Hypothesen während Ausbrüchen mittels tragbarer, echtzeitfähiger Sequenzierungstechnologien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet standardisierte Workflows für die ampliconbasierte Virusgenomsequenzierung mit quantifizierbarer Fehlerquotenbewertung.
- Operationaler Wert: Erleichtert die Reproduzierbarkeit von Assays durch definierte Schwellenwerte für die Read-Abdeckung und die Optimierung von Softwareparametern.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt Konsenssequenzen, die für funktionelle Folgestudien und antigenetische Charakterisierungen geeignet sind.
- Operationaler Wert: Ermöglicht skalierbare Sequenzierungs-Pipelines, die an neu auftretende virale Bedrohungen mit minimaler Infrastruktur angepasst werden können.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode lässt sich in Workflows zur Virusentdeckung von der initialen Detektion bis hin zur genomanalytischen Charakterisierung integrieren und unterstützt die Identifizierung von Leitstrukturen in der antiviralen Wirkstoffentwicklung durch eine genaue Stammverfolgung.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die präzise Identifizierung von Virusstämmen und das Verfolgen von Mutationen zur mechanistischen Absicherung therapeutischer Zielstrukturen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Genomdaten, die zur Bewertung der Wirkung antiviraler Substanzen auf die virale Evolution geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt Fehlerquoten-Metriken und Indel-Häufigkeiten, die zur Festlegung von Datenqualitätsschwellen für Go/No-Go-Entscheidungen herangezogen werden.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Kontinuität von der Ausbruchserkennung bis zur präklinischen Validierung, indem sie nachvollziehbare Stammdaten von Viren bereitstellt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine portable Sequenzierungskapazität, die auf verschiedene Virusfamilien und geografische Überwachungsnetzwerke anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen in Studien zur viralen Evolution durch fehlerkorrigierte Konsenssequenzierung.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die Standardisierung zwischen Laboren mittels definierter Abdeckungstiefe (30x) und Softwareprotokollen für konsistente Genauigkeit.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der antiviralen Wirkstoffentwicklung, indem zuverlässige genomische Daten zu zirkulierenden Stämmen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf genetisch validierter viraler Epidemiologie.
Durchführungsüberlegungen
- Benötigt grundlegende Unix-Kenntnisse für die Softwareinstallation und die Ausführung von Befehlen in der Kommandozeile.
- Hängt von der MinION/MinIT-Hardware und dem Zugang zu Referenzstämme-Panels für die Alignierung ab.
- Erfordert einen bioinformatischen Support über mehrere Teams hinweg zur Standardisierung der Arbeitsabläufe und zur Kontrolle der Softwareversionen.
- Muss häufige Software-Updates berücksichtigen, die Fehlerprofile und Konsensergebnisse verändern können.
- Die Wirksamkeit setzt eine ausreichende Mindestabdeckung der Reads (30x) voraus, um Insertionen/Deletionen zu unterdrücken und eine mit Illumina vergleichbare Genauigkeit zu erreichen.
